馬 翾, 劉 洋, 劉娟娟, 田 浩, 李 杰

(1.三峽大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院/宜昌市第二人民醫(yī)院腫瘤外科中心, 湖北 宜昌 443000 2.湖北省第三人民醫(yī)院腫瘤科, 湖北 武漢 430030)

肺癌是全球最常見的惡性疾病之一,其發(fā)病率和死亡率高,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是其主要病理類型,約占肺癌的80%[1-2]。關(guān)于NSCLC的治療,目前以外科手術(shù)、放化療等為主,分子靶向治療雖然取得了明顯的進(jìn)步,但仍是當(dāng)前研究的難點[3-4]。因此,需進(jìn)一步探索潛在的治療靶點,為NSCLC的治療提供新思路。長鏈非編碼RNA(lncRNA)對多種癌癥的生物學(xué)進(jìn)程具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01194在肝細(xì)胞癌、前列腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌中異常高表達(dá),并能促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[5-6]。Xing等[7]研究結(jié)果顯示,lncRNA LINC01194在NSCLC組織和細(xì)胞中高表達(dá),并通過調(diào)節(jié)miR-486-5p/CDK4軸促進(jìn)NSCLC的增殖和遷移,但在NSCLC中的作用仍需進(jìn)一步研究。經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示,lncRNA LINC01194與miR-302e存在靶向關(guān)系,miR-302e在多數(shù)腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。研究顯示,miR-302e在NSCLC中異常低表達(dá),其降低與侵襲性、不良預(yù)后密切相關(guān),過表達(dá)miR-302e明顯抑制NSCLC增殖[8]。推測lncRNA LINC01194可能通過調(diào)節(jié)miR-302e影響NSCLC的發(fā)生發(fā)展。因此,本研究主要探究lncRNA LINC01194對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響,以期為NSCLC的靶向治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集和細(xì)胞來源:收集2022年1月至2022年12月在我院手術(shù)治療并經(jīng)病理明確診斷為NSCLC新發(fā)病例的18對新鮮肺癌組織、癌旁組織,標(biāo)本迅速放置液氮內(nèi)冷凍保存。所有入組患者術(shù)前均未接受任何化療、放療、靶向治療及免疫治療等,且簽署了知情同意書,本研究獲得本院倫理委員會的批準(zhǔn)。人肺正常上皮細(xì)胞BEAS-2B及人NSCLC細(xì)胞系NCI-H1975、A549、H1299、H460購于美國ATCC。

1.2主要試劑與儀器:MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒(M1020)北京solarbio;實時熒光定量PCR試劑盒(11184ES03)上海Yeasen;兔源一抗PCNA、Bax、Bcl-2、MMP-2、GAPDH(ab152112、ab182733、ab203516、ab37150、ab9485)以及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗IgG(ab6721)美國Abcam公司;多功能酶標(biāo)儀(LD-96A)山東萊恩德智能科技有限公司;實時熒光定量PCR儀(QuantStudio 7 Flex)美國ABI;光學(xué)顯微鏡(CX31)日本olympus;流式細(xì)胞儀(NOVOCYTE3130)美國艾森公司。

1.3方 法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:將BEAS-2B、NCI-H1975、A549、H1299、H460接種至DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)48h后,檢測細(xì)胞lncRNA LINC01194、miR-302e表達(dá)水平。取對數(shù)生長期的NCI-H1975細(xì)胞,按照1.2×106個接種于6孔板中,使用轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,根據(jù)質(zhì)粒將細(xì)胞分為control組、si-NC組、si-LINC01194組、si-LINC01194+anti-miR-NC組、si-LINC01194+anti-miR-302e組,轉(zhuǎn)染48h后檢驗轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2qRT-PCR檢測lncRNA LINC01194、miR-302e表達(dá):提取組織和細(xì)胞的總RNA、反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板配置qRT-PCR反應(yīng)體系。lncRNA LINC01194上游引物:5'-AGGCCTGACACGTTTACTAA-3'和下游引物:5'-AGGCCTGACACGTTTACTAA-3';miR-302e上游引物:5'-CTCATCGCATAAGTGCTTCCAT-3'和下游引物:5'-TATCGTTGTTCTCGACTCCTTCAC-3';GAPDH上游引物:5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'和下游引物:5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3';U6上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和下游引物:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';qRT-PCR反應(yīng)體系:SYBR?Green PCR Master Mix 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、cDNA模板1μL、ddH2O 7μL;qRT-PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性1min,95℃變性5s、56℃退火10s、72℃延伸30s、40個循環(huán)。lncRNA LINC01194、miR-302e分別以GAPDH、U6為內(nèi)參,以2-ΔΔCT法計算組織和各組細(xì)胞中相對表達(dá)量。

1.3.3細(xì)胞增殖檢測:各組細(xì)胞在96孔板上接種,濃度為1×104個/孔,設(shè)6個復(fù)孔。隨后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)24、48、72h后每孔加入20μL MTT溶液。繼續(xù)培養(yǎng)4h每孔再加入150μL的二甲基亞砜,在酶標(biāo)儀上于490nm波長處檢測各孔的OD值。收集培養(yǎng)結(jié)束的各組細(xì)胞,接種在6孔板(1×103個/孔)中,培養(yǎng)10d,期間及時更換培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,并用結(jié)晶紫染色,水洗,干燥、計數(shù)細(xì)胞數(shù)>50個的克隆數(shù)。

1.3.4細(xì)胞遷移與侵襲實驗:轉(zhuǎn)染后的NCI-H1975細(xì)胞生長至對數(shù)期時,使用涂有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室進(jìn)行侵襲實驗,遷移實驗未涂有Matrigel基質(zhì)膠,各組細(xì)胞取200μL(2×105)細(xì)胞懸液加入上室,下室加入600μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h,固定染色,顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.5細(xì)胞凋亡檢驗:首先收集各組細(xì)胞,然后用預(yù)冷過的PBS沖洗2次,隨后加入100μL 1×結(jié)合緩沖液進(jìn)行重懸,最后加入5μL的Annexin V-FITC和PI染液,充分混勻。在室溫下遮光染色15min,最后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.6PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白檢測:采用Western blot法檢測PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá),PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2及GAPDH一抗稀釋液按照1∶1500稀釋,HRP標(biāo)記的二抗按照1∶1000稀釋,實驗結(jié)束后,以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J軟件分析各蛋白表達(dá)。

1.3.7雙熒光素酶活性檢測:分別構(gòu)建含有l(wèi)ncRNA LINC01194野生型(wt)與突變型(mut)表達(dá)載體,將突變位點克隆至PmirGLO載體,將lncRNA LINC01194-wt、lncRNA LINC01194-mut分別與miR-NC、miR-302e mimics共轉(zhuǎn)染NCI-H1975細(xì)胞48h,熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測相對熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1LINC01194、miR-302e在組織和細(xì)胞中的表達(dá):與癌旁組織比較,NSCLC組織中LINC01194表達(dá)水平升高,miR-302e表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=39.949、29.498,P<0.05)見表1;與BEAS-2B細(xì)胞比較,LINC01194在NCI-H1975、A549、H1299、H460表達(dá)水平顯著升高,miR-302e表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=224.901、261.531,P<0.05),且在NCI-H1975細(xì)胞中LINC01194表達(dá)水平最高,miR-302e表達(dá)水平最低,選擇NCI-H1975細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗,見圖1。

圖1 LINC01194、miR-302e在細(xì)胞中的表達(dá)

表1 LINC01194 miR-302e在組織中的表達(dá)

2.2敲低LINC01194對NCI-H1975細(xì)胞中LINC01194、miR-302e表達(dá)的影響:與si-NC組比較,si-LINC01194組NCI-H1975細(xì)胞中LINC01194表達(dá)水平降低,miR-302e表達(dá)水平升高;與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細(xì)胞miR-302e表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=151.274、75.012,P<0.05),見圖2。

圖2 各組NCI-H1975細(xì)胞中LINC01194、miR-302e的表達(dá)比較

2.3敲低LINC01194對NCI-H1975細(xì)胞增殖能力的影響:與si-NC組比較,si-LINC01194組NCI-H1975細(xì)胞OD490值、集落形成數(shù)顯著降低(P<0.05);與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細(xì)胞OD490值、集落形成數(shù)顯著升高(P<0.05),見圖3和表2。

圖3 各組細(xì)胞集落形成數(shù)比較

表2 各組NCI-H1975細(xì)胞OD490值集落形成數(shù)比較

2.4敲低LINC01194對NCI-H1975細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響:與si-NC組(173.58±9.26)個、(136.94±8.35)個比較,si-LINC01194組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)(67.98±8.15)個、(56.31±7.25)個顯著降低;與si-LINC01194+anti-miR-NC組(69.32±8.37)個、(58.96±7.78)個比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)(135.48±8.92)個、(117.62±7.67)個顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=206.148、162.852,P<0.05),見圖4、圖5。

圖4 各組細(xì)胞遷移與侵襲情況比較(100×)

圖5 各組NCI-H1975細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)比較

2.5敲低LINC01194對NCI-H1975細(xì)胞凋亡的影響:與si-NC組(6.72±1.48)%比較,si-LINC01194組NCI-H1975細(xì)胞凋亡率(47.85±4.46)%顯著升高;與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較(45.92±4.38)%,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細(xì)胞凋亡率(17.69±2.45)%顯著降低(F=259.881,P<0.05),見圖6、圖7。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

圖7 各組NCI-H1975細(xì)胞凋亡率比較

2.6敲低LINC01194對PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響:與si-NC組比較,si-LINC01194組NCI-H1975細(xì)胞PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低,Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高;與si-LINC01194+anti-miR-NC組比較,si-LINC01194+anti-miR-302e組NCI-H1975細(xì)胞PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=269.263、126.999、151.765、212.684,P<0.05),見圖8、圖9。

圖8 Western blot檢測細(xì)胞中PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

圖9 各組NCI-H1975細(xì)胞中PCNA、MMP-2、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

2.7LINC01194與miR-302e靶向關(guān)系驗證:經(jīng)starBase在線分析顯示,LINC01194與miR-302e存在靶向結(jié)合位點,見圖10;雙熒光素酶實驗顯示,LINC01194-wt與miR-302e mimics共轉(zhuǎn)染NCI-H1975細(xì)胞后,與miR-NC比較,相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見圖11。

圖10 LINC01194與miR-302e的結(jié)合位點與突變位點

圖11 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果

3 討 論

LncRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,可作為癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用,從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長增殖等行為。lncRNA LINC01194可作為關(guān)鍵的癌基因并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01194在結(jié)直腸癌中作為癌基因,通過激活上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力,與不良生存結(jié)果相關(guān)[9]。lncRNA LINC01194在癌組織和癌細(xì)胞中高表達(dá),并通過調(diào)控miR-655-3p/SMAD、miR-486-5p/GOLPH3、miR-655/SOX18促進(jìn)肝細(xì)胞癌、前列腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展,抑制lncRNA LINC01194表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。Meng等[10]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01194通過靶向miR-641/SETD7軸促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。以上研究表明,lncRNA LINC01194在結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌等腫瘤中具有致癌作用。本研究發(fā)現(xiàn),lncRNA LINC01194在NSCLC組織中和NCI-H1975、A549、H1299、H460細(xì)胞中高表達(dá),抑制lncRNA LINC01194表達(dá)可顯著抑制NCI-H1975細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,降低NCI-H1975細(xì)胞中PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達(dá)水平,提高Bax蛋白表達(dá)水平、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示lncRNA LINC01194在NSCLC中同樣發(fā)揮抑癌基因的作用,與前人研究結(jié)果一致。

lncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA或miRNA"海綿"來調(diào)節(jié)腫瘤中關(guān)鍵基因,從而發(fā)揮腫瘤抑制或腫瘤促進(jìn)功能。本研究通過生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報告實驗證實miR-302e可與lncRNA LINC01194靶向結(jié)合。miR-302e被證明是一種腫瘤抑制因子,在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中下調(diào)表達(dá),過表達(dá)miR-302e可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,但促進(jìn)細(xì)胞凋亡,CXCL1被確定為miR-302e的直接靶標(biāo),CXCL1可以逆轉(zhuǎn)miR-302e對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響[11]。VEGFA是血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和存活因子,可以通過誘導(dǎo)血管生成和激活基質(zhì)金屬蛋白酶來增強(qiáng)細(xì)胞侵襲,并提高細(xì)胞活力,在卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤中過度表達(dá),而miR-302e可靶向下調(diào)VEGFA的表達(dá),抑制卵巢癌的發(fā)展[12]。miR-302e靶向調(diào)節(jié)CDCA7表達(dá),調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[13]。本研究顯示,miR-302e在NSCLC組織和細(xì)胞中低表達(dá),抑制LINC01194可促進(jìn)NCI-H1975細(xì)胞中miR-302e表達(dá),而抑制miR-302e表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制lncRNA LINC01194表達(dá)對NCI-H1975細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用,及對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。推測抑制lncRNA LINC01194可能通過上調(diào)miR-302e表達(dá),從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,促進(jìn)其凋亡。

綜上所述,在NSCLC組織和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA LINC01194上調(diào)表達(dá),miR-302e下調(diào)表達(dá),抑制lncRNA LINC01194可通過上調(diào)miR-302e表達(dá),從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,促進(jìn)其凋亡。lncRNA LINC01194/miR-302e可能成為治療NSCLC的一種新靶點。然而本研究尚存在不足之處,僅驗證LncRNA LINC01194對NSCLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的作用,而未對其他靶點和通路進(jìn)行驗證,這些將是后續(xù)研究內(nèi)容。