駱茂香 劉磊 陳雯 陳仁遠

摘 要：本文采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）同時測定醬香型白酒原輔料（高粱和大曲）中的5種非揮發(fā)性酚酸（原兒茶酸、對香豆酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸）。結(jié)果顯示，利用外標(biāo)法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.995，精密度在0.6%～6.3%，回收率在94.2%～108.1%，準(zhǔn)確度在-5.8%～8.1%。該方法操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定性好、檢測數(shù)據(jù)可靠，可用于醬香型白酒原輔料中非揮發(fā)性酚酸含量的測定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；非揮發(fā)性酚酸；醬香型白酒；高粱；大曲

Determination of Non-Volatile Phenolic Acids in Raw and Auxiliary Materials of Jiangxiangxing Baijiu by UPLC-MS/MS

LUO Maoxiang1， LIU Lei2， CHEN Wen2， CHEN Renyuan1*

（1.Guizhou Provincial Liquor Product Quality Inspectionand Testing Institute， Renhuai 564500， China; 2.Moutai Institute， Renhuai 564500， China）

Abstract： Five non-volatile phenolic acids （protocatechuic acid， p-coumaric acid， chlorogenic acid， caffeic acid and ferulic acid） in the raw materials and excipients of Jiangxiangxing Baijiu （sorghum and Daqu） were simultaneously determined by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The results showed that the standard curve established using the external standard method had a good linear relationship， with correlation coefficients （R2） higher than 0.995， precision ranging from 0.6% to 6.3%， recovery ranging from 94.2% to 108.1%， and accuracy ranging from -5.8% to 8.1%. The method is simple， stable and reliable， and can be used to determine the content of nonvolatile phenolic acids in the raw and auxiliary materials of Jiangxiangxing Baijiu.

Keywords： ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry; non-volatile phenolic acids; Jiangxiangxing Baijiu; sorghum; Daqu

酚酸是酚類化合物，是食品中主要抗氧化物質(zhì)的來源，其組成及含量對抗氧化活性起著決定性作用[1]。非揮發(fā)性酚酸包括原兒茶酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等[2]。白酒釀造用原輔料如高粱、大曲中存在一些酚酸類物質(zhì)，原輔料在各酶系、微生物的作用下也會生成一些酚酸，這些活性物質(zhì)經(jīng)過釀造、蒸餾等過程進入酒體，賦予白酒特殊的苦味和堅果香氣，不僅影響白酒的風(fēng)格和口感，增加白酒風(fēng)味層次感，同時還具有抗氧化的作用[3-5]。有研究報道，酚酸對冠心病、糖尿病、高血脂、痛風(fēng)等都有一定的預(yù)防作用[6-10]。阿魏酸是一種抗氧化劑，也是防癌物質(zhì)，具有抗炎鎮(zhèn)痛的功效[11]。因此，對白酒釀造原輔料中的酚酸進行定量有助于監(jiān)控白酒的質(zhì)量，提升白酒的品質(zhì)。

目前，對酚酸進行檢測的方法主要有薄層色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14]等。酚酸類物質(zhì)在醬香型白酒和其原輔料中含量較低，并且大多研究旨在檢測白酒中酚酸的含量，對白酒原輔料中酚酸含量的研究較少。因此，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對白酒原輔料中的非揮發(fā)性酚酸進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仁懷醬香型白酒核心產(chǎn)區(qū)所用大曲、高粱；原兒茶酸（99.0%）、對香豆酸（99.7%）、綠原酸（98.9%）、咖啡酸（99.7%）、阿魏酸（99.9%），阿爾塔公司；甲醇（色譜純，德國默克公司）；磷酸（色譜純，科密歐公司）；超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

漩渦振蕩器（XH-B，江蘇天翎公司）；臺式電子天平（精確度0.000 1 g，賽多利斯公司）；0.44 μm濾頭；離心機（TD4Z-WS，湖南湘立公司）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Ultimate 3000，美國賽默飛世爾科技公司）；超純水機（Milli-Q，Millipore公司）；電子天平（精度0.000 1 g，賽多利斯公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

粉碎高粱、大曲后分別過40目、20目篩，參照趙尚碧等[15]的樣品預(yù)處理方法對樣品前處理條件進行優(yōu)化。分別稱取5 g（精確至0.001 g）高粱或大曲粉末樣品于50 mL離心管中，加入50%甲醇水溶液20 mL，振蕩5 min后，以3 000 r·min-1離心30 min，吸取0.200 mL上清液于50 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液定容，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3.2 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：XDB-C18柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動相A相為0.1%甲酸溶液，B相為甲醇，洗脫程序：0～15.00 min，5%→100% B，15.10～17.00 min，100% B，17.10～20.00 min，5% B；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.25 mL·min-1。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI），負離子模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（Selected Reaction Monitoring，SRM）；毛細管溫度：300 ℃；霧化氣溫度：320 ℃；鞘氣壓力：25 Arb；噴霧電壓：3 500 V。5種酚酸的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

1.3.3 酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別取一定質(zhì)量的5種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-20 ℃冷凍保存。用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制5種酚酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度見表2。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

樣品中酚酸含量的計算公式為

（1）

式中：C為待測組分的含量，g·kg-1；C測為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的待測物的質(zhì)量濃度，μg·L-1；m為所稱取的樣品質(zhì)量，g；V為定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

對原兒茶酸、對香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸5種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表3所示。原兒茶酸、對香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.995，相關(guān)系數(shù)滿足《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的對于確認方法相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99的要求。

2.2 精密度實驗

配制原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸在高粱和大曲中3個濃度水平的樣品添加溶液，分別進樣6次計算精密度。由表4可知，5種酚酸在高粱、大曲中的精密度試驗中變異系數(shù)為0.6%～6.3%，滿足《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的精密度試驗中變異系數(shù)小于7.5%的要求。

2.3 回收率及準(zhǔn)確度實驗

在空白樣品中分別添加原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在S1、S2、S5 3個濃度水平進行回收率和準(zhǔn)確度試驗，每個濃度水平添加3個平行樣。由表5可知，在3個加標(biāo)水平下，化合物的回收率在94.2%～108.1%，滿足《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS—CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的回收率為90%～120%的要求。各樣品化合物在S1、S2、S5 3個空白加標(biāo)濃度水平的準(zhǔn)確度偏差在-5.8%～8.1%，滿足《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求》（GB/T 27025—2019）、《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認可準(zhǔn)則在化學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明》（CNAS-CL01-A002：2020）等規(guī)范性技術(shù)文件規(guī)定的準(zhǔn)確度偏差在-20%～20%的要求。

2.4 實驗樣本測定

建立4種酚酸定性、定量方法后利用液相-串聯(lián)質(zhì)譜儀對樣品進行檢測。樣品中原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸的含量范圍如表6所示。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測醬香型白酒原輔料（高粱和大曲）中的5種酚酸（原兒茶酸、對香豆酸、綠原酸、咖啡酸和阿魏酸）含量，方法操作簡單、可靠，R2值、RSD、加標(biāo)回收率、準(zhǔn)確度等各項指標(biāo)均達到分析要求，可用于醬香型白酒原輔料中酚酸含量的測定，有助于監(jiān)控白酒的質(zhì)量，提升白酒的品質(zhì)。

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