張秀峰　李小菲　劉明　王慧靜

摘要：目的 從Ras同源基因家族成員A（RhoA）/Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）通路探討杜仲葉總黃酮促進腦出血大鼠神經功能修復的機制。方法 取SD雄性大鼠，用改良二次注血法建立腦出血模型，并按隨機數字表法分為假手術組、模型組、杜仲葉總黃酮組、RhoA抑制劑組、RhoA激動劑組、杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組，每組20只。杜仲葉總黃酮組灌胃200 mg/kg杜仲葉總黃酮，RhoA抑制劑組腹腔注射1 mg/kg的RhoA抑制劑Y27632，RhoA激動劑組腹腔注射30 μg/kg的RhoA激動劑U-46619，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組灌胃200 mg/kg杜仲葉總黃酮的同時腹腔注射30 μg/kg U-46619，模型組及假手術組灌胃10 mL/kg生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。給藥結束后，觀察大鼠行為變化，采用改良神經功能缺損評分（mNSS）對神經功能缺損癥狀進行評估；取腦組織后稱質量，計算腦組織含水量，然后制備腦組織切片并計算腦血腫體積百分比；透射電鏡觀察血腫周圍組織神經突觸結構變化；TUNEL染色法觀察血腫周圍組織神經元凋亡；鬼筆環(huán)肽染色觀察血腫周圍組織神經元骨架變化；蛋白免疫印跡法檢測血腫周圍組織RhoA、ROCK、細胞骨架蛋白（F-actin）、絲切蛋白（cofilin）、磷酸化cofilin（p-cofilin）、促神經元及突觸生長相關蛋白［神經生長因子（NGF）、神經營養(yǎng)因子3（NT3）、突觸后致密蛋白-95（PSD-95）、突觸素（SYP）］的表達。結果 與假手術組相比，模型組大鼠神經功能缺損評分、腦組織含水量、腦血腫體積百分比升高，血腫周圍組織神經元凋亡及骨架結構損傷，神經突觸結構改變嚴重，RhoA/ROCK通路激活，促神經元及突觸生長相關蛋白表達降低（P＜0.05）。杜仲葉總黃酮或RhoA抑制劑干預治療均可抑制RhoA/ROCK通路激活介導的神經元骨架結構改變，提高促神經元及突觸生長相關蛋白表達，緩解腦出血后血腫周圍組織神經元損傷及凋亡，促進神經功能修復（P＜0.05）。RhoA激動劑可促進RhoA/ROCK通路激活，加重腦出血后神經功能損傷，并削弱杜仲葉總黃酮的促神經功能修復作用（P＜0.05）。結論 杜仲葉總黃酮可通過抑制RhoA/ROCK通路活化來改善腦出血大鼠出血癥狀，促進神經功能修復。

關鍵詞：腦出血；ρA GTP結合蛋白質；rho相關激酶類；杜仲葉總黃酮；神經功能修復

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：ADOI：10.11958/20221033

Eucommia ulmoides leaves total flavonoids participate in the repair of neural function in rats with cerebral hemorrhage through RhoA/ROCK signaling pathway

ZHANG Xiufeng， LI Xiaofei， LIU Ming△， WANG Huijing

Department of Neurosurgery， the First Hospital Affiliated to Hebei North University， Zhangjiakou 075000， China

△Corresponding Author E-mail： lmltx2009@126.com

Abstract： Objective To explore the possible mechanism of eucommia ulmoides leaves total flavonoids promoting neurological repair in rats with cerebral hemorrhage from the Ras homolog gene family member A （RhoA）/Rho-associated coiled-coil protein kinase （ROCK） pathway. Methods SD male rats were used to establish cerebral hemorrhage model by the modified double injection method， and they were randomly divided into the sham operation group， the model group， the eucommia ulmoides leaves total flavonoids group， the RhoA inhibitor group， the RhoA agonist group， and the eucommia ulmoides leaves total flavonoids + RhoA agonist group， with 20 rats in each group. The eucommia ulmoides leaves total flavonoids group was intragaically treated with 200 mg/kg eucommia ulmoides leaves total flavonoids. The RhoA inhibitor group was intraperitoneally injected with 1 mg/kg RhoA inhibitor Y27632. The RhoA agonist group was intraperitoneally injected with 30 ?g/kg RhoA agonist U-46619， and the eucommia ulmoides leaves total flavonoids + RhoA agonist group was intraperitoneally injected with 200 mg/kg eucommia ulmoides leaves total flavonoids and 30 ?g/kg RhoA agonist U-46619. The model group and sham operation group were given 10 mL/kg normal saline once a day for 7 consecutive days. After the administration， the behavioral changes of rats were observed with the naked eye and the neurological deficit symptoms were assessed by the modified neurological severity score （mNSS）. Brain tissue was taken and weighed， and the water content of the brain tissue was calculated according to the formula to evaluate the cerebral edema， then the brain tissue slices were prepared and the volume percentage of the cerebral hematoma was calculated according to the formula. Changes in the structure of nerve synapses in perihematoma tissue were observed by transmission electron microscope. Changes of neuronal apoptosis of perihematoma tissue were observed by TUNEL staining method. Changes in neuron skeleton of perihematoma tissue were detected by phalloidin staining. The expression levels of RhoA， ROCK， cytoskeleton protein （F-actin）， filament protein （cofilin）， phosphorylated cofilin （p-cofilin）， neuron and synapse growth promoting proteins [nerve growth factor （NGF）， neurotrophic factor 3 （NT3）， postsynaptic dense protein-95 （PSD-95）， synaptophysin （SYP）] in perihematoma tissue were detected by Western blot assay. Results Compared with the sham operation group， the neurological deficit scores， water content of brain tissue and the percentage of cerebral hematoma volume were increased in the model group， the neuronal apoptosis， skeleton structure damage， and changes in the structure of nerve synapses in the surrounding tissue of the hematoma were severer， the activation of RhoA/ROCK pathway increased， and the expression of neuron and synapse growth promoting proteins decreased （P＜0.05）. Eucommia ulmoides leaves total flavonoids or RhoA inhibitor intervention treatment could inhibit changes in neuron skeleton structure mediated by RhoA/ROCK pathway activation， increase the expression of neuron and synapse growth promoting proteins， alleviate neuronal damage and apoptosis in surrounding tissues of the hematoma after cerebral hemorrhage， and promote nerve function repair （P＜0.05）. RhoA agonist could promote the activation of RhoA/ROCK pathway， aggravate the neurological damage after cerebral hemorrhage， and weaken the nerve function repairing effect of eucommia ulmoides leaves total flavonoids （P＜0.05）. Conclusion Eucommia ulmoides leaves total flavonoids can improve the symptoms of cerebral hemorrhage in rats and promote the nerve function repair by inhibiting the activation of RhoA/ROCK pathway.

Key words： cerebral hemorrhage; rhoA GTP-binding protein; rho-associated kinases; eucommia ulmoides leaves total flavonoids; nerve function repair

腦出血是由非外傷性腦血管破裂引起的出血，常導致神經系統(tǒng)繼發(fā)性損傷，具有較高的致死率及致殘率［1］。促進腦出血后神經元再生及修復，對促進腦出血患者神經功能恢復、降低致殘發(fā)生率具有重要意義。Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）及其效應分子，如Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK）活化后可影響細胞骨架重排，導致神經生長錐塌陷進而阻斷神經再生及重塑［2］。已有研究發(fā)現(xiàn)，腦出血后RhoA/ROCK信號通路處于活化狀態(tài)［3］，提示干預RhoA/ROCK信號通路活化可能是緩解腦出血后神經元損傷、促進神經功能恢復的潛在治療機制。杜仲葉總黃酮是從杜仲中提取的一種生物活性成分。有研究顯示杜仲雄花能通過抑制氧化應激減輕小鼠腦損傷［4］。但目前鮮有杜仲葉總黃酮在腦出血方面作用的研究。本研究擬通過建立腦出血大鼠模型，探討杜仲葉總黃酮通過RhoA/Rock通路促進腦出血神經功能修復的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 125只SD雄性大鼠購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場［動物生產許可證號：SCXK（豫）2019-0023］，SPF級，8周齡，體質量180～200 g，分籠飼養(yǎng)，溫度23～25.5 ℃，濕度55%～60%，光照條件設定為明暗各12 h循環(huán)交替，保持通風。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準（倫理號：LSD2021第041號）。

1.1.2 主要試劑與儀器 杜仲葉總黃酮（原料藥，純度98%，貨號ZLS309-24-3）購自湖南天下康生物科技有限公司；RhoA抑制劑Y27632（貨號B6693）購自北京康瑞納生物科技有限公司；RhoA激動劑U-46619（貨號ajci10652）購自武漢安捷凱生物醫(yī)藥科技有限公司。TUNEL染色試劑盒（貨號CA2915）、鬼筆環(huán)肽染色液（貨號CA1317）、DAB顯色液（貨號CA6307）均購自上海吉至生化科技有限公司；兔源微管相關蛋白2（MAP2，貨號ab254264）、RhoA（貨號ab187027）、ROCK（貨號ab125025）、細胞骨架蛋白（F-actin，貨號ab15135）、絲切蛋白（cofilin，貨號ab50127）、磷酸化cofilin（p-cofilin，貨號ab50129）、突觸素（SYP，貨號ab41125）、突觸后致密蛋白-95（PSD-95，貨號ab49503）、神經營養(yǎng)因子3（NT3，貨號ab13274）、神經生長因子（NGF，貨號ab80273）、β-肌動蛋白（β-actin，貨號ab106497）一抗、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（貨號ab112548）均購自英國Abcam公司。電子顯微鏡（型號SIGMA 500）、光學顯微鏡（型號SIGMA 1700）均購自昆山友碩新材料有限公司；化學發(fā)光儀（型號BHP9504）購自先鋒科技（香港）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥 取105只SD大鼠，參照文獻［5］的方法制備腦出血大鼠模型。腹腔注射2 mL/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，暴露顱骨前囟及冠狀縫，用改良二次注血法，于右側尾狀核部位注入自體靜脈血50 μL（鼠尾靜脈取血50 μL）：將注射器固定于腦立體定位儀上，進針至尾狀核，先在2 min內注入20 μL血，留針7 min，繼續(xù)緩慢注入30 μL血（4 min內完成），留針10 min，然后緩慢退出注射器。縫合切口后2 h，用Zea-longa評分法［6］對大鼠神經功能缺損癥狀進行評分，評分為1～3分，視為造模成功（共成功100只，有3只開顱后死亡，有2只麻醉時死亡）。按隨機數字表法分為：模型組、杜仲葉總黃酮組、RhoA抑制劑組、RhoA激動劑組、杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組，每組20只。另取20只大鼠，于右側尾狀核部位注入等量生理鹽水，設為假手術組。

杜仲葉總黃酮組參照文獻［7］按200 mg/kg杜仲葉總黃酮灌胃給藥（生理鹽水稀釋成20 g/L，10 mL/kg給藥）；RhoA抑制劑組參照文獻［8］經腹腔注射1 mg/kg RhoA抑制劑Y27632；RhoA激動劑組參照文獻［9］經腹腔注射30 μg/kg RhoA激動劑U-46619；杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組灌胃給予200 mg/kg的杜仲葉總黃酮同時，經腹腔注射30 μg/kg U-46619；模型組及假手術組灌胃給予10 mL/kg生理鹽水。各組連續(xù)給藥7 d，1次/d。

1.2.2 大鼠神經功能缺損評分 末次給藥結束后，觀察大鼠運動及精神狀況，并參照文獻［10］采用改良神經功能缺損評分（mNSS）對大鼠神經功能缺損癥狀進行評估。評分項目包括提尾試驗0～3分，行走試驗0～3分、感覺試驗0～2分、平衡木試驗0～6分、反射喪失和不正常運動0～4分，總分以18分計，評分越高預示神經功能缺損越嚴重。

1.2.3 腦組織含水量、腦血腫體積百分比檢測 各組隨機取6只大鼠，麻醉處死后取腦組織，濾紙吸干腦組織表面液體后精密稱質量（濕質量），100 ℃烘干至恒重（干質量）。根據公式計算腦組織含水量：腦組織含水量=（濕質量-干質量）/濕質量×100%，以此評價腦水腫嚴重程度。

另外隨機取6只大鼠，麻醉處死，取完整腦組織，測量完整腦組織體積，之后切成厚度為10 μm的連續(xù)冠狀切片，用Image Pro Plus軟件計算每張切片的腦血腫面積，根據公式：腦血腫體積=每張切片腦血腫面積×切片厚度（10 μm）×切片數，測得腦血腫體積，并計算腦血腫體積百分比。腦血腫體積百分比=腦血腫體積/完整腦組織體積×100%。

1.2.4 透射電鏡觀察血腫周圍組織神經突觸結構變化 麻醉處死各組剩余8只大鼠后，剝離完整腦組織，剪取血腫周圍約1 mm×1 mm×1 mm組織塊，送入電鏡室處理后，于5 000倍電鏡下觀察神經突觸結構變化。

1.2.5 TUNEL染色法觀察血腫周圍組織神經元凋亡 取血腫周圍約2 mm×2 mm×2 mm組織塊2塊，其中一塊放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ硪粔K切成厚度20 μm的冰凍切片，取部分切片，進行TUNEL染色后，于光鏡下觀察神經元損傷及染色變化，每張切片隨機讀取5個視野，用Image Pro Plus 6.0軟件計算染色為棕黃色的凋亡細胞數目，計算神經元凋亡率。神經元凋亡率=凋亡神經元/總神經元×100%。

1.2.6 鬼筆環(huán)肽染色觀察血腫周圍組織神經元骨架變化 取相同部位血腫周圍組織冰凍切片，復溫、抗原修復、0.1%曲拉通透化后，滴加IgG標記的MAP2（1︰100）及羊抗兔IgG二抗溶液（1︰200）孵育來標記神經元，異硫氰酸熒光素標記的鬼筆環(huán)肽溶液標記F-actin。室溫避光孵育后，激光共聚焦顯微鏡觀察F-actin陽性染色情況。用Image Pro Plus 6.0計算每視野下單位面積內F-actin陽性染色的平均光密度值。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測血腫周圍組織RhoA/ROCK通路相關蛋白和促神經元及突觸生長相關蛋白表達 取冰凍血腫周圍組織，4 ℃解凍后，機械粉碎及勻漿處理后提取勻漿液中蛋白。BCA法測濃度后，取40 μg蛋白行電泳及轉膜反應，4 ℃滴加兔源RhoA（1︰200）、ROCK（1︰200）、F-actin（1︰200）、p-cofilin（1︰200）、cofilin（1︰200）、SYP（1︰400）、PSD-95（1︰400）、NT3（1︰400）、NGF（1︰400）及β-actin（1︰800）一抗孵育過夜，滴加羊抗兔IgG二抗（1︰1 300）孵育1.5 h。添加化學發(fā)光劑顯色，化學發(fā)光儀拍照。Image J軟件分析蛋白條帶的相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件分析數據，計量資料以均數±標準差[（[x] ±s）

]表示，多組間比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 假手術組、模型組、杜仲葉總黃酮組、RhoA抑制劑組、RhoA激動劑組、杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠的神經功能缺損評分分別為0分、（10.17±1.03）分、（4.98±0.45）分、（5.04±0.51）分、（14.79±1.37）分、（10.09±0.97）分，除假手術組外的5組比較差異有統(tǒng)計學意義（n=20，F(xiàn)=391.139，P＜0.01）。假手術組大鼠活動靈敏，飲食及精神狀態(tài)正常；與假手術組相比，模型組大鼠精神萎靡，行動遲緩及跛行嚴重，神經功能缺損評分升高（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠行動遲緩、跛行緩解，神經功能缺損評分降低（P＜0.05），RhoA激動劑組大鼠部分出現(xiàn)癱瘓現(xiàn)象，神經功能缺損評分進一步升高（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠神經功能缺損評分升高（P＜0.05）；與RhoA激動劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠神經功能缺損評分降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比比較 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比升高（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比降低（P＜0.05），RhoA激動劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比進一步升高（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比升高（P＜0.05）；與RhoA激動劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠腦組織含水量、腦血腫體積百分比降低（P＜0.05），見表1。

2.3 各組大鼠血腫周圍組織神經突觸結構損傷比較 假手術組大鼠突觸結構清晰，突觸小泡大小均勻，囊泡致密；模型組大鼠突觸結構輪廓不清，突觸小泡變形、破裂或融合明顯；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠可見部分完整突觸小泡，且小泡變形、破裂或融合等結構損傷較輕，RhoA激動劑組大鼠突觸結構損傷進一步加重；杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠突觸結構損傷較杜仲葉總黃酮組加重，見圖1。

2.4 各組大鼠血腫周圍組織神經元凋亡及骨架損傷比較 假手術組大鼠神經元染色均勻，僅有少量染成棕黃色的凋亡細胞，F(xiàn)-actin分布在整個神經元中；與假手術組相比，模型組可見黃棕色凋亡細胞染色加深，F(xiàn)-actin在神經元中分布減少，細胞形態(tài)及大小也發(fā)生變化，神經元凋亡率升高，F(xiàn)-actin陽性表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠神經元凋亡率降低，F(xiàn)-actin陽性表達升高，RhoA激動劑組大鼠神經元凋亡率升高，F(xiàn)-actin陽性表達降低（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠神經元凋亡率升高，F(xiàn)-actin陽性表達降低（P＜0.05）；與RhoA激動劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠神經元凋亡率降低，F(xiàn)-actin陽性表達升高（P＜0.05），見表2、圖2。

2.5 各組大鼠血腫周圍組織RhoA/ROCK通路蛋白表達比較 與假手術組相比，模型組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達升高，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達降低，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達升高，RhoA激動劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達升高，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達降低（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達升高，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達降低（P＜0.05）；與RhoA激動劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達降低，F(xiàn)-actin、p-cofilin/cofilin蛋白表達升高（P＜0.05），見圖3、表3。

2.6 各組大鼠血腫周圍組織促神經元及突觸生長相關蛋白表達比較 與假手術組相比，模型組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組相比，杜仲葉總黃酮組及RhoA抑制劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達升高，RhoA激動劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達進一步降低（P＜0.05）；與杜仲葉總黃酮組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達降低（P＜0.05）；與RhoA激動劑組相比，杜仲葉總黃酮+RhoA激動劑組大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95、SYP蛋白表達升高（P＜0.05），見圖4、表4。

3 討論

3.1 腦出血模型大鼠構建成功 腦出血后，血液中的細胞毒性成分可導致神經元損傷及凋亡，另外腦出血后形成的血腫壓迫周圍組織血管，也會導致腦水腫及神經系統(tǒng)損傷［11］。本研究用改良的二次注血法建立腦出血模型，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)行動遲緩、運動困難等神經功能缺損癥狀，且神經功能缺損評分、腦組織含水量、腦血腫體積百分比均顯著升高，血腫周圍組織神經元凋亡、神經突觸變形、破裂及融合等損傷嚴重，提示造模成功。

3.2 杜仲葉總黃酮促進腦出血大鼠的神經功能修復 近年來研究發(fā)現(xiàn)，天然總黃酮類成分對各種腦損傷后神經功能的修復有促進作用［12-13］。杜仲葉中總黃酮為天然黃酮類成分，具有降壓、降脂及抗氧化等多種藥理作用［14］。已有研究發(fā)現(xiàn)，其對鉛中毒所致的神經損傷有改善作用［15］。另有文獻顯示杜仲提取物可通過抑制炎性因子分泌改善大鼠腦缺血再灌注損傷［16］，說明其對腦部疾病有一定的治療作用。而且，包含杜仲在內的益氣復健湯對腦出血患者有明顯的治療效果［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉總黃酮干預治療腦出血大鼠后，大鼠神經功能缺損評分降低，血腫周圍組織神經元凋亡、神經突觸變性、破裂及融合等結構損傷現(xiàn)象明顯緩解，表明杜仲葉總黃酮對腦出血后神經功能修復有一定的促進作用。本研究對其促神經功能修復的具體機制繼續(xù)進行探究。

3.3 RhoA/ROCK通路介導杜仲葉總黃酮的促腦出血后神經功能修復作用 RhoA/ROCK通路是參與神經元再生、神經突觸重塑，介導神經功能修復的關鍵通路之一［18-19］。Li等［20］研究證實，阻斷RhoA/ROCK通路活化，可減輕神經樹突、軸突的生長抑制作用，促進神經再生及軸突發(fā)芽，促進神經的內在修復，改善腦卒中模型大鼠運動功能的缺損。本研究發(fā)現(xiàn)腦出血模型大鼠RhoA/ROCK通路處于活化狀態(tài)，其表現(xiàn)為血腫周圍組織RhoA、ROCK蛋白表達升高，與張昆侖等［21］的研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，阻斷腦出血大鼠RhoA/ROCK通路活化，可促進神經功能修復，改善出血癥狀，反之可加重腦出血癥狀，不利于神經元功能恢復。而杜仲葉總黃酮干預后，大鼠血腫周圍組織中RhoA/ROCK通路處于抑制狀態(tài)，其腦出血癥狀及神經功能損傷得以改善，而在杜仲葉總黃酮干預的基礎上激活RhoA/ROCK通路后，其改善腦出血癥狀、促進神經功能恢復作用被顯著削弱，提示杜仲葉總黃酮可能通過抑制RhoA/ROCK通路活化來改善腦出血模型大鼠的腦出血癥狀、促進神經功能恢復。

大量研究證實，RhoA在神經元發(fā)育、遷移及可塑性中發(fā)揮重要作用，RhoA不僅可激活效應分子ROCK，引起細胞骨架解聚成分cofilin活化并切割F-actin，導致細胞骨架解聚破壞及重排、肌絲收縮，造成神經元及突觸結構改變、生長錐塌陷、軸突再生困難，還能夠影響神經元及突觸生長、發(fā)育相關的因子，如NGF、NT3、PSD-95及SYP等表達來抑制神經元及突觸的再生修復［22-23］。本研究顯示，杜仲葉總黃酮可顯著提高腦出血大鼠血腫周圍組織NGF、NT3、PSD-95及SYP蛋白表達，激活RhoA/ROCK通路可使杜仲葉總黃酮對NGF、NT3、PSD-95及SYP蛋白表達的促進作用得以緩解，提示杜仲葉總黃酮可能通過抑制RhoA/ROCK通路增加促神經元及突觸生長相關蛋白表達，進而減輕腦出血癥狀，加速神經功能恢復。

綜上所述，杜仲葉總黃酮可抑制RhoA/ROCK通路活化，從而改善腦出血大鼠的出血癥狀，促進神經功能修復。這為杜仲葉總黃酮在腦損傷領域的開發(fā)應用提供了一定參考，但信號通路對神經功能修復的調控是一個極其復雜的過程，可能需要機體內多條細胞信號通路來協(xié)同調節(jié)，杜仲葉總黃酮促進神經功能修復的其他機制還有待深入探究。

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（2022-07-12收稿 2022-09-25修回）

（本文編輯 李鵬）