龔 倩, 黎 東, 李 郁, 羅彩東

(四川省綿陽市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科, 四川 綿陽 621000)

心力衰竭(heart failure,HF)是各種心臟功能或結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致心室射血或充盈能力受損的心臟疾病,發(fā)病率高,發(fā)達(dá)國(guó)家成年人HF的患病率約2%,≥75歲人群HF患病率在10%以上,終生風(fēng)險(xiǎn)約20%[1]。射血分?jǐn)?shù)降低性心力衰竭(heart failure with reduced ejection fraction,HFrEF)是由缺血或其他損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞喪失的結(jié)果,且伴有心肌重塑[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類穩(wěn)定的、小的非編碼RNA,長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸,是人體內(nèi)正?；虮磉_(dá)的產(chǎn)物,在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[3]。miRNA已被證實(shí)參與HF的病理過程,且在人體循環(huán)中存在的形式非常穩(wěn)定,因而開啟了外周血循環(huán)miRNA作為心血管疾病生物學(xué)標(biāo)志物的可能性[4]。本研究檢測(cè)HF患者血循環(huán)中的miRNA-208a表達(dá)水平,以分析探討其在診斷HFrEF中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2021年1月至2022年12月我院心血管內(nèi)科收治的120例HF患者,其中HFrEF患者56例納入HFrEF組,非HFrEF患者64例納入非HFrEF組。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《中國(guó)HF診斷和治療指南2018》[5]中HF的診斷標(biāo)準(zhǔn);②有心臟病病史,存在氣短、乏力、端坐呼吸、運(yùn)動(dòng)耐量下降、夜間陣發(fā)性呼吸困難、雙側(cè)踝部水腫及勞力性呼吸困難等癥狀;經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢查[氨基末端腦鈉肽前體(amino-terminal probrain natriuretic peptide,NT-proBNP)>125pg/mL]、臨床檢查(6min步行試驗(yàn)<450m)及超聲心動(dòng)圖檢查[左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)<40%]確診為HF;③年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn):①孕婦或哺乳期女性;②有家族性或先天性心臟病史;③長(zhǎng)期服用激素、糖尿病;④合并重要臟器嚴(yán)重受損;⑤并發(fā)心肌炎、心肌梗死等疾病;⑥認(rèn)知功能障礙;⑦感染類、血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病;⑧精神疾病、惡性腫瘤。HFrEF組年齡47～72歲,平均年齡(63.69±5.57)歲;男35例,女21例。非HFrEF組年齡48～73歲,平均年齡(63.91±4.32)歲;男40例,女24例。另選取同期同齡體檢者(無氣促、胸悶、胸痛史,無HF等疾病)60例為對(duì)照組。年齡45～70歲,平均年齡(64.07±4.59)歲;男37例,女23例。三組人群年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)綿陽市中心醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(S20200434-01),入組人群均自愿參與并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑:超凈工作臺(tái)(蘇州蘇信凈化設(shè)備廠),低溫高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司,型號(hào):TGL-18M),超聲診斷儀(荷蘭飛利浦,型號(hào):EPIQ7C),逆轉(zhuǎn)錄儀(德國(guó)Eppendorf公司),RT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad IQ5),紫外分光光度計(jì)(Thermo fisher),電化學(xué)發(fā)光儀(羅氏,型號(hào):C601)。miRcute miRNA Isolation Kit(DP501)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司,miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司,miRcute miRNA qPCR Detection kit購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司,人類miRNA-208a引物、U6較準(zhǔn)品、人類U6引物購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1血液標(biāo)本收集和保存:使用EDTA抗凝管收集所有受檢者空腹(>12h)靜脈血6mL,靜置1h,4℃,3000r/min離心10min,取上清液繼續(xù)離心,4℃,12000r/min離心10min,收集上清液于-80℃低溫冷凍保存。

1.3.2心功能測(cè)定:患者平臥且平靜呼吸,應(yīng)用超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能指標(biāo),包括:LVEF、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fraction shortening,LVFS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左心房直徑(left atrial diameter,LAD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)、舒張末期室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST),左心室質(zhì)量(left ventricular mass,LVM)(g)=0.832[(LVEDD+IVST+ LVPWT)3-LVEDD3]+0.6;體表面積(body surface area,BSA)=0.0061×身高(cm)+0.0128×體質(zhì)量(kg)-0.1529;左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index,LVMI)(g/m2)=LVM/BSA。所有受檢者超聲心動(dòng)圖檢查由至少2名經(jīng)驗(yàn)豐富的影像科醫(yī)師完成。

1.3.3RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA-208a、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA。

1.3.3.1檢測(cè)前準(zhǔn)備:①提前將超凈工作臺(tái)消毒,槍頭高壓滅菌,準(zhǔn)備好各種實(shí)驗(yàn)儀器;②將待檢測(cè)血液標(biāo)本取出,室溫融化;③按照試劑盒說明書配好各個(gè)濃度的試劑。

1.3.3.2總RNA的提取:miRNA常溫下較容易分解成18～25個(gè)核苷酸組成的單鏈,由于分子量相對(duì)較小,導(dǎo)致傳統(tǒng)Trizol法提取總RNA較困難,故本實(shí)驗(yàn)采用的是天根生化科技(北京)有限公司反復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的,專門用于提取miRNA的試劑盒(miRcute miRNA Isolation Kit)進(jìn)行總RNA的提取,Nanodrop測(cè)定總RNA濃度并進(jìn)行純度評(píng)估,使用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA純度和完整性,而后立即進(jìn)行下一步檢測(cè),或存于-80℃冰箱中待測(cè)。

1.3.3.3總miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:miRNA分子鏈較短,故對(duì)3＇末端進(jìn)行poly(A)修飾以延長(zhǎng)其長(zhǎng)度,提高逆轉(zhuǎn)錄效率。提取4μL的中RNA按說明書配置反應(yīng)液:Total RNA 4μL+E.coli Polymerase(5U/μL) 0.4μL +10×Poly(A) Polymerase Buffer 2μL + 5×rATP Solution 4μL +RNase-Free ddH2O 9.6μL,混勻反應(yīng)液,離心15s,37℃下充分反應(yīng)1h;去上述反應(yīng)液2μL,配置反應(yīng)液:Poly(A)反應(yīng)液 2μL + 10×RT Primer2μL +10×RT Buffer 2μL + Super Pure dNTPs(2.5mM each) 1μL + RNasin(40U/μL) 1μL + Quant RTase 0.5μL + RNase-Free ddH2O 9.6μL,混勻反應(yīng)液,離心15s,37℃下充分反應(yīng)1h進(jìn)行cDNA合成。

1.3.3.4熒光定量檢測(cè):從miRBase網(wǎng)站http://www.mirbase.org/查詢得到miRNA-208a的核苷酸序列信息(見圖1),miRNA-208a、β-MHC及U6引物序列購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司,miRNA-208a引物:sense 5'-GTCAGTTTGTCAAATACC-3',antisense 5'GAGCAGGCTGGAGAATAG3';β-MHC引物:sense 5'- TGGAGTACAAAAAGCTGCTG- GAACG-3',antisense 5'-AGCTCAGCATTCATCTTCC-3';U6引物:sense 5'- ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3';antisense 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。按說明書配置總反應(yīng)液:2×miRcute miRNA Premix(with SYBR & ROX)10μL + Reverse Primer(10uM)0.4μL + RNase-FreeddH2O 8.2μL,配置33份反應(yīng)液,取18.6μL分裝入4排8聯(lián)管,各排加入上述反應(yīng)合成的cDNA,第一、二排用于檢測(cè)miRNA-208a,第三、四排用于檢測(cè)內(nèi)參U6,第一、二排加入miRNA-208a引物,第三、四排加入U(xiǎn)6引物。混勻上述反應(yīng)液進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件設(shè)定:起始模板變性:1×(94℃,2min);PCR循環(huán)中變性、退火、延伸反應(yīng)條件:45個(gè)循環(huán)×(94℃,20s;60℃,34s)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次,待反應(yīng)結(jié)束后,導(dǎo)出數(shù)據(jù)進(jìn)行CT值處理。以U6作為內(nèi)參,miRNA-208a含量采用2-△△CT法進(jìn)行計(jì)算,[△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組-△CT對(duì)照組=(CTmiRNA-208a-CTU6)實(shí)驗(yàn)組-(CTmiRNA-208a-CTU6)對(duì)照組]。

圖1 miRNA-208a的核苷酸序列

1.3.4血清NT-proBNP測(cè)定:采用電化學(xué)發(fā)光儀及羅氏診斷有限公司提供的配套試劑盒,嚴(yán)格按試劑盒說明書操作,測(cè)定血清NT-proBNP水平。

2 結(jié) 果

2.1三組基線特征比較:三組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、NYHA心功能分級(jí)、吸煙、高血壓、高血脂癥、糖尿病、收縮壓、舒張壓、肌酐比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);三組高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、總膽固醇比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HFrEF組、非HFrEF組低密度脂蛋白、甘油三酯、總膽固醇均明顯高于對(duì)照組(P<0.05),高密度脂蛋白均明顯低于對(duì)照組(P<0.05);HFrEF組與非HFrEF組高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、總膽固醇比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組基線特征比較

2.2三組心功能指標(biāo)比較:三組LVEF、LVFS、LAD、LVMI比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HFrEF組和非HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于對(duì)照組,而LAD、LVMI均明顯高于對(duì)照組(P<0.05);HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于非HFrEF組,LAD、LVMI均明顯高于非HFrEF組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組心功能指標(biāo)比較

2.3三組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHCmRNA表達(dá)量比較:三組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達(dá)量比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HFrEF組和非HFrEF組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組,HFrEF組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達(dá)量均明顯高于非HFrEF組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組血清NT-proBNP及miRNA-208a β-MHC mRNA表達(dá)量比較

2.4miRNA-208a表達(dá)量與心功能指標(biāo)Spearman相關(guān)分析:三組miRNA-208a表達(dá)量與LVEF、LVFS呈負(fù)相關(guān),與LAD、LVMI、NT-proBNP及β-MHC mRNA呈正相關(guān),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 miRNA-208a表達(dá)量與心功能指標(biāo)Spearman相關(guān)分析

2.5miRNA-208a對(duì)HFrEF的診斷價(jià)值:miRNA-208a診斷HFrEF的曲線下面積(AUC)為0.757,最佳截?cái)嘀禐?.19,約登指數(shù)為0.417,敏感度為89.29,特異度為52.42%。血清NT-proBNP、miRNA-208a及β-MHC mRNA三者聯(lián)合診斷的AUC為0.996,最佳截?cái)嘀禐?.592,約登指數(shù)為0.956,敏感度為96.43%,特異度為99.19%。見表5、圖2。

表5 miRNA-208a對(duì)HFrEF的診斷價(jià)值

圖2 NT-proBNP、miRNA-208a及β-MHC mRNA聯(lián)合的ROC曲線

3 討 論

根據(jù)LVEF可將HF分為HFrEF、LVEF中間狀態(tài)的HF、LVEF保留的HF(heart failure with preserved ejection fraction,HFPEF),其中LVEF保留的HF的發(fā)病率最高,而HFrEF的死亡率更高,因此,HFrEF的診斷具有重要的臨床意義[6-7]。隨著NT-proBNP水平的升高,心血管事件發(fā)生率明顯增高,在HF診斷和治療中NT-proBNP扮演重要角色,NT-proBNP亦是目前診斷HFrEF應(yīng)用最廣的血清指標(biāo),在眾多國(guó)家HF指南中給出了明確的診斷臨界值[8]。肌球蛋白是由α-MHC、β-MHC 2條重鏈和4條輕鏈組成的重要的心肌收縮蛋白,α-MHC和β-MHC表達(dá)產(chǎn)物有3種二聚體(V1型、V2型、V3型),其中V1型收縮活性最強(qiáng),V3型最弱。心肌肥厚時(shí),α-MHC的表達(dá)水平下降,β-MHC的表達(dá)水平上升,表達(dá)產(chǎn)物由V1型轉(zhuǎn)化為V3型,心肌收縮力減弱,而這一過程受多種miRNAs調(diào)控。

循環(huán)miRNAs是Mitchell P S等[9]于2008年研究發(fā)現(xiàn)的,可穩(wěn)定存在于尿液、羊水、血液(如血清、紅細(xì)胞、血漿、血小板)等體液中,且不會(huì)被內(nèi)源性RNA聚合酶降解。血液中含有RNA降解酶,但血液中的miRNAs對(duì)其耐受,可穩(wěn)定存在,同時(shí)miRNAs在室溫、凍融、反復(fù)煮沸、強(qiáng)堿、強(qiáng)酸條件下仍可保持穩(wěn)定,為體外試驗(yàn)奠定有利條件。miRNAs的特征表達(dá)模式與病理性心肌肥厚、心力衰竭和心肌梗死密切相關(guān),循環(huán)血中存在大量成熟的miRNAs,心肌受損后,因心肌細(xì)胞異常而產(chǎn)生的miRNAs被釋放入血,對(duì)HF患者檢測(cè)相關(guān)miRNAs表達(dá)水平,有助于實(shí)現(xiàn)HF的早期預(yù)防和診斷[10]。近來報(bào)道,心力衰竭引起的心肌損傷可以引起多種miRNA(miRNA-19a、miRNA-19b、miR-1、miR-208、miR-133等)在血液循環(huán)中的表達(dá)水平發(fā)生變化。JinL[11]的研究發(fā)現(xiàn),心力衰竭小鼠miRNA-19a/19b特異性表達(dá),其與受損心肌的再生和修復(fù)密切相關(guān)。miR-208是一種編碼在Myh6基因內(nèi)含子內(nèi)的miRNA,它調(diào)節(jié)心臟應(yīng)激反應(yīng)。小鼠中miR-208的基因缺失未能誘導(dǎo)一種在基線時(shí)的顯性表型,對(duì)幾種形式的心臟壓力做出反應(yīng),miR-208-null小鼠幾乎沒有心肌細(xì)胞肥大或纖維化上調(diào)Myh7表達(dá)。在成人心臟中,miR-208不僅對(duì)Myh7的表達(dá)至關(guān)重要,而且對(duì)與之相關(guān)的肌球蛋白亞型Myh7b的表達(dá)也至關(guān)重要[12]。值得注意的是,這兩個(gè)基因都編碼肌球蛋白,并含有內(nèi)含子miRNA(分別為miR-208b和miR-499),miR-208a、miR-208b和miR-499是由肌球蛋白基因產(chǎn)生的相關(guān)miRNA,這些miRNA統(tǒng)稱為MyomiR,miR-208a的基因缺失會(huì)降低成年心臟中Myh7b/miR-499的表達(dá)[13]。miRNA對(duì)心臟功能和功能障礙的重要性表明,在心臟病的背景下,有可能在診斷和治療上利用miRNA的生物學(xué)特性[14]。

本研究中比較了HFrEF、非HFrEF患者和對(duì)照組的心功能,發(fā)現(xiàn)三組LVEF、LVFS、LAD、LVMI存在明顯差異,HFrEF組和非HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于對(duì)照組,而LAD、LVMI均明顯高于對(duì)照組;HFrEF組LVEF、LVFS均明顯低于非HFrEF組,LAD、LVMI均明顯高于非HFrEF組。三組血清NT-proBNP及miRNA-208a、β-MHC mRNA表達(dá)量存在明顯差異,三組miRNA-208a表達(dá)量與LVEF、LVFS呈負(fù)相關(guān),與LAD、LVMI、NT-proBNP及β-MHC mRNA呈正相關(guān)。miRNA-208a診斷HFrEF的曲線下面積(AUC)為0.757,最佳截?cái)嘀禐?.19,約登指數(shù)為0.417,敏感度為89.29,特異度為52.42%。血清NT-proBNP、miRNA-208a及β-MHC mRNA三者聯(lián)合診斷的AUC為0.996,最佳截?cái)嘀禐?.592,約登指數(shù)為0.956,敏感度為96.43%,特異度為99.19%。因此,我們認(rèn)為miRNA-208a可作為診斷HFrEF的生物學(xué)標(biāo)志物,與NT-proBNP、β-MHC mRNA聯(lián)合應(yīng)用診斷效能更佳。