陳利紅，周俊飛，梁晉剛，李甜甜，王顥潛，方治偉，陳 紅,*，彭 海,*

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176）

玉米（Zea mays）是世界三大糧食作物之一，也是重要的飼料作物，是世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重中之重。玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展對(duì)保障國(guó)家糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品有效供給具有重要意義[1]。目前玉米已成為我國(guó)面積最大、總產(chǎn)最多的作物，但是玉米生長(zhǎng)過(guò)程中極易受到外界環(huán)境及各種病蟲(chóng)害的干擾，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量[3]；而傳統(tǒng)的雜交育種技術(shù)因耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、需要大量人力物力，已經(jīng)難以滿足玉米產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展過(guò)程中對(duì)優(yōu)良品種的迫切需求[2]。因此人們開(kāi)始利用基因工程手段將外源基因?qū)胗衩字?，以提高玉米?duì)環(huán)境與病蟲(chóng)害的耐受性。然而轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生產(chǎn)中產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效應(yīng)的同時(shí)，其安全問(wèn)題也引起了人們的廣泛關(guān)注[3-4]。為了充分保障消費(fèi)者的知情權(quán)，各個(gè)國(guó)家與組織機(jī)構(gòu)要求企業(yè)對(duì)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)[5]。目前國(guó)際上對(duì)于轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的管理主要分為四大類(lèi)：一是如美國(guó)、加拿大、阿根廷等國(guó)家采取自愿標(biāo)識(shí)；二是如歐盟[6]、巴西等國(guó)家實(shí)行定量全面強(qiáng)制標(biāo)識(shí)[7]，即對(duì)所有產(chǎn)品只要其轉(zhuǎn)基因成分含量超過(guò)一定的閾值就必須標(biāo)識(shí)；三是如日本采取定量部分強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)，即對(duì)特定類(lèi)別產(chǎn)品實(shí)行超過(guò)規(guī)定的閾值就必須標(biāo)識(shí)，四是如我國(guó)是采取定性按目錄強(qiáng)制標(biāo)識(shí)，即凡是列入目錄的產(chǎn)品，只要含有轉(zhuǎn)基因成分就必須標(biāo)識(shí)。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品“標(biāo)識(shí)閾值”的實(shí)施尤其需要對(duì)樣品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量檢測(cè)[8]。在轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)過(guò)程中，需要對(duì)樣品基因組DNA含量或拷貝數(shù)目、轉(zhuǎn)入外源基因的拷貝數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而獲得樣品的轉(zhuǎn)基因含量，這個(gè)過(guò)程需要對(duì)植物的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因與轉(zhuǎn)入的外源基因進(jìn)行有效擴(kuò)增。因此內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?qū)悠忿D(zhuǎn)基因成分的定性定量檢測(cè)顯得尤為重要，其擴(kuò)增區(qū)域、擴(kuò)增效果將直接影響轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的準(zhǔn)確性[9]。對(duì)于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因是指植物中具有種內(nèi)非特異性、種間特異性與基因組上拷貝數(shù)低且拷貝數(shù)恒定的一類(lèi)基因，這類(lèi)基因在不同品種（品系）之間異質(zhì)性低[9]。轉(zhuǎn)基因植物及其相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品的成分來(lái)源、實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性與穩(wěn)定性、混合樣品中的轉(zhuǎn)基因含量的計(jì)算均需通過(guò)對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)[10-12]，因此內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其擴(kuò)增區(qū)域的篩選對(duì)于獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。

目前，已有多個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因用于轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）檢測(cè)系統(tǒng)中，如水稻（Oryza sativa）的蔗糖磷酸合成酶基因（sucrose phosphate synthase，SPS）[13]、根部表達(dá)基因（rice root-specific gene，gos9）[14]、磷脂酶D基因（phospholipase D，PLD）[8]、磷酸果糖激酶基因（ppi phosphofructokinase，ppi-PPF）[9]，玉米的轉(zhuǎn)化酶基因（invertase，IVR）[15]、醇溶蛋白基因（zein）[16]、玉米淀粉合成酶II（Zea maysstarch synthase isoform zSTSII-2，zSSIIb）[17]、乙醇脫氫酶基因（alcohol dehydrogenase，ADH1）[15]、高遷移率族蛋白基因（high mobility group protein，HMG）[18]，大豆（Glycine max）的凝集素基因（lectin）[19]、熱休克蛋白基因（heat shock proteins，HSP）[20]，小麥（Triticum aestivum）的乙酰輔酶A羧化酶基因（acetyl-CoA carboxylase，ACC1）[21]，還有其他物種的泛素結(jié)合酶基因（ubiquitin-protein ligase，E3-UBI）[22]等。近年來(lái)全球范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因生物（genetically modified organisms，GMO）和未授權(quán)的GMO數(shù)量日益增多，特征也越來(lái)越多樣化，給現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)real-time PCR檢測(cè)技術(shù)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。如傳統(tǒng)的real-time PCR技術(shù)一次只能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)一個(gè)靶標(biāo)，需要多次擴(kuò)增和檢測(cè)才能滿足多靶標(biāo)轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的需求，而新興的二代測(cè)序技術(shù)彌補(bǔ)了該傳統(tǒng)技術(shù)的缺陷[22-27]，顯著提高了檢測(cè)效率。目前尚鮮見(jiàn)基于二代測(cè)序技術(shù)的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子篩選、評(píng)估方面的研究與報(bào)道。本研究基于現(xiàn)有文獻(xiàn)中報(bào)道的玉米、水稻、大豆等植物中的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其定義，從玉米基因組中選擇7 個(gè)候選內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，共設(shè)計(jì)13 個(gè)擴(kuò)增區(qū)域（擴(kuò)增子），利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增子進(jìn)行種內(nèi)一致性、種間特異性等系統(tǒng)性評(píng)估，進(jìn)而為后續(xù)利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的定量檢測(cè)提供合適的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的208 個(gè)常規(guī)玉米品種或品系（表1）由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心提供。其他非玉米物種水稻（5 個(gè)樣品）、棉花（Gossypiumspp.，3 個(gè)樣品）、大豆（4 個(gè)樣品）、花生（Arachis hypogaea，1 個(gè)樣品）、西瓜（Citrullus lanatus，2 個(gè)樣品）、黃瓜（Cucumis sativusL.，2 個(gè)樣品）、甜瓜（Cucumis melo，2 個(gè)樣品）、番茄（Lycopersicon esculentum，2 個(gè)樣品）、辣椒（Capsicum annuumL.，2 個(gè)樣品）、白菜（Brassica pekinensis，2 個(gè)樣品）的DNA為本實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 常規(guī)玉米品種（品系）信息Table 1 Information about common maize varieties (lines) tested in this study

多重?cái)U(kuò)增建庫(kù)試劑盒（GP000505）石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司；植物D N A 提取試劑盒（DP320）、λDNA/HindIII Marker、DNA Marker I、D2000 DNA Marker 北京Tiangen生化科技有限公司；Qubit dsDNA檢測(cè)試劑盒（Q33230）美國(guó)Thermo Fisher公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)、Qubit 4.0核酸定量?jī)x、Qubit 2.0熒光計(jì) 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與定量

待檢樣品葉片用液氮充分研磨后，用天根植物DNA提取試劑盒（DP320）按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA提取。用Qubit 4.0核酸定量?jī)x檢測(cè)DNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的選擇與引物設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)中或者國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中報(bào)道的常用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定義及玉米基因組序列，本研究共選擇7 個(gè)候選基因用于后續(xù)研究。引物設(shè)計(jì)與合成由博瑞迪生物技術(shù)有限公司完成。引物信息見(jiàn)表2。

表2 研究所用的引物及其相關(guān)信息Table 2 Information about primers used in this study

1.3.3 擴(kuò)增子文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

按照石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司的建庫(kù)試劑盒GenoPlexs Multiplex-PCR Library Prep Kit for MGI說(shuō)明書(shū)（GP000505）進(jìn)行建庫(kù)，具體過(guò)程如下：取50～200 ng基因組DNA（穩(wěn)定性和檢出豐度比較分析所用的樣品DNA起始量均是200 ng/樣品，其他的樣品若DNA量足夠的話，也盡量使每個(gè)樣品的起始DNA量為200 ng），用設(shè)計(jì)的多重引物對(duì)樣品中目標(biāo)序列進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為30 μL，多重?cái)U(kuò)增引物（每條引物0.2 μmol/L）：4 μL，基因組DNA：50～200 ng，GenoPlexs 3×T Master Mix：10 μL，用ddH2O補(bǔ)足到30 μL，然后按照表3進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其擴(kuò)增產(chǎn)物用磁珠法進(jìn)行目標(biāo)片段篩選后再進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，第2輪擴(kuò)增時(shí)為每個(gè)樣品加上不同的測(cè)序條形碼（Barcode）。擴(kuò)增體系為30 μL，GenoPlexs 3xT Enzyme mix：10 μL，P5 Barcode：2 μL，P7 Barcode：2 μL，ddH2O：16 μL，按照表4進(jìn)行擴(kuò)增。最后純化獲得擴(kuò)增子建庫(kù)文庫(kù)，該建庫(kù)過(guò)程經(jīng)過(guò)適當(dāng)調(diào)整以匹配Illumina平臺(tái)，文庫(kù)經(jīng)質(zhì)檢合格后進(jìn)行測(cè)序。文庫(kù)質(zhì)檢首先用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用Qubit對(duì)文庫(kù)濃度進(jìn)行檢測(cè)，符合文庫(kù)片段大小及文庫(kù)質(zhì)量濃度在10 ng/μL以上由南京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行PE150測(cè)序（NovaSeq 6000）。

表3 文庫(kù)構(gòu)建的第1輪PCR擴(kuò)增條件Table 3 Conditions of first round of PCR amplification for library construction

表4 文庫(kù)構(gòu)建的第2輪PCR擴(kuò)增條件Table 4 Conditions of second round of PCR amplification for library construction

1.3.4 普通PCR驗(yàn)證

對(duì)zSSIIb-1擴(kuò)增子檢出reads數(shù)目高低不一的8 個(gè)樣品（M000265、M019298、M019325、M019314、M000036、M016228、M019142和M019143）進(jìn)行普通P C R 驗(yàn)證，P C R 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系20 μL，zSSIIb-1上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、基因組DNA 20 ng，2×Prime Star GC Buffer 10 μL、2.5 mmol/L的dNTP mix 2 μL、TaKaRa Prime StarTaq酶0.2 μL用ddH2O補(bǔ)足到20 μL，然后按照表5進(jìn)行PCR擴(kuò)增。大豆lectin基因是以大豆4 個(gè)樣品文庫(kù)構(gòu)建的第1輪PCR產(chǎn)物為模板（0.5 μL），利用文獻(xiàn)[19]報(bào)道的大豆lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的引物（F：TGGGACAAAGAAACCGGTAG，R：GTCAAACTCAACAGCGACGA，擴(kuò)增長(zhǎng)度201 bp）及PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增與電泳檢測(cè)。其中，zSSIIb-1擴(kuò)增子與lectin內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的PCR驗(yàn)證均以H2O作為空白對(duì)照。

表5 zSSIIb-1基因普通定性PCR條件Table 5 Conditions for qualitative PCR amplification of the zSSIIb-1 gene

1.3.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

下機(jī)的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)步驟分析進(jìn)而獲得歸一化的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子測(cè)序序列數(shù)目，1）根據(jù)Barcode序列和各擴(kuò)增子引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，Illumina接頭序列使用Cutadapt v1.8.1去除；2）使用FLASH（V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接，得到拼接序列，其中拼接成功與未拼接成功的序列統(tǒng)稱(chēng)為原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）；3）將這些原始的Raw Tags，利用FASTXtoolkit v0.014（http://hannonlab.cshi.edu/fastx_toolkit）去除低質(zhì)量的序列（序列質(zhì)量Q20值＜20），得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）；4）將Clean Tags比對(duì)到玉米參考基因組序列上，并確定每個(gè)擴(kuò)增子的原始reads數(shù)目；5）最后把所有樣品按照測(cè)序1000000 條reads，每個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因200 bp長(zhǎng)度進(jìn)行歸一化處理，進(jìn)而獲得每個(gè)樣品中每個(gè)擴(kuò)增子的測(cè)序reads數(shù)目，即為每個(gè)擴(kuò)增子的檢出豐度。單個(gè)樣品中每個(gè)擴(kuò)增子若有一條測(cè)序read檢出，則認(rèn)為該擴(kuò)增子在此樣品中被檢出，每個(gè)擴(kuò)增子的檢出率為該擴(kuò)增子檢出樣品的數(shù)目占所有樣品中的百分比。

1.3.6 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的種內(nèi)一致性、種間特異性、保守性、穩(wěn)定性與動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍分析

分別用208 個(gè)常規(guī)玉米樣品與10 個(gè)非玉米物種進(jìn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的種內(nèi)一致性與種間特異性評(píng)估。種內(nèi)保守性是通過(guò)分析這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子在所測(cè)試的208 個(gè)常規(guī)玉米樣品中的拷貝數(shù)目及單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）數(shù)目進(jìn)行評(píng)估。然后用建庫(kù)DNA起始量相等的25 個(gè)常規(guī)玉米測(cè)試所選內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的穩(wěn)定性，利用geNorm[28]和NormFinder[29]分析軟件并參考相關(guān)文獻(xiàn)[30-31]對(duì)這些擴(kuò)增子進(jìn)行評(píng)估，其中，最優(yōu)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子數(shù)量采用geNorm軟件對(duì)配對(duì)擴(kuò)增子變異系數(shù)進(jìn)行分析完成。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍分析按照以下步驟進(jìn)行，將5 個(gè)常規(guī)玉米品種（未知1、四單154、承單15、鐵D9125和未知2）的DNA（每個(gè)樣品起始DNA量為200 ng），依次稀釋1、50、100、500 倍和1000 倍進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序分析以獲得每個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因各擴(kuò)增子的檢出豐度，進(jìn)而確定所篩選的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因各擴(kuò)增子的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 所選內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的引物設(shè)計(jì)與拷貝數(shù)分析

根據(jù)文獻(xiàn)中或者國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中報(bào)道內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其定義，共篩選7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，分別為zSSIIb、zein、ADH1、IVR、HMG、E3-UBI和HSP70。為了確定同一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因不同的擴(kuò)增區(qū)域是否對(duì)其檢出有影響，每個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擬計(jì)劃設(shè)計(jì)2 對(duì)引物。設(shè)計(jì)結(jié)果顯示除了IVR只設(shè)計(jì)出 1對(duì)引物外（該基因設(shè)計(jì)的另外一對(duì)引物和引物組的其他引物容易形成二聚體），其他基因均設(shè)計(jì)出2 對(duì)引物，因此共有13 個(gè)擴(kuò)增子區(qū)域。利用在線BLAST程序?qū)@7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的13 個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行拷貝數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的13 個(gè)擴(kuò)增子在玉米基因組上均只有1 個(gè)拷貝（表2）。

2.2 種內(nèi)一致性、檢出豐度與種間特異性分析

通過(guò)對(duì)待檢的208 個(gè)玉米樣品進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序與分析，發(fā)現(xiàn)IVR（京BD123096、京BD122945）與HSP70-1擴(kuò)增子（雅玉98和增玉1572）均只有兩個(gè)樣品沒(méi)有被檢出（圖1），檢出率為99.0%；zein-2擴(kuò)增子在11 個(gè)樣品中（偉科7、京BD123096、京BD122314、京BD121602、京BD124360、京H113417、京H101662、京BD122945、錦華336、冀植選3和高誘2號(hào)）沒(méi)有被檢出，檢出率為94.7%；而剩余的10 個(gè)擴(kuò)增子在所有樣品中均有不同豐度的檢出，檢出率為100%；說(shuō)明這些擴(kuò)增子在玉米種內(nèi)的一致性均較好。

圖1 13 個(gè)擴(kuò)增子在208 個(gè)樣品中的檢出率（A）與檢出豐度（B）Fig.1 Detection rates (A) and abundance (B) of 13 amplicons in 208 samples

此外用建庫(kù)起始DNA量相等（200 ng）的25 個(gè)玉米品種對(duì)所選7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的13 個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行檢出豐度分析。結(jié)果顯示每個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的各擴(kuò)增子在所有樣品中均被檢出（圖2），同一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，除了ADH1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的兩個(gè)擴(kuò)增子ADH1-1和ADH1-2檢出豐度相對(duì)比較接近外，其他5 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的2 個(gè)擴(kuò)增子檢出豐度均有一定差異，說(shuō)明同一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的不同擴(kuò)增子檢出豐度有差異。在13 個(gè)擴(kuò)增子中，zSSIIb-1檢出豐度最高，其次為E3-UBI-1、HSP70-2和zein-1，它們檢出豐度均變異較大，而zein-2、ADH1-1、ADH1-2、HMG-2、E3-UBI-2與HSP70-1的變異較?。?biāo)準(zhǔn)偏差均在100以內(nèi)）。從檢出率及檢出豐度高低看，zSSIIb-1作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因相對(duì)較好，但其在各樣品的檢出豐度變異較大。為了驗(yàn)證豐度變異較大的zSSIIb-1擴(kuò)增子在普通瓊脂糖電泳圖上的目標(biāo)條帶亮度是否差異較大，用zSSIIb-1引物對(duì)檢出豐度高低不一的8 個(gè)樣品進(jìn)行普通PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)zSSIIb-1檢出豐度在2000～3000 條reads的樣品，其PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上的條帶亮度差異并不大（圖3），因此直接通過(guò)瓊脂糖電泳圖無(wú)法精準(zhǔn)確定各擴(kuò)增子的檢出豐度。

圖2 13 個(gè)擴(kuò)增子在建庫(kù)DNA起始量相等的25 個(gè)樣品中的檢出豐度箱線圖及散點(diǎn)圖Fig.2 Boxplot and scatter plot of the detected abundance of the 13 amplicons in 25 samples with equal initial amount of DNA for library construction

圖3 玉米zSSIIb-1擴(kuò)增子在8 個(gè)樣品中的檢出豐度（A）及定性PCR驗(yàn)證（B）和大豆lectin基因的PCR驗(yàn)證（C）Fig.3 Detected abundance of zSSIIb-1 amplicon (A) and qualitative PCR validation (B) in eight samples,and PCR validation of soybean endogenous reference gene lectin (C)

利用其他非玉米樣品如水稻（5 個(gè)樣品）、棉花（3 個(gè)樣品）、大豆（4 個(gè)樣品）、花生（1 個(gè)樣品）、西瓜（2 個(gè)樣品）、黃瓜（2 個(gè)樣品）、甜瓜（2 個(gè)樣品）、番茄（2 個(gè)樣品）、辣椒（2 個(gè)樣品）、白菜（2 個(gè)樣品）10 個(gè)非玉米物種的25 個(gè)樣品，對(duì)這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增子進(jìn)行種間特異性評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這25 個(gè)樣品均未建庫(kù)成功，理論上來(lái)講這是由于建庫(kù)所用的引物是針對(duì)玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因特異設(shè)計(jì)而造成。為了排除建庫(kù)的問(wèn)題，以大豆4 個(gè)樣品的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，利用文獻(xiàn)報(bào)道的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增與電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆的4 個(gè)樣品均能擴(kuò)增出lectin基因的目標(biāo)條帶，排除了建庫(kù)的問(wèn)題，充分說(shuō)明了所選內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的種間特異性。

2.3 種內(nèi)保守性分析

通過(guò)測(cè)序分析每個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增子序列，可以獲得每個(gè)擴(kuò)增子在各樣品中的拷貝數(shù)目是否和理論值一致，同時(shí)確定其是否含有SNP或者插入缺失序列（insertion-deletion，InDel）。分析結(jié)果顯示：這7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的13 個(gè)擴(kuò)增子在各樣品中的拷貝數(shù)目確實(shí)和理論值一致，均只有一個(gè)拷貝。zein-1與IVR既含有SNP也含有InDel，而E3-UBI-1與之相反，兩者均無(wú)，HMG-2只含有1 個(gè)InDel，剩余的其他擴(kuò)增子序列均含有1～11 個(gè)SNP（表6）。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因應(yīng)選擇種內(nèi)保守性較好的基因，如本研究E3-UBI內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的E3-UBI-1擴(kuò)增子。對(duì)于含有較密集SNP或者InDel的擴(kuò)增子，若后續(xù)研究用其作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因并自己設(shè)計(jì)引物時(shí)，不僅要考慮擴(kuò)增子的長(zhǎng)度，還需注意避開(kāi)這些SNP或者InDel位置，以免影響其擴(kuò)增效率或檢出率。如本研究中的IVR，其擴(kuò)增長(zhǎng)度較長(zhǎng)263 bp，內(nèi)部又含有SNP和InDel，可能是導(dǎo)致其檢出豐度較低、穩(wěn)定性差的原因。

表6 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子保守性分析的相關(guān)參數(shù)Table 6 Parameters of intraspecies conservation of amplicons of endogenous reference genes

2.4 穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm分析內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的穩(wěn)定性

geNorm軟件通過(guò)計(jì)算每個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在不同樣品中檢出豐度的穩(wěn)定性值（M值）確定其穩(wěn)定性，M值越小說(shuō)明內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的穩(wěn)定性越高，反之則越低。geNorm軟件通常會(huì)將穩(wěn)定性M值低于1.5的基因作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因。利用geNorm軟件對(duì)所篩選的7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的13 個(gè)擴(kuò)增子的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示這7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的13 個(gè)擴(kuò)增子的M值均小于1.5，說(shuō)明它們均可選為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因（圖4），其中最穩(wěn)定的是擴(kuò)增子ADH1-1與ADH1-2，最差的是IVR。

圖4 geNorm分析13 個(gè)擴(kuò)增子的穩(wěn)定性（A）及其最佳配對(duì)數(shù)目（B）Fig.4 Analysis of stability (A) and optimal pair number (B) of 13 amplicons using geNorm

geNorm軟件還可通過(guò)計(jì)算內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的配對(duì)變異系數(shù)（pairwise variation value，Vn/Vn+1）確定內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的最佳數(shù)目。通常以0.15作為臨界值確定內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的最適數(shù)量。如果配對(duì)變異系數(shù)小于0.15，表明n個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因已經(jīng)穩(wěn)定，無(wú)需引入第（n＋1）個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，即能夠滿足相對(duì)定量的要求，反之亦然。分析結(jié)果表明在測(cè)試穩(wěn)定性的擴(kuò)增子中，最穩(wěn)定的兩個(gè)擴(kuò)增子為ADH1-1與ADH1-2，配對(duì)變異系數(shù)V2/V3小于0.15，表明選擇這2 個(gè)擴(kuò)增子即可滿足定量檢測(cè)的需求。

2.4.2 NormFinder分析內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的穩(wěn)定性

NormFinder與geNorm類(lèi)似，也是通過(guò)計(jì)算內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢出豐度的M值評(píng)價(jià)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的穩(wěn)定性，M值越小則其穩(wěn)定性越高。NormFinder分析結(jié)果顯示，ADH1-2擴(kuò)增子的穩(wěn)定性最高，IVR最差（表7），該結(jié)果與geNorm軟件的分析結(jié)果一致。此外這兩個(gè)軟件的分析結(jié)果顯示，M值排序從第8個(gè)開(kāi)始，后面6 個(gè)擴(kuò)增子的排序都一樣。

2.5 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍

內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍分析結(jié)果顯示這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的擴(kuò)增子除HSP70-1在1 個(gè)樣品（M000036的1000 倍稀釋?zhuān)珼NA總量0.2 ng）中沒(méi)有檢出外，其余擴(kuò)增子在DNA量檢測(cè)下限為0.2 ng時(shí)，均能被檢出，說(shuō)明所選內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的檢測(cè)靈敏度較高（圖5）。具體地，在所測(cè)5 個(gè)玉米品種（品系）的各稀釋梯度，IVR、HSP70-1、E3-UBI-2與HMG-2檢出豐度較低（絕大數(shù)小于100 條reads），并且這4 個(gè)擴(kuò)增子在各個(gè)品種（品系）的不同稀釋梯度的檢出豐度幾乎無(wú)差異；與IVR、HSP70-1、E3-UBI-2和HMG-2的相反，zSSIIb-1擴(kuò)增子的檢出豐度較高（最低為337，平均值1640.852），zein-1、zein-2、zSSIIb-2、ADH1-1、ADH1-2、HMG-1、E3-UBI-1與HSP70-2檢出豐度相對(duì)次之，但這9 個(gè)擴(kuò)增子的檢出豐度均不隨樣品DNA的稀釋梯度的變化而成比例變化。這樣進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分定量時(shí)，選擇不同的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因會(huì)呈現(xiàn)不同的檢測(cè)結(jié)果，尤其對(duì)混雜不同物種的轉(zhuǎn)基因樣品（如食品中混了不同濃度的轉(zhuǎn)基因玉米和大豆）進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，定量檢測(cè)將變得更復(fù)雜，需要聯(lián)合幾個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，并利用標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置矯正系數(shù)才能對(duì)樣品中的DNA含量或轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行精準(zhǔn)定量。

3 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因玉米非常容易通過(guò)非法途徑混入我國(guó)食品市場(chǎng)，這不僅會(huì)對(duì)消費(fèi)者的食用安全造成威脅，還可能會(huì)因此擾亂我國(guó)在轉(zhuǎn)基因食品上的監(jiān)管。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)管、檢測(cè)以及作物成分的鑒定均要以內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)榛鶞?zhǔn)，因此內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其擴(kuò)增區(qū)域的篩選與評(píng)估顯得尤為重要。到目前為止，已開(kāi)發(fā)的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因有ADH1[15]、IVR[15]、zein[16]、zSSIIb[17]、HMG[18]。zSSIIb是我國(guó)轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中較常用的，而ADH1基因是歐盟轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中常用的。本研究利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)上述幾個(gè)常用的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及其他植物中報(bào)道的兩個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因在玉米中同源物（E3-UBI和HSP70）的擴(kuò)增子進(jìn)行了種內(nèi)一致性、保守性、種間特異性、檢出豐度及動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍進(jìn)行評(píng)估。

通過(guò)對(duì)所選的7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因13 個(gè)目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，這13 個(gè)擴(kuò)增子在208 個(gè)樣品中的檢出率為94.7%～100%，而在非玉米的水稻、大豆、棉花、白菜等物種中均無(wú)法被有效檢出，說(shuō)明這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的種內(nèi)高度一致性與種間的高度特異性。其中zSSIIb-1檢出豐度最高，其次為E3-UBI-1、HSP70-2和zein-1，IVR檢出豐度最低，然而zSSIIb-1檢出豐度在各個(gè)樣品中變異較大，這可能與設(shè)計(jì)的擴(kuò)增子引物區(qū)域的保守性、擴(kuò)增子長(zhǎng)度、引物擴(kuò)增效率及樣品DNA濃度等多種因素有關(guān)。其中引物的保守性及擴(kuò)增子的長(zhǎng)度可能對(duì)擴(kuò)增子的檢出豐度影響更大，如本實(shí)驗(yàn)所選的E3-UBI-1擴(kuò)增子非常保守，既沒(méi)有SNP，也沒(méi)有InDel，其檢出豐度相對(duì)較高；而IVR與之相反，兩者均有，加上測(cè)序長(zhǎng)度單端只有150 bp，致使IVR在檢測(cè)的所有樣品中的檢出豐度均較低，因此建議若后續(xù)使用IVR作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因時(shí)，可考慮重新設(shè)計(jì)引物，并且引物不要設(shè)計(jì)在含有SNP和InDel的區(qū)域，擴(kuò)增長(zhǎng)度短些。

此外，本研究還利用geNorm和NormFinder軟件分析了7 個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因13 個(gè)擴(kuò)增子的穩(wěn)定性，分析結(jié)果均表明最穩(wěn)定的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子是ADH1-2，最不穩(wěn)定的是IVR。動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍分析結(jié)果顯示，檢出豐度穩(wěn)定性最好的ADH1-2與種內(nèi)最保守的E3-UBI-1擴(kuò)增子在文庫(kù)構(gòu)建的DNA用量檢測(cè)下限為0.2 ng時(shí)，均還能在樣品中被穩(wěn)定檢出。因此從種內(nèi)保守性與檢出穩(wěn)定性綜合看，利用擴(kuò)增子測(cè)序法對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，優(yōu)選E3-UBI-1與ADH1-2這兩個(gè)擴(kuò)增子相對(duì)較好。但具體這些內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增子如何組合才能精準(zhǔn)定量玉米產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分，目前研究團(tuán)隊(duì)還在攻關(guān)中。