王春旭,王彥文,黃輝,唐勇,鄧潔妤,賀漓漓

(廣西桂林市疾病預防控制中心檢驗科,廣西桂林 541001)

沙門菌作為導致食源性疾病的重要致病菌之一,廣泛分布于自然界,因易污染食品、水等外環(huán)境以及存在于一些帶菌的禽畜類動物中,通過食物鏈傳遞給人類,危害公共衛(wèi)生健康[1-2]。我國每年約有上億人因感染沙門菌而患病,占食源性疾病致病菌首位[3-5]。桂林市歷年食源性風險監(jiān)測中也以沙門菌檢出為最多[6-7]。為了進一步揭示桂林市沙門氏菌的血清型分布及其耐藥性和基因型,桂林市疾病預防控制中心實驗室對2019年檢出的32株沙門氏菌和2020年檢出的37株沙門氏菌進行了血清型的鑒定和菌株的耐藥性分析,同時采用脈沖場凝膠電泳法(PFGE)對其進行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1 材料所分析的沙門菌菌株來自2019年收集的32株(其中21株為桂林市食源性致病菌監(jiān)測的分離株,11株為同年腹瀉患者檢出菌株)和2020年收集的37株(其中21株為桂林市食源性致病菌監(jiān)測的分離株,16株為同年腹瀉患者檢出菌株);所有菌株均經(jīng)由廣西壯族自治區(qū)疾病預防控制中心微生物實驗室進行復核和血清學分型鑒定。血清型的質(zhì)控菌株為鼠傷寒沙門菌ATCC14028(中國普通微生物菌種保藏管理中心提供),藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922(中國普通微生物菌種保藏管理中心提供),脈沖場凝膠電泳使用的分子量標準菌株為沙門菌H9812(廣西壯族自治區(qū)疾病預防控制中心提供)。

1.2 儀器及試劑全自動細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司);全自動藥敏試驗菌液接種判讀儀(Thermo賽默飛世爾);CHEF Mapper XA脈沖場電泳儀(美國Bio-Rad公司);Gel Doc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。沙門菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉CHROMagar,生產(chǎn)批號P002060);誘導培養(yǎng)基(法國科瑪嘉CHROMagar,生產(chǎn)批號20201201);沙門菌診斷血清(丹麥SSI公司,生產(chǎn)批號20200701);革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板(中國上海星佰生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)批號102012);蛋白酶K(德國Merck公司,生產(chǎn)批號VL558866);GelRed染液(美國Biotium公司,生產(chǎn)批號19G0326);Seakem Gold瓊脂糖(美國Cambrex公司,生產(chǎn)批號0000990000);Xba I限制性內(nèi)切酶(NEW England公司,生產(chǎn)批號AL12042A)。

1.3 方法

1.3.1 食源性疾病病例信息與相關(guān)樣本采集對于食源性疾病病例個案信息按照《2019年國家食品污染物和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》[8]收集,同時采集患者的新鮮糞便或肛拭子標本進行沙門菌檢驗,對陽性的沙門菌分離株再進行PFGE分子分型分析和藥敏試驗。

1.3.2 食品樣品的采集與檢驗食品樣品參照 《國家食品安全風險監(jiān)測工作手冊》進行采集,并參照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門菌檢驗》[9]鑒定沙門菌,同時依據(jù)White-Kauffmann-LeMinor抗原表[10]判定其血清型。

1.3.3 藥物敏感試驗藥敏試驗參照標準為2020年的CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)標準[11],折點判斷(S：敏感;I：中介;R：耐藥)。多重耐藥(multi drug resistance,MDR)定義：至少同時耐3種和(或)以上的不同類型抗生素菌株。

1.3.4 沙門菌分子分型根據(jù)國家食源性疾病溯源網(wǎng)絡(TraNet China)沙門菌PFGE標準化分型方法進行沙門菌分子分型,具體方法為：待測沙門菌先經(jīng)瓊脂糖包埋,然后進行蛋白酶K裂解,最后用限制性內(nèi)切酶Xba I(50U)進行酶切,從而得到限制性DNA片段,進行CHEF-mapper脈沖場凝膠電泳(以沙門菌標準株H9812為分子量標記)。最后的結(jié)果標示為經(jīng)GelRed染色后成像的圖譜導入Bionumerics 6.6軟件進行聚類分析后的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 桂林市2019—2020年沙門菌血清型分布2019年的32株沙門菌和2020年的37株沙門菌,分別為B、C、D、E 4個群,共20個血清型,主要為鼠傷寒沙門菌,占菌株總數(shù)的27.54%(19/69),其次是腸炎沙門菌占14.49%(10/69),科瓦利斯沙門菌占13.04%(9/69),肯塔基沙門菌占5.80%(4/69),其余各型菌株數(shù)量較少,分型結(jié)果及比例見表1。

表1 2019—2020年桂林市食源性沙門菌血清型分布[n(%)]

2.2 沙門菌耐藥情況

2.2.1 2019—2020年沙門菌耐藥情況如表2所示,受試的12種抗生素中,69株菌株對磺胺異噁唑、四環(huán)素、氨芐西林、萘啶酸、氯霉素、復方新諾明、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、頭孢西丁、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為82.61%、75.36%、60.87%、52.17%、42.03%、28.99%、23.19%、14.49%、13.04%、5.80%、4.35%,對美羅培南100.00%敏感。

表2 2019—2020年沙門菌12種抗生素藥敏結(jié)果[株(%)]

2.2.2 2019—2020年沙門菌耐藥譜分布如表3所示,2019年的32株菌共產(chǎn)生17個耐藥譜。其中9株鼠傷寒沙門菌對TET 100%耐藥、對AMP 88.89%(8/9)耐藥、對Sul 66.67%(6/9)耐藥,AMP-TET-NAL和AMP-Sul-TET-AXO為鼠傷寒沙門菌的優(yōu)勢耐藥譜,分別有3株菌存在同型耐藥情況;腸炎沙門菌優(yōu)勢耐藥譜為AMP-Sul-NAL,5株菌株100.00%對此耐藥。3株德爾卑沙門菌優(yōu)勢耐藥譜為TET-NAL;3株科瓦利斯沙門菌對Sul-TET 100.00%耐藥。

表3 2019年32株不同血清型的沙門菌耐藥譜分布

如表4所示,2020年的37株菌共產(chǎn)生24個耐藥譜。其中10株鼠傷寒沙門菌對Sul 100.00%耐藥、對TET 90.00%(9/10)耐藥、對AMP 80.00%(8/10)耐藥,AMP-Sul-TET為鼠傷寒沙門菌的優(yōu)勢耐藥譜,有3株菌存在同型耐藥情況;科瓦利斯沙門菌優(yōu)勢耐藥譜為Sul-TET,有5株菌株對此耐藥;5株腸炎沙門菌100%對AMP和NAL耐藥;3株阿貢納沙門菌全部對Sul耐藥。

表4 2020年37株不同血清型的沙門菌耐藥譜分布

2.3 PFGE分析結(jié)果

2.3.1 2019年32株沙門菌PFGE聚類分析對32株沙門菌酶切并進行脈沖場凝膠電泳后,DNA片段得到較好地分離,可見大小不一的電泳條帶,然后進行聚類分析,根據(jù)電泳產(chǎn)生條帶的位置和數(shù)量的不同,依據(jù)國家食源性疾病溯源網(wǎng)絡手冊,獲得電泳圖譜,通過Bionumerics 6.6軟件采用不加權(quán)算數(shù)平均組對方法(UPG-MA),自動將這些PFGE帶型分為多個大小不一的聚類群,獲得不同菌株間的遺傳克隆關(guān)系。菌株間相似度在49.40%～100.00%,呈現(xiàn)多樣性(圖1)。

圖1 2019年32株沙門菌PFGE聚類分析圖

2.3.2 分別對2019年4種菌型進行PFGE聚類分析聚類分析結(jié)果所示,9株鼠傷寒沙門菌共有6個不同的PFGE帶型(圖2),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可分為4個大小不一的聚類群;5株腸炎沙門菌共有4個不同的 PFGE帶型(圖3),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可分為2個大小不一的聚類群;3株德爾卑沙門菌共有3個不同的PFGE帶型(圖4),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可分為2個大小不一的聚類群;3株科瓦利斯沙門菌共有3個不同的PFGE帶型(圖5),按照85%的相似度,這些PFGE帶型可以分為2個大小不一的聚類群。

圖2 2019年9株鼠傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖

圖3 2019年5株腸炎沙門菌PFGE聚類分析圖

圖4 2019年3株德爾卑沙門菌PFGE聚類分析圖

圖5 2019年3株科瓦利斯沙門菌PFGE聚類分析圖

2.3.3 2020年34株沙門菌PFGE聚類分析對2020年的37株沙門菌酶切并進行脈沖場凝膠電泳后,有3株菌發(fā)生降解,其余34株沙門菌的DNA片段得到較好地分離,可見大小不一的電泳條帶,然后對34株沙門菌進行聚類分析,根據(jù)電泳產(chǎn)生條帶的位置和數(shù)量的不同,這些PFGE帶型可以分為多個大小不一的聚類群,菌株間相似度在49.60%～100.00%,呈現(xiàn)多樣性(圖6)。

圖6 2020年34株沙門菌PFGE聚類分析圖

2.3.4 分別對2020年3種菌型進行PFGE聚類分析對10株鼠傷寒沙門菌進行聚類分析,共分為10個不同的PFGE帶型(圖7),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可以分為5個大小不一的聚類群;對6株科瓦利斯沙門菌進行聚類分析,共分為3個不同的PFGE帶型(圖8),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可以分為2個大小不一的聚類群;對5株腸炎沙門菌進行聚類分析,共分為4個不同PFGE帶型(圖9),按照90%的相似度,這些PFGE帶型又可以分為2個大小不一的聚類群。

圖7 2020年10株鼠傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖

圖8 2020年6株科瓦利斯沙門菌PFGE聚類分析圖

圖9 2020年5株腸炎沙門菌PFGE聚類分析圖

3 討 論

沙門菌是導致公共衛(wèi)生安全事件頻發(fā),威脅人畜健康的一種主要的食源性致病菌,不同血清型沙門菌的致病性存在差異。本研究顯示,桂林市2019年、2020年食源性風險監(jiān)測和食物中毒突發(fā)公共衛(wèi)生事件中檢出的沙門菌優(yōu)勢血清型主要是鼠傷寒沙門菌,占27.54%,其次為腸炎沙門菌,占14.49%。據(jù)文獻報道[2,10,12,13],在我國多地引起食源性食物中毒的最常見沙門菌血清型是鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等,與本研究結(jié)論一致。同時,桂林市分離檢出的沙門菌分屬于B、C、D、E 4個群20個血清型,說明桂林市食品中及腹瀉樣本沙門菌呈現(xiàn)多態(tài)性,但存在著優(yōu)勢菌。

研究顯示,沙門菌的耐藥性日益嚴重且與臨床疾病治療關(guān)系密切,同時涉及外環(huán)境中如養(yǎng)殖業(yè)禽畜動物抗生素耐藥,引起食源污染影響到人源的問題,因此受到醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)和農(nóng)業(yè)部門等的重視[14]。本研究發(fā)現(xiàn)桂林市沙門菌同一血清型的菌種其耐藥譜有很大相似性,如本研究發(fā)現(xiàn)2019年桂林市9株鼠傷寒沙門菌對四環(huán)素100.00%耐藥,對氨芐西林88.89%耐藥,對磺胺異噁唑66.67%耐藥;2020年桂林市10株鼠傷寒沙門菌對磺胺異噁唑100.00%耐藥、對四環(huán)素90.00%耐藥、對氨芐西林80.00%耐藥。這一耐藥情況與上海市鼠傷寒沙門菌82.30%對四環(huán)素耐藥率[15]、安徽鼠傷寒沙門菌60.50%對四環(huán)素耐藥率[16]情況類似,但桂林市鼠傷寒沙門菌四環(huán)素耐藥率已達90.00%～100.00%,值得相關(guān)醫(yī)療機構(gòu)警惕。國內(nèi)各地報道鼠傷寒沙門菌耐藥最高的抗生素種類不同,原因有待進一步探討。同時實驗研究發(fā)現(xiàn)腸炎沙門菌和德爾卑沙門菌、科瓦利斯沙門菌存在同型優(yōu)勢耐藥譜。

PFGE通過對細菌分子分型開展同源溯源分析,是目前國內(nèi)外鑒別菌株以及溯源的金標準[17-18],也是實踐中應用較為廣泛的溯源分析技術(shù)。經(jīng)過對2019—2020年桂林市69株沙門菌進行PFGE分子分型分析,69株沙門菌有多種帶型,基因型呈多樣性,存在優(yōu)勢的流行基因型。此外,帶型無明顯的地域、時間、聚集特征,提示沙門菌在桂林市食源性風險監(jiān)測項目以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件呈散發(fā)存在。但由于分離菌株數(shù)量較少,且缺乏年份時序性研究,尚需不斷建立并完善菌株及分子分型數(shù)據(jù)庫,為預警以及干預食源性疾病暴發(fā)做好技術(shù)和數(shù)據(jù)儲備。

本研究建立了2019—2020年桂林市食源性風險監(jiān)測項目以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件中分離檢出的沙門菌的分子分型數(shù)據(jù)庫,本數(shù)據(jù)庫為今后及時發(fā)現(xiàn)和食源性疾病暴發(fā)的處置奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)2019—2020年桂林市沙門菌存在鼠傷寒和腸炎優(yōu)勢菌,菌株存在耐藥現(xiàn)象。鼠傷寒沙門菌耐藥較為嚴重,結(jié)果提示在本地區(qū)食源性致病菌均可能存在耐藥基因或耐藥菌株擴散現(xiàn)象。收集的沙門菌數(shù)據(jù)資源充實了本市一級區(qū)域性食源性致病菌數(shù)據(jù)資源庫,為今后開展疾病和食源性疾病的監(jiān)測、暴發(fā)溯源、控制預警以及建立和應用大數(shù)據(jù)提供科學的依據(jù)。