尹皓云, 曹 陽(yáng), 張 婷, 范麗苑

(1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院, 四川 成都 610083 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院, 四川 瀘州 646000)

牙周炎是臨床常見(jiàn)的慢性炎癥性疾病之一,根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),全球范圍內(nèi)有超過(guò)50%的成年人患有不同程度的牙周炎,中國(guó)超過(guò)90%的成人口腔中有不同程度的牙周炎[1]。牙周炎患者臨床多表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙周附著、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)或移位等,是成年人牙齒丟失的關(guān)鍵因素。甲硝唑?yàn)榈头肿酉趸溥蝾愃幬?其在臨床被廣泛應(yīng)用于牙周炎的治療,具有不良反應(yīng)小、安全度高、藥物靶向作用強(qiáng)等特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),口腔厭氧菌的感染率較高,甲硝唑類藥物已成為口腔疾病如牙周病、根尖膿腫、冠周炎等抗厭氧菌感染的常規(guī)藥物之一[2]。羧甲基殼聚糖是一種可自體降解、生物相容性較好的天然多糖,其不僅自身具有一定的抗菌作用,且還因安全、無(wú)毒、無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)被臨床作為良好的口腔藥物載體廣泛應(yīng)用。目前已有研究發(fā)現(xiàn),甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠(metronidazole carboxymethyl chitosan topical gel,M/CMCS)可減弱牙周炎大鼠牙周組織的破骨細(xì)胞活動(dòng),但目前關(guān)于其對(duì)牙周炎大鼠牙槽骨丟失及TLR4/NF-κB信號(hào)的機(jī)制研究現(xiàn)有報(bào)道[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silencing information regulator 1,SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白質(zhì)去乙?；?在能量穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞應(yīng)激中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1可通過(guò)調(diào)控炎癥通路介導(dǎo)牙周炎的發(fā)生發(fā)展[4]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)的重要傳導(dǎo)通路之一,其可通過(guò)誘導(dǎo)核心腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)等炎性因子的產(chǎn)生,從而介導(dǎo)牙周炎的發(fā)生發(fā)展。因此本研究旨探究M/CMCS在治療慢性牙周炎大鼠牙槽骨丟失及SIRT1和TLR4/NF-κB信號(hào)通路的的變化情況。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:50只6周齡雄性SD大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量180g～220g,均購(gòu)自廣東來(lái)迪生物醫(yī)藥研究院有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)20220-0064。飼養(yǎng)大鼠動(dòng)物房?jī)?nèi)保持室溫22℃～24℃,相對(duì)濕度55%～65%,保證房間光照12h一循環(huán),晝夜交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑和儀器:人牙齦卟啉單胞菌(P.gingiualis)(美國(guó)ATCC公司);SIRT1特異性抑制劑EX527(武漢美德康生物技術(shù)有限公司);蘇木素、伊紅(武漢華美生物工程有限公司);TLR4、NF-κB p65、SIRT1抗體、山羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗(英國(guó)Abcam公司);ELISA試劑盒(武漢博士德生物公司);蛋白測(cè)定試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司);低速離心機(jī)(型號(hào):XL-200,海門其林貝兒儀器廠);超薄型切片機(jī)(型號(hào):EM-UC6,德國(guó)徠卡公司)。

1.3藥物:甲硝唑羧甲基殼聚糖復(fù)方溫敏凝膠:將甘油磷酸鈉混合溶解的甲硝唑加入到甲基殼聚糖溶液中,在4℃的環(huán)境中充分?jǐn)嚢?后將泊洛沙姆p407加入到混勻的溶液中,再次混勻后靜置,即可獲得甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠,其中含0.75%甲硝唑和20%羧甲基殼聚糖。0.75%甲硝唑凝膠(MNZ)購(gòu)自湖北康正藥業(yè)有限公司。

1.4分組及模型制備:將50只大鼠隨機(jī)分為5組,即空白組(NC組)、牙周炎大鼠模型組(Model組)、Model組基礎(chǔ)上給予M/CMCS組(M/CMCS組)、Model組基礎(chǔ)上給予甲硝唑凝膠組(MNZ組)、M/CMCS組基礎(chǔ)上給予白藜蘆醇特異性抑制劑EX527干預(yù)組(M/CMCS+EX527組),每組10只。除NC組外,其余各組大鼠參照參考文獻(xiàn)[5]采用牙周結(jié)扎法制備牙周炎模型,各組大鼠均腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2mL/kg)麻醉,將大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙的牙齦緣處結(jié)扎,并于腭側(cè)打結(jié)推至齦下,提前擴(kuò)增培養(yǎng)密度為1×109CFU/ml的ATCC 33277人牙齦卟啉單胞菌(P.gingiualis)標(biāo)準(zhǔn)菌株菌液200μL,各組造模大鼠上頜第一磨牙結(jié)扎絲線處齦溝內(nèi)用注射器環(huán)繞滴注,每日接種菌液1次,共接種3次;從實(shí)驗(yàn)當(dāng)天起即喂養(yǎng)黏性高糖飲食鼠料和水,共喂養(yǎng)6周。NC組大鼠不做任何處理。采用牙周臨床指標(biāo)檢查及牙槽骨吸收水平評(píng)價(jià)牙周炎模型是否成功建立。M/CMCS組大鼠在上頜第一磨牙牙齦緣處和牙周袋涂布甲硝唑羧甲基殼聚糖復(fù)方溫敏凝膠;MNZ組大鼠在上頜第一磨牙牙齦緣處和牙周袋涂布2%鹽酸米諾環(huán)素;M/CMCS+EX527組大鼠在上頜第一磨牙牙齦緣處和牙周袋涂布甲硝唑羧甲基殼聚糖復(fù)方溫敏凝膠,同時(shí)腹腔注射EX527 10mg/kg;NC組和Model組大鼠結(jié)扎牙的牙周不涂布任何藥物;各組大鼠每日早晚各涂布1次,共干預(yù)5周,EX527腹腔注射1次,共注射5周。

1.5檢測(cè)牙周組織臨床指標(biāo):藥物干預(yù)結(jié)束后,用肉眼觀察大鼠牙周組織變化,包括牙齦顏色、形狀和質(zhì)地,并用相機(jī)拍攝。記錄牙齦出血指數(shù)(bleeding index,BI)和牙周探針深度(probing depth,PD)(分別測(cè)量上頜第一磨牙頰腭側(cè)近中、中央和遠(yuǎn)中6個(gè)點(diǎn)深度,取均值)。

1.6ELISA檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β與TNF-α水平:采取眼球法取各組大鼠靜脈血1mL,以每分鐘3000r的速度離心,5min后收集生產(chǎn)呢過(guò)血清于EP管中,采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中炎性因子水平,即IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.7微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT):處死大鼠取上頜骨,去除皮膚和肌肉組織,用micro-CT掃描(70kVp、353μA電流,掃描層厚8μm),掃描結(jié)束后用CT Analyzer/CT Volume分析軟件進(jìn)行三維圖像重建,進(jìn)而評(píng)估各組大鼠牙槽骨丟失和組織損傷程度。計(jì)算各組大鼠扣除牙根后的骨體積及骨礦物質(zhì)密度(BMD,g/cm3)。計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)(%)=扣除牙根后的骨體積/總體積(BV/TV)。利用軟件計(jì)算得出釉-牙骨質(zhì)界(CEJ)至牙槽骨嵴(ABC)間的距離。

1.8HE染色檢測(cè)各組大鼠牙周組織病理學(xué)變化:取各組大鼠牙周組織,固定于4%多聚甲醛溶液,包埋盒包埋后流水沖洗固定液,脫水并透明組織,將透明的組織用石蠟包埋,用切片機(jī)切成厚度為5μm的薄片,用蘇木精水溶液染色切片,蒸餾水沖洗后酒精脫水,將切片用伊紅染色3min,將切片置于顯微鏡下觀察。

1.9蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)牙周組織中TLR4、NF-κB p65、SIRT1蛋白表達(dá):提取牙周組織中的總蛋白,用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。將蛋白溶液的終濃度配制為2μg/mL,將蛋白溶液置于熱水中煮沸10min,后保存在-20℃冰箱中。將30μg的蛋白樣品用200V電壓電泳,轉(zhuǎn)移蛋白樣品與PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h,將一抗(1∶500)加入到PVDF膜上,4℃孵育過(guò)夜;將PVDF膜沖洗干凈后加入二抗(1∶1000),室溫孵育2h。ECL放光液加入到細(xì)胞中,曝光顯影后用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠牙周組織臨床指標(biāo)比較:NC組大鼠未探及深牙周袋,探針無(wú)出血,牙齒無(wú)松動(dòng);Model組、M/CMCS組、PERIO組、M/CMCS+EX527組大鼠探診牙周袋較深且易出血,牙齒有明顯松動(dòng)。和NC組相比,Model組大鼠牙周探診深度(2.28±0.21)和牙齦出血指數(shù)(3.76±0.30)均明顯升高(t牙周探診深度=19.85,t牙齦出血指數(shù)=27.60,P<0.0001);和Model組相比,M/CMCS組(0.81±0.08)、(1.24±0.12)(t牙周探診深度=16.02,t牙齦出血指數(shù)=19.10,P<0.0001)和MNZ組(1.23±0.13)、(1.89±0.15)(t牙周探診深度=10.40,t牙齦出血指數(shù)=13.66,P<0.0001)大鼠牙周探診深度和牙齦出血指數(shù)均明顯降低,且M/CMCS組大鼠牙周探診深度和牙齦出血指數(shù)低于MNZ組(t牙周探診深度=6.740,t牙齦出血指數(shù)=8.288,P<0.0001);和M/CMCS組相比,M/CMCS+EX527組大鼠牙周探診深度(2.10±0.18)和牙齦出血指數(shù)(3.18±0.27)均明顯升高(t牙周探診深度=16.04,t牙齦出血指數(shù)=16.08,P<0.0001)(圖1)。

圖1 各組大鼠牙周組織臨床指標(biāo)比較

2.2各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較:Model組大鼠血清中TNF-α(234.05±11.62)、IL-1β(203.62±15.31)、IL-6(181.35±11.27)水平較NC組明顯升高(tTNF-α=36.66,tIL-1β=20.18,tIL-6=24.57,P<0.0001);M/CMCS組(75.81±7.54)、(93.21±8.15)、(76.81±6.32)和MNZ組(115.36±8.23)、(122.48±9.02)、(105.04±7.11)大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于Model組,且M/CMCS組明顯低于MNZ組(tTNF-α=7.680,P<0.0001;tIL-1β=5.210,tIL-6=6.408,P=0.0002);M/CMCS+EX527組大鼠血清中TNF-α(208.54±10.81)、IL-1β(191.25±12.37)、IL-6(173.26±10.04)水平高于M/CMCS組(tTNF-α=14.55,tIL-1β=9.486,tIL-6=11.67,P<0.0001)(圖2)。

圖2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.3各組大鼠牙槽骨吸收比較:和NC組相比,Model組大鼠CEJ-ABC(615.34±51.45)距離明顯增加,BMD(0.32±0.03)和BV/TV值(31.02±1.57)明顯降低(tCEJ-ABC=14.63,tBMD=9.327,tBV/TV=18.17,P<0.0001);和Model組相比,M/CMCS組(276.17±27.28)和MNZ組(361.35±30.94)大鼠CEJ-ABC距離明顯降低,BMD(0.54±0.05)、(0.42±0.05)和BV/TV值(45.91±2.06)、(39.87±2.41)明顯升高,且M/CMCS組CEJ-ABC距離短于MNZ組,BMD和BV/TV值高于MNZ組(tCEJ-ABC=5.058,P=0.0005;tBMD=4.157,P=0.0020;tBV/TV=4.667,P=0.0009);和M/CMCS組相比,M/CMCS+EX527組大鼠CEJ-ABC(601.82±50.29)距離明顯增加,BMD(0.35±0.04)和BV/TV值(35.62±1.64)明顯降低(tCEJ-ABC=13.94,tBMD=7.268,tBV/TV=9.572,P<0.0001)(圖3)。

圖3 各組大鼠牙槽骨吸收比較

2.4各組大鼠牙周組織病理學(xué)變化比較:和NC組相比,Model組大鼠牙周組織有明顯的袋狀牙周袋,且CEJ到ABC的距離明顯增加,牙槽骨有明顯的吸收;M/CMCS組和MNZ組大鼠牙周組織CEJ到ABC的距離明顯減少,且牙槽骨吸收較Model組有明顯改善,M/CMCS組改善效果好于MNZ組;M/CMCS組相比,M/CMCS+EX527組大鼠牙槽骨吸收顯著(圖4)。

圖4 各組大鼠牙周組織HE染色(×200)

2.5各組大鼠牙周組織中TLR4、NF-κB p65、SIRT1蛋白表達(dá)比較:和NC組相比,Model組大鼠牙周組織中TLR4(0.53±0.06)和NF-κB p65(0.75±0.08)蛋白表達(dá)明顯升高,SIRT1蛋白(0.21±0.03)表達(dá)明顯降低(tTLR4=14.72,tNF-κB p65=14.91,tSIRT1=15.25,P<0.0001);和Model組相比,M/CMCS組和MNZ組大鼠牙周組織中TLR4(0.21±0.03)、(0.28±0.03)和NF-κB p65(0.36±0.04)、(0.42±0.05)蛋白表達(dá)明顯降低,SIRT1蛋白(0.72±0.08)、(0.58±0.06)表達(dá)明顯升高,且M/CMCS組牙周組織中TLR4和NF-κB p65蛋白低于MNZ組,SIRT1蛋白表達(dá)高于MNZ組(tTLR4=3.429,P=0.0064;tNF-κB p65=2.295,P=0.0446;tSIRT1=3.429,P=0.0064);和M/CMCS組相比,M/CMCS+EX527組大鼠牙周組織中TLR4(0.50±0.05)和NF-κB p65蛋白(0.71±0.07)表達(dá)明顯升高,SIRT1蛋白(0.25±0.03)表達(dá)明顯降低(tTLR4=12.18,tNF-κB p65=10.63,tSIRT1=13.47,P<0.0001)(圖5)。

圖5 各組大鼠牙周組織中TLR4、NF-κB p65、SIRT1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

牙周炎不僅影響口腔功能,還作為糖尿病、心血管疾病、肝臟疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的危險(xiǎn)因素,對(duì)患者的生命健康造成嚴(yán)重的威脅。目前口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域認(rèn)為羧甲基殼聚糖具有抗菌、載藥緩解、再礦化、成骨和促進(jìn)傷口愈合等性能,且還具有抑制口腔內(nèi)重要厭氧菌生長(zhǎng),同時(shí)能作為骨傳導(dǎo)性物質(zhì)可以促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖,因此在骨組織、牙體及牙周組織再生等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用?，F(xiàn)已開發(fā)出多種多樣的制劑用于口腔治療,如殼聚糖及其衍生物制備的藥物控制緩釋材料、組織再生和骨替代、抗菌材料、牙科粘合劑。國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種羧甲基殼聚糖基抑菌凝膠不僅結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,且無(wú)細(xì)胞毒性和皮膚刺激性,可通過(guò)抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌增殖發(fā)揮抑菌作用[6]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[7],殼聚糖與其他天然化合物、金屬抗菌顆粒和抗生素進(jìn)行功能修飾時(shí)能顯現(xiàn)出更好的臨床療效。研究發(fā)現(xiàn),添加或不添加15%甲硝唑殼聚糖凝膠對(duì)慢性牙周炎患者的臨床療效均好于單一根面平整治療患者[8]。本研究結(jié)果顯示,M/CMCS組和MNZ組大鼠牙周探診深度、牙齦出血指數(shù)及CEJ-ABC距離明顯降低,BMD和BV/TV值升高,且M/CMCS組的治療效果明顯好于MNZ組,提示M/CMCS組可促進(jìn)慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建。陳東等[9]研究證實(shí),甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠對(duì)大鼠牙周炎有抗炎和抗牙槽骨吸收作用,其機(jī)制可能和降低齦溝液和牙周組織中IL-1β表達(dá)有關(guān)。炎癥反應(yīng)是牙周致病菌免疫反應(yīng)的主要組成部分,可通過(guò)調(diào)節(jié)牙槽骨代謝介導(dǎo)牙周組織病理改變。TLR4是研究較廣泛的炎癥信號(hào)通路,激活的TLR4信號(hào)通路可磷酸化和髓樣細(xì)胞分化蛋白88(MyD88)的C末端鏈接形成的復(fù)合體,從而激活NF-κB并使其處于游離狀態(tài)的NF-κB p65,NF-κB p65可通過(guò)進(jìn)入到炎性細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)下游IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放,進(jìn)而通過(guò)正反饋反應(yīng)進(jìn)一步活化NF-κB,使炎癥因子持續(xù)釋放。TLR4/NF-κB信號(hào)通路下游炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α等與破骨細(xì)胞分布具有一致性,當(dāng)炎癥因子大量釋放時(shí)會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞的增加,從而引發(fā)炎癥性骨吸收而不利于正畸牙健康且高效移動(dòng)。IL-1β、IL-6、TNF-α可介導(dǎo)慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展,是慢性牙周炎的局部促進(jìn)因素。本研究結(jié)果顯示,M/CMCS可抑制牙周炎大鼠牙周組織中TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)及IL-1β、IL-6、TNF-α水平,提示甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠可能通過(guò)抑制牙周炎大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮促組織修復(fù)作用。王艷紅等[10]研究證實(shí),抑制牙髓炎大鼠TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活,可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)大鼠牙周組織修復(fù)。

SIRT1是去乙?；钢?其可調(diào)控多種細(xì)胞的生物學(xué)活性,現(xiàn)已有研究證實(shí)其可參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展。SIRT1通過(guò)NF-κB去乙?；档脱装Y介質(zhì)TNF-α水平,從而介導(dǎo)炎癥的發(fā)生發(fā)展。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),TLR4可介導(dǎo)革蘭陰性菌的LPS引起的hPDLCs的炎癥反應(yīng)以及牙槽骨的破壞,通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)SIRT1的表達(dá)可通過(guò)降低TLR4表達(dá)及抑制JNK/NF-κB通路緩解由LPS引起的炎癥反應(yīng),敲除SIRT1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,M/CMCS可增加牙周炎大鼠牙周組織中SIRT1蛋白表達(dá),因此猜測(cè)M/CMCS可能通過(guò)上調(diào)牙周炎牙周組織中SIRT1表達(dá)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)促進(jìn)牙周炎大鼠牙周組織修復(fù)。為了證實(shí)這一觀點(diǎn),本研究采用SIRT1特異性抑制劑EX527聯(lián)合M/CMCS共同干預(yù)牙周炎大鼠,結(jié)果顯示,EX527可減弱M/CMCS對(duì)牙周炎大鼠牙周組織的修復(fù)作用。

綜上所述,甲硝唑羧甲基殼聚糖凝膠可促進(jìn)慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建,修復(fù)牙周組織,其作用機(jī)制可能和增加牙周組織中SIRT1表達(dá),從而通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。