程 靜，齊珍麗，許 宙，丁 利，程云輝，陳茂龍

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，引發(fā)了一系列的環(huán)境問題，包括大氣污染、土壤污染和水源污染等。污染因素種類眾多，其中重金屬鎘污染具有隱蔽性、長(zhǎng)期性和累積性等特性[1]，毒害效應(yīng)短期難以察覺，但是通過食物鏈累積，即使?jié)舛群艿?，它也能?dǎo)致人體各種健康問題。如鎘中毒會(huì)損害心血管和免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致癌癥、糖尿病、腎衰竭、肝功能衰竭，以及心臟病等致命疾病[2]。我國(guó)是世界第二大水稻糧食種植國(guó)，產(chǎn)量占國(guó)內(nèi)糧食總產(chǎn)量的1/3以上，湖南省是人均大米消費(fèi)量最高的省份[3]。研究發(fā)現(xiàn)水稻、小麥等糧食作物對(duì)鎘有一定的富集能力，其中水稻更容易富集鎘[4]，對(duì)食用者的身體健康產(chǎn)生較嚴(yán)重危害。因此，必須開展對(duì)大米中重金屬鎘的檢測(cè)研究，這對(duì)預(yù)防鎘離子（Cd2＋）的傷害具有積極意義。

Cd2＋常用的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有原子光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、冷蒸汽原子熒光光譜法和陽極溶出伏安法等，這些都是非常靈敏有效的檢測(cè)方法，但價(jià)格昂貴且速度慢[5-6]。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已經(jīng)無法滿足社會(huì)的日常檢測(cè)需求。本研究的目的是要?jiǎng)?chuàng)建一種更加簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)并方便實(shí)踐應(yīng)用的Cd2＋實(shí)時(shí)傳感分析方法，對(duì)滿足當(dāng)今日益增長(zhǎng)的生產(chǎn)生活需要有較大意義。

近年來，熒光生物傳感器由于其方便快捷、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)[7]，引起了科學(xué)家的極大興趣。本研究在此基礎(chǔ)上開發(fā)一種以金屬有機(jī)框架（metal-organic frameworks，MOFs）為熒光猝滅劑的新型熒光生物傳感器。MOFs由于其多孔骨架結(jié)構(gòu)[8]、可調(diào)節(jié)孔徑[9]、比表面積大和良好的化學(xué)穩(wěn)定性[10-11]，在生物傳感器[12]、生物醫(yī)學(xué)[13]、電催化[14]、能量存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)化[15]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。特別是當(dāng)它們與適配體功能化結(jié)合時(shí)，MOFs可用于構(gòu)建高性能的生物傳感器，應(yīng)用范圍從醫(yī)療診斷[16]、食品安全檢測(cè)[17]到環(huán)境監(jiān)測(cè)[18]。MOFs的均勻晶體結(jié)構(gòu)、高比表面積及可調(diào)的孔結(jié)構(gòu)，允許多種DNA、RNA和適配體附著或修飾，從而構(gòu)建基于MOFs作為能量受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳感器。

本實(shí)驗(yàn)將MOFs中水穩(wěn)定分散的UiO-66-NH2作為熒光猝滅劑，利用其較大的比表面積和孔隙率，通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移猝滅熒光標(biāo)記的適配體，再利用Cd2＋與適配體的特異性相互作用，恢復(fù)熒光，以此構(gòu)建一款Cd2＋熒光傳感器，方法原理如圖1所示。此方法構(gòu)建的Cd2＋熒光生物傳感器具有簡(jiǎn)便易行、靈敏度較高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

圖1 UiO-66-NH2/適配體生物傳感器檢測(cè)Cd2＋的原理圖Fig.1 Schematic diagram of UiO-66-NH2/aptamer biosensor for detecting Cd2+

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基對(duì)苯二甲酸、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸、無水乙醇、九水合硝酸鋁、六水合氯化鎂、四水合乙酸鈷、四水合乙酸鎳、四水合硝酸鎘、氯化鈉、氯化鉀、溴化鉀國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四氯化鋯 北京百靈威科技有限公司；二水合氯化鈣、四水合氯化亞鐵、三水合乙酸鉛、五水合硫酸銅 西隴化工股份有限公司；六水合三氯化鐵 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所有化學(xué)試劑均為分析純。

熒光基團(tuán)修飾的適配體 生工生物工程（上海）股份有限公司。適配體序列[19]：5’-6-FAM-CTC AGG ACG ACGGGT TCA CAG TCC GTT GTC-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet 670傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司；F96PRO熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；Rigaku Smartlab 9粉末X射線衍射（powder X-ray diffraction，PXRD）儀 日本理學(xué)株式會(huì)社；Quanta 400 FEG高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司；Zetasizer nano激光粒度儀 英國(guó)Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 材料的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法合成UiO-66-NH2；根據(jù)文獻(xiàn)[21]的方法合成ZIF-8。

MIL-101合成根據(jù)文獻(xiàn)[22]方法，并進(jìn)行一定修改。將Cr(NO3)3·9H2O、對(duì)苯二甲酸、HF、超純水混勻并超聲15 min，最后均溶于100 mL反應(yīng)釜中，于220 ℃烘箱中反應(yīng)12 h。冷卻離心（6000 r/min，8 min），并且用超純水、乙醇洗滌，70 ℃真空干燥過夜，得到淺綠色的粉末。

適配體溶液母液的配制：適配體開蓋前先離心（4000 r/min，30～60 s），每吸光度的引物加33 μL的Tris-HCl（pH 7.42）緩沖液配制成100 μmol/L貯存液，混勻后-20 ℃冷藏待用。

1.3.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化

在完整的檢測(cè)體系下，適配體濃度分別設(shè)置為0.1、0.2、0.3 μmol/L和0.4 μmol/L，根據(jù)熒光強(qiáng)度選擇合適的適配體濃度。并且在不加入目標(biāo)物Cd2＋的條件下，UiO-66-NH2的終質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/mL和1.0 mg/mL，通過測(cè)定518 nm波長(zhǎng)處熒光的猝滅強(qiáng)度，以確定最適UiO-66-NH2濃度。根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)將所使用的NaCl濃度設(shè)置區(qū)間在80～150 mmol/L之間，考察在不同濃度下熒光恢復(fù)強(qiáng)度。設(shè)置不同的孵育溫度（4、15、25、37 ℃）和孵育時(shí)間（10、20、40、60、80、100、120 min），以探究目標(biāo)物在不同溫度和不同時(shí)間下與適配體結(jié)合后熒光恢復(fù)情況。

1.3.3 檢測(cè)方法的建立

通過Cd2＋適配體和UiO-66-NH2納米顆粒通過配位結(jié)合制備UiO-66-NH2納米顆粒Cd2＋傳感器。適配體溶液稀釋至2.0 μmol/L，貯存在4 ℃的冰箱以待后續(xù)使用，將100 μL濃度為2.0 μmol/L的Cd2＋適配體添加到質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的UiO-66-NH2納米顆粒中，混合均勻，并在室溫下孵育0.5 h。然后將混合物離心（2000 r/min、1 min）以從混合物中除去未結(jié)合的適配體，最后將UiO-66-NH2/適配體傳感器分散在緩沖液中。

配制不同濃度的Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液（pH 7.4），并儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中。加入100 μL 2.0 mg/mL UiO-66-NH2溶液，加入100 μL不同濃度的Cd2＋適配體標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL Tris-HCl（pH 7.42）緩沖溶液后混勻，25 ℃孵育100 min后，然后測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（適配體終濃度200 nmol/L，UiO-66-NH2終質(zhì)量濃度0.2 mg/mL）。

熒光檢測(cè)條件為微量石英比色皿，激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)500～700 nm，掃描速率1000 nm/min，狹縫寬度10 nm。

1.3.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

水樣的前處理：取自來水水樣，采集完后用0.22 μmol/L的水系濾膜過濾，然后用火焰原子吸收光譜測(cè)其Cd2＋含量，用1%硝酸溶液酸化，置于干凈的容量瓶中，4 ℃冰箱冷藏待用。

大米樣品的前處理：鎘測(cè)定參考GB 5009.15-2014《食品中鎘的測(cè)定》。

加標(biāo)樣的制備：向25.0 mL處理后的自來水和大米樣中分別加入Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到終濃度為50、500 nmol/L的Cd2＋待檢測(cè)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料的篩選

首先選擇3 種不同金屬中心構(gòu)成的MOFs，通過測(cè)定UiO-66-NH2、MIL-101（Cr）、ZIF-8三款材料的粒徑和電荷性質(zhì)。如圖2所示，最終選擇粒徑適宜、帶正電荷數(shù)值更大的UiO-66-NH2開展后續(xù)檢測(cè)研究。

圖2 MIL-101（Cr）、ZIF-8、UiO-66-NH2的總粒徑（a）和總電位（b）圖Fig.2 Total particle size (a) and total potential (b) of MIL-101(Cr),ZIF-8,and UiO-66-NH2

2.2 材料的結(jié)構(gòu)表征

通過紅外光譜（圖3a）可以確定金屬與配體已經(jīng)完全配位，對(duì)比已報(bào)道的文獻(xiàn)[23]，—NH2特征振動(dòng)峰群出現(xiàn)在3471 cm-1和3350 cm-1，在1656、1579 cm-1顯示羧基與Zr的配位，說明UiO-66-NH2材料的合成成功。如圖3b所示，考察UiO-66-NH2的孔徑大小和BET比表面積（約為513 m2/g）。為觀察UiO-66-NH2的形貌，通過掃描電鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察（圖3c）表明，UiO-66-NH2具有較好的八面體結(jié)構(gòu)，結(jié)合PXRD圖可以說明UiO-66-NH2的成功合成。UiO-66-NH2單晶模擬的PXRD峰形與實(shí)際合成的PXRD峰形（圖3d），主要的衍射峰位置都保持一致且較尖銳，表明材料合成成功且結(jié)晶性好。

圖3 UiO-66-NH2的紅外光譜圖（a）、N2吸附等溫線圖（77 K）（b）、掃描電鏡圖（c）和PXRD圖（d）Fig.3 IR spectrum (a),N2 adsorption isotherm (77 K) (b),scanning electron micrograph (c) and power X-ray diffraction pattern (d) of UiO-66-NH2

2.3 傳感體系的構(gòu)建

由于6-FAM標(biāo)記的熒光適配體帶負(fù)電荷，為驗(yàn)證適配體成功吸附在UiO-66-NH2上，通過測(cè)定混合體系以及UiO-66-NH2的粒徑和電位變化（圖4），發(fā)現(xiàn)UiO-66-NH2與適配體在緩沖溶液中結(jié)合后，適配體的負(fù)電荷會(huì)與UiO-66-NH2的正電荷相互抵消，電位從8.56 mV降低至1.01 mV，粒徑從332 nm增加至377 nm。水合粒徑增大及電位變小說明適配體已經(jīng)成功吸附至UiO-66-NH2上，表明UiO-66-NH2/適配體傳感體系構(gòu)建成功。

圖4 UiO-66-NH2和UiO-66-NH2/適配體的粒徑（a）和電位（b）變化圖Fig.4 Changes in particle size (a) and potential (b) of UiO-66-NH2 and UiO-66-NH2/aptamer

2.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化

在利用熒光標(biāo)記適配體與UiO-66-NH2構(gòu)建傳感器時(shí)，根據(jù)其實(shí)驗(yàn)原理，發(fā)現(xiàn)UiO-66-NH2濃度、適配體濃度、鹽濃度等對(duì)熒光強(qiáng)度都有較大的影響。因此對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定獲得最佳檢測(cè)性能。主要包括適配體濃度、UiO-66-NH2質(zhì)量濃度、鹽濃度、孵育溫度與時(shí)間。

2.4.1 適配體濃度的優(yōu)化

因此本研究測(cè)定100、200、300 nmol/L和400 nmol/L濃度下適配體的熒光強(qiáng)度，如圖5所示，隨著濃度的增加，熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。雖然熒光強(qiáng)度越高，越符合檢測(cè)條件，但是過高的熒光則會(huì)減弱低濃度Cd2＋的熒光恢復(fù)水平，且需要用的適配體量就會(huì)隨之增大，成本就會(huì)增加。因此，選擇200 nmol/L作為適配體最終濃度。

圖5 不同濃度下的適配體熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of aptamers at different concentrations

2.4.2 UiO-66-NH2質(zhì)量濃度的優(yōu)化

MOFs作為檢測(cè)體系的熒光猝滅劑，UiO-66-NH2質(zhì)量濃度的選擇也有著至關(guān)重要的作用。如圖6所示，UiO-66-NH2質(zhì)量濃度越大，猝滅熒光適配體的效果越強(qiáng)。因此可以確定在518 nm波長(zhǎng)處熒光基本消失時(shí)為最適UiO-66-NH2質(zhì)量濃度，所以選擇0.2 mg/mL為UiO-66-NH2最終質(zhì)量濃度。

圖6 不同質(zhì)量濃度UiO-66-NH2猝滅適配體熒光光譜（a）和熒光強(qiáng)度變化（b）圖Fig.6 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) of UiO-66-NH2-quenching aptamer at different concentrations

2.4.3 NaCl濃度的優(yōu)化

Na＋可以中和適配體的電荷，減少其靜電斥力[24]。因此，NaCl的加入有利于適配體與Cd2＋之間形成特定的空間結(jié)構(gòu)[25]。本實(shí)驗(yàn)研究傳感體系中的離子強(qiáng)度與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系。如圖7所示，傳感體系的熒光強(qiáng)度在100 mmol/L時(shí)出現(xiàn)最高值。隨著NaCl濃度的增加，熒光強(qiáng)度下降，說明Na＋濃度過高會(huì)阻礙Cd2＋與適配體的結(jié)合，不利于熒光的恢復(fù)。因此，選擇含有100 mmol/L的NaCl Tris-HCl開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖7 不同濃度NaCl孵育條件下傳感體系的熒光光譜（a）和熒光強(qiáng)度變化（b）圖Fig.7 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) ofthe sensor system under different concentrations of NaCl

2.4.4 孵育溫度的優(yōu)化

溫度不同會(huì)影響適配體與目標(biāo)物Cd2＋的結(jié)合，進(jìn)而影響傳感體系中熒光的恢復(fù)值[26]，如圖8所示，考察在4、15、25 ℃和37 ℃條件下的熒光恢復(fù)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在25 ℃的熒光恢復(fù)最好，4 ℃熒光強(qiáng)度恢復(fù)最差。主要原因在于25 ℃適配體與目標(biāo)物Cd2＋的結(jié)合效果最好，這區(qū)別于已經(jīng)報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)[27-28]，可能原因在于UiO-66-NH2本身具有一定的孔徑和吸附能力，溫度越高，吸附能力越強(qiáng)。因此選擇25 ℃作為最后的孵育溫度。

圖8 不同溫度孵育條件下傳感體系的熒光光譜（a）和熒光強(qiáng)度變化（b）圖Fig.8 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) of the sensor system at different incubation temperatures

2.4.5 孵育時(shí)間的優(yōu)化

孵育時(shí)間是特定空間結(jié)構(gòu)形成寡核苷酸適配體和帽子之間的主要影響因素[29]。如圖9所示，熒光強(qiáng)度隨著孵育時(shí)間10～100 min的增加而增強(qiáng)，然后100～120 min趨于平穩(wěn)。結(jié)果表明100 min作為最終孵育時(shí)間，熒光恢復(fù)效果最好。

圖9 不同孵育時(shí)間下傳感體系的熒光光譜（a）和熒光強(qiáng)度變化（b）圖Fig.9 Fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity change (b) of the sensor system at different incubation times

2.5 傳感體系對(duì)Cd2＋檢測(cè)的性能分析

記錄不同濃度Cd2＋的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖10所示，傳感體系的熒光強(qiáng)度隨著Cd2＋濃度的增加而逐漸增大。在10～10000 nmol/L范圍內(nèi)，傳感體系的熒光強(qiáng)度與Cd2＋濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.977。該方法所得檢出限為：

圖10 加入不同濃度Cd2＋后的熒光光譜圖Fig.10 Fluorescence spectra of the sensor at different Cd2+ concentrations

式中：Y為518 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度；X為Cd2＋濃度；Sb為測(cè)定20 次空白實(shí)驗(yàn)后的方差；K為式（1）中斜率；LOD為檢出限，計(jì)算得為0.107 nmol/L。由于重金屬Cd2＋的特性與嚴(yán)重危害力，與其他生物小分子相比，Cd2＋與適配體結(jié)合的作用力相對(duì)更弱。對(duì)比已經(jīng)報(bào)道的熒光傳感器，線性范圍較大，檢出限較低，具有一定的優(yōu)勢(shì)（表1）。

表1 Cd2＋檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of this method with other methods for detecting cadmium ion

2.6 金屬離子檢測(cè)特異性分析

由于實(shí)際檢測(cè)中往往是多種金屬離子共同存在，對(duì)于離子探測(cè)材料來說，其探測(cè)的抗干擾性也會(huì)受到影響，為了排除其他離子對(duì)檢測(cè)的影響，本實(shí)驗(yàn)考察在其他金屬離子作用下，傳感體系的選擇能力。如圖11所示，在Al3＋、Ca2＋、Co2＋、Cu2＋、Fe2＋、K＋、Mg2＋、Na＋、Ni2＋、Pb2＋、Zn2＋和Fe3＋存在的情況下，傳感體系的熒光基本無變化，表明該傳感體系對(duì)Cd2＋具有較好的選擇特異性。

圖11 熒光檢測(cè)Cd2＋選擇性實(shí)驗(yàn)Fig.11 Selectivity for fluorescence detection of Cd2+

2.7 實(shí)際樣品中Cd2＋的檢測(cè)

為驗(yàn)證本研究方法的實(shí)用性，通過對(duì)自來水和大米樣品中分別添加50 nmol/L和500 nmol/L的Cd2＋標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)算統(tǒng)計(jì)得到的結(jié)果如表2所示。大米樣品中加標(biāo)回收率略高于水樣，可能是由于實(shí)際的樣品中大米中的Cd2＋不僅存在于表面也存在于大米顆粒內(nèi)部[34]。加標(biāo)回收率在91.14%～107.98%之間。結(jié)果證明，本研究構(gòu)建的熒光傳感器可以用作實(shí)際樣品中Cd2＋的檢測(cè)。

表2 傳感體系對(duì)實(shí)際樣品中Cd2＋的檢測(cè)Table 2 Results of detection of Cd2+ in actual samples by the sensor system

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用UiO-66-NH2材料與Cd2＋適配體構(gòu)建了一款Cd2＋熒光生物傳感器，最優(yōu)條件下，在0.01～10 μmol/L范圍內(nèi)，傳感體系的熒光強(qiáng)度與Cd2＋濃度呈良好的線性關(guān)系；該生物傳感器對(duì)Cd2＋具有良好的選擇特異性，并能對(duì)實(shí)際樣品水和大米中的Cd2＋有較好的檢出能力。本方法較經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便易行，為重金屬Cd2＋的檢測(cè)提供了新方法。更重要的意義在于通過更換適配體序列即可方便構(gòu)建出其他重金屬離子的檢測(cè)方法，值得擴(kuò)展研究。