亞森江·買買提, 郭自同, 買迪娜依·斯熱吉丁, 余小林, 劉小方, 程 慧

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊 830001)

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一種心肌特異性微血管并發(fā)癥,由心臟組織中對胰島素代謝作用的抵抗(例如胰島素抵抗)、代償性高胰島素血癥和高血糖共同促進(jìn)產(chǎn)生[1]。目前,雖然有治療DCM的治療策略,但國內(nèi)外的治療主要為控制血糖和血脂,缺乏針對受損心肌組織的有效藥物或策略[2]。因此,了解臨床癥狀,識別早期和高敏感性的診斷生物標(biāo)志物,闡明潛在的致病機(jī)制,以及開發(fā)新的DCM靶向干預(yù)措施,對于改善患者的預(yù)后和預(yù)防疾病的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。在正常條件下,心肌細(xì)胞的自噬可以通過降解并回收細(xì)胞內(nèi)廢物和受損細(xì)胞器來維持心肌細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)。然而自噬受損會導(dǎo)致心臟功能障礙,引發(fā)心力衰竭[3]。外泌體中包含microRNA和mRNA,是一種重要的生物基因傳遞系統(tǒng),可由多種類型的細(xì)胞分泌產(chǎn)生,包括免疫細(xì)胞(B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突細(xì)胞)、神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、癌細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等[4]。其中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)來源的外泌體(簡稱BMSC-Exos)具有修復(fù)受損組織、較低免疫原性以及易于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點,在治療DCM等糖代謝異常疾病中廣泛的應(yīng)用。miR-122a是在肝臟中表達(dá)的miRNA,參與膽固醇和脂肪酸代謝。據(jù)報道,miR-122a的過表達(dá)顯著提高細(xì)胞保護(hù)性自噬水平,上調(diào)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1的表達(dá)[5],然而,miR-122a是否可以通過激活心肌細(xì)胞自噬治療DCM仍不清楚,間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體是否可以遞送miR-122a發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步研究。在本實驗中,通過將miR-122a轉(zhuǎn)染至小鼠BMSC-Exos中,并用于治療高脂高糖飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)DCM 模型小鼠,觀察其對DCM小鼠的治療作用,并評估心肌細(xì)胞自噬水平,旨在為DCM的臨床藥物開發(fā)提供一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1實驗動物:30只C57/B6小鼠均購自北京唯尚立德生物科技有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(京)2021-0010,SPF級,體質(zhì)量18g～20g,共計30只。所有小鼠均飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動物房內(nèi),自由進(jìn)食飲水,保持動物房室內(nèi)溫度21～25℃,12h晝夜溫控。適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后進(jìn)行實驗。

1.2主要試劑和儀器:鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ;貨號:S0130)購自美國Sigma公司;α-MEM培養(yǎng)基(貨號:MEL08)、DMEM低糖完全培養(yǎng)基(貨號:MBS2567505)購自武漢艾美捷科技有限公司;胎牛血清(貨號:164210)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;0.25% 胰酶消化液(貨號:C0201)、RIPA裂解液(貨號:P0013B)和BCA蛋白濃度檢測試劑盒(貨號:P0009)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Exosome Purification Column 外泌體純化柱(貨號:41212ES);Lipofectamine 2000(貨號:11668-027)、miR-122a模擬物和miR-NC質(zhì)粒均購自美國Invitrogen;CD63(貨號:ab1318)、CD81(貨號:ab219209)、LC3Ⅱ(貨號:ab232940)、LC3Ⅰ(貨號:ab128025)、Beclin1(貨號:ab302669)、γH2AX(貨號:ab81299)、內(nèi)參GAPDH(貨號:ab8245)以及HRP標(biāo)記的二抗(貨號:ab6721)購自美國abcam;ECL化學(xué)檢測液(貨號:PE0010)購自北京索萊寶科技有限公司;ROS(貨號:ml092661)、IL-1β(貨號:ml028595)、IL-6(貨號:ml063159)和TNF-α(貨號:ml002095)的ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。TRIzol試劑(貨號:R0016)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:AORT-0020)購自美國GeneCopoeia;全數(shù)字彩色多普勒超聲診斷儀(DW‐PE582)購自大為醫(yī)療(江蘇)有限公司;Bio-Rad ChemDoc高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(貨號:ChemiDoc)購自美國Bio-Rad。

1.3實驗方法

1.3.1BMSC的分離、培養(yǎng)及鑒定:小鼠經(jīng)異氟醚吸入麻醉后脫頸處死,分離其完整的后肢,浸入75%酒精中消毒,無菌下剔除黏附于股骨和脛骨的軟組織,暴露出骨髓腔,使用α-MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔,收集沖洗液,使用細(xì)胞篩網(wǎng)以去除其他組織,1200g室溫離心5min,棄上清,保留沉淀,用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中,在溫度37℃,含有5% CO2恒溫細(xì)胞孵育箱培養(yǎng),待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%,用0.25%胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)較為均勻,培養(yǎng)5d后,細(xì)胞呈紡錘形,且螺旋狀排列。在培養(yǎng)10d時觀察到細(xì)胞數(shù)目明顯增多,分布均勻,紡錘形明顯。取第4代BMSC用于后續(xù)實驗。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取第4代BMSC,將細(xì)胞分為miR-122a和miR-NC組,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,接種于10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿,37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h,觀察細(xì)胞80%融合后開始轉(zhuǎn)染,嚴(yán)格按照說明書采用Lipofectamine 2000將miR-122a和miR-NC轉(zhuǎn)染至BMSC細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～6h后,加入8mL含體積分?jǐn)?shù)為10%無外泌體血清的DMEM低糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照,分別收取上清液及細(xì)胞樣本進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3外泌體提取及鑒定:將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清液以5000g離心10min去除細(xì)胞碎片,3000g離心10min以去除死細(xì)胞,4℃以12000g離心60min,棄上清,用PBS均勻吹打,4℃以15000g離心2min,保留上清液,該上清液中富含外泌體顆粒。將收獲的外泌體顆粒粗品轉(zhuǎn)入Exosome Purification Filter(EPF)柱上室中,于4℃以5000g離心10min,離心后收集純化后的外泌體顆粒,電鏡顯微鏡觀察外泌體形態(tài),并使用Western blot檢測其CD63、CD81的表達(dá),步驟參考1.3.4。

1.3.4Western blot檢測蛋白表達(dá):加入RIPA裂解液提取心肌組織樣品,BCA法測定上清液中蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液,沸水浴煮沸10min。按照SDS-PAGE凝膠試劑盒說明將蛋白樣品加至膠孔中,電泳100min后利用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1h,加入一抗CD63(1∶1000)、CD81(1∶1000)、LC3Ⅱ(1∶1000)、LC3Ⅰ(1∶1000)、Beclin1(1∶1000)、γH2AX(1∶1000)以及內(nèi)參GAPDH(1∶2000),4℃孵育過夜。緩沖液清洗一抗,加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000),室溫孵育二抗2h,再次洗滌。ECL化學(xué)檢測液浸潤PVDF膜1min,置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。

1.3.5DCM模型的建立與分組給藥:將30只C57/B6小鼠平均分為3組:對照組、miR-122a組和miR-NC組,每組10只。參考文獻(xiàn)誘導(dǎo)DCM模型。miR-122a組和miR-NC組給予高脂高糖飲食飼養(yǎng),分別于第5、6周時經(jīng)腹腔注射STZ(80mg/kg),對照組腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液,每周檢測血糖和體重變化。分別于第7、8周,miR-NC組尾靜脈注射BMSC-Exos-miR-NC(200μg/kg),miR-122a組尾靜脈注射BMSC-Exos-miR-122a(200μg/kg)進(jìn)行治療,實驗第12周時處死小鼠。

1.3.6檢測各組小鼠心功能指標(biāo):實驗第12周時,將小鼠以3%水合氯醛麻醉,左側(cè)臥位,采用全數(shù)字彩色多普勒超聲診斷儀DW‐PE582檢測舒張末期室間隔厚度(IVSd)、左舒張末期后壁厚度(PWd)、左室短軸縮短率(LVFS)、每搏輸出量(SV)、心排出量(CO)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)和左室質(zhì)量(LVM)。

1.3.7HE檢測心肌組織病理水平:收集小鼠心肌組織并用4%多聚甲醛固定過夜,然后進(jìn)行10% EDTA脫鈣、石蠟包埋和切片(切割約5μm)。使用不同純度乙醇對5μm切片進(jìn)行脫蠟和再水化,然后用蘇木精和伊紅染色。切片經(jīng)乙醇脫水,再經(jīng)二甲苯透明10min。將已透明的切片滴上樹膠,蓋上蓋玻片封固,顯微鏡下觀察心臟病理結(jié)構(gòu)。

1.3.8ELISA檢測心肌組織ROS、IL-1β、IL-6和TNF-α水平:利用ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程,嚴(yán)格按照說明書檢測心肌組織上清液中ROS、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)樣品吸光度計算樣品相應(yīng)濃度。

1.3.9qRT-PCR檢測基因的表達(dá)水平:使用Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA,酶標(biāo)儀檢測RNA濃度和純度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒實驗說明,依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實驗。qRT-PCR反體系:cDNA模板2ng,上下游引物各0.4μL,SYBR Primix Ex TaqTM 5μL,ddH2O補(bǔ)充至10μL。qRT-PCR反應(yīng)條件:95℃(30s)預(yù)變性后,變性95℃(7s),退火55℃(30s),72℃(15s),40個循環(huán)周期。擴(kuò)增結(jié)果根據(jù)2-△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。qRT-PCR引物序列:CAPDH-F,5-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3,CAPDH-R,5-GCGCCCAATACGACCAAATC-3;miR-122a-F,5-GCTGTGGAGTGTGACAATGG-3,miR-122a-R,5-GCCTAGCAGTAGCTATTTAGTGT-3。

2 結(jié) 果

2.1過表達(dá)miR-122a BMSC構(gòu)建:qRT-PCR結(jié)果顯示,與BMSC-miR-NC(1.09±0.19)比較,BMSC-miR-122a(13.36±2.32)中miR-122a表達(dá)升高(t=10.02,P=0.012),見圖1。說明過表達(dá)miR-122a的BMSC構(gòu)建成功。

圖1 三組細(xì)胞中miR-122a表達(dá)

2.2攜帶miR-122a BMSC-Exos鑒定:電鏡顯微鏡觀察顯示,外泌體呈現(xiàn)圓形顆粒狀形態(tài),粒徑集中在100nm附近,見圖2A。Western blot結(jié)果顯示,與BMSC細(xì)胞比較,BMSC-Exos-miR-NC和BMSC-Exos-miR-122a中CD63和CD81蛋白表達(dá)升高,見圖2B。此外,與BMSC-Exos-miR-NC(1.00±0.05)比較,BMSC-Exos-miR-122a(7.42±1.67)中miR-122a表達(dá)升高(t=6.78,P=0.023),見圖2C。

圖2 攜帶miR-122a的外泌體鑒定

2.3攜帶miR-122a BMSC-Exos改善DCM心功能指標(biāo):各組小鼠心功能檢測結(jié)果顯示,與對照組(0.57±0.10)(0.59±0.06)(27.68±1.04)(28.33±1.67)(12.33±0.99)(3.01±0.44)(2.08±0.13)(47.33±2.67)比較,miR-NC組小鼠IVSd(0.42±0.08)(t=6.98,P=0.026)、PWd(0.41±0.09)(t=6.13,P=0.033)、LVFS(21.99±1.65)(t=7.28,P=0.018)、SV(21.37±1.42)(t=6.97,P=0.022)、CO(9.34±0.88)(t=3.90,P=0.045)顯著降低,LVDd(3.50±0.17)(t=5.47,P=0.038)、LVDs(2.84±0.19)(t=6.53,P=0.030)、LVM(58.89±2.34)(t=7.65,P=0.017)顯著升高。與miR-NC組比較,miR-122a組IVSd(0.53±0.07)(t=10.88,P=0.011)、PWd(0.54±0.05)(t=4.41,P=0.042)、LVFS(27.11±1.89)(t=6.60,P=0.029)、SV(26.99±2.00)(t=6.49,P=0.031)、CO(11.80±1.12)(t=5.77,P=0.036)顯著升高,LVDd(3.10±0.09)(t=4.38,P=0.041)、LVDs(2.13±0.14)(t=5.39,P=0.039)、LVM(51.23±1.89)(t=7.01,P=0.020)顯著降低,見圖3。

圖3 三組小鼠心功能

2.4攜帶miR-122a BMSC-Exos緩解DCM心肌細(xì)胞損傷:HE結(jié)果顯示,對照組小鼠心肌組織形態(tài)正常,未見炎性細(xì)胞浸潤,心肌纖維排列整齊。miR-NC組小鼠心肌組織形態(tài)異常,心肌纖維斷裂。miR-122a組小鼠心肌組織形態(tài)恢復(fù),心肌纖維斷裂恢復(fù),見圖4。Western blot結(jié)果顯示,與對照組(0.17±0.02)比較,miR-NC組小鼠心肌組織γH2AX蛋白表達(dá)水平(1.17±0.07)顯著升高(t=6.53,P=0.030);與miR-NC組比較,miR-122a組小鼠心肌組織γH2AX蛋白表達(dá)水平(0.38±0.11)顯著降低(t=5.57,P=0.037),見圖5。

圖4 三組小鼠心肌組織病理

圖5 三組小鼠心肌組織γH2AX表達(dá)

2.5攜帶miR-122a BMSC-Exos降低DCM炎癥水平:ELISA結(jié)果顯示,與對照組(2159.12±33.98)(21.80±2.99)(38.74±2.11)(102.99±1.21)比較,miR-NC組小鼠心肌組ROS(3154±29.08)(t=6.69,P=0.024)、IL-1β(40.80±4.81)(t=6.61,P=0.025)、IL-6(70.25±5.90)(t=5.98,P=0.034)和TNF-α(189.77±10.11)(t=3.21,P=0.046)水平顯著升高;與miR-NC組比較,miR-122a組小鼠心肌組織ROS(2350.23±29.76)(t=7.33,P=0.018)、IL-1β(28.70±3.77)(t=7.091,P=0.020)、IL-6(54.30±5.88)(t=6.07,P=0.033)和TNF-α(126.03±10.24)(t=6.91,P=0.022)水平顯著降低,見圖6。

圖6 三組小鼠心肌組織炎癥水平

2.6攜帶miR-122a BMSC-Exos恢復(fù)DCM心肌細(xì)胞自噬水平:Western blot結(jié)果顯示,與對照組(1.41±0.13)(0.81±0.05)比較,miR-NC組小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(0.23±0.07)(t=7.11,P=0.019)、Beclin1(0.33±0.08)(t=4.67,P=0.040)蛋白表達(dá)水平顯著降低;與miR-NC組比較,miR-122a組小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(0.73±0.06)(t=10.66,P=0.010)、Beclin1(0.57±0.08)(t=8.33,P=0.014)蛋白表達(dá)水平顯著升高,見圖7。

圖7 三組小鼠心肌組織自噬水平

3 討 論

目前臨床上的非藥物治療、藥物治療和手術(shù)治療均不能從根本上治療DCM等心臟疾病,因此,基于BMSC的細(xì)胞及細(xì)胞器療法引起了人們越來越多的關(guān)注。作為一種細(xì)胞外囊泡,外泌體具備良好的生物相容性、穩(wěn)定性以及較低的毒性,已經(jīng)成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的重要工具。例如BMSC-Exos可通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2表型減輕腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和細(xì)胞焦亡。此外,來自缺氧BMSC-Exos攜帶的microRNA-98-5p可通過激活PI3K/Akt信號通路抑制心肌缺血再灌注損傷,這表明了BMSC-Exos對于心肌功能性疾病具有潛在的治療作用。

微小RNA(miRNA)可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。當(dāng)給予miR-122治療可以通過靶向Fibulin-1(一種與細(xì)胞外基質(zhì)重塑有關(guān)的分泌蛋白)來逆轉(zhuǎn)糖尿病性心肌病中的心臟肥大和纖維化,強(qiáng)化心臟功能[6],表明miR-122a在心臟功能重塑中起關(guān)鍵作用。本實驗通過提取小鼠BMSC,轉(zhuǎn)染miR-122a后,通過提取BMSC-Exos,鑒定miR-122a的表達(dá),并用于治療DCM。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶miR-122a BMSC-Exos改善了DCM小鼠的心功能指標(biāo),緩解了心肌細(xì)胞損傷,促進(jìn)了心肌組織形態(tài)恢復(fù),抑制心肌纖維斷裂,降低了心肌炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子的表達(dá)水平,說明攜帶miR-122a BMSC-Exos對DCM具有較好的治療作用。

自噬是影響心臟形態(tài)發(fā)育的關(guān)鍵過程,可保護(hù)心肌細(xì)胞應(yīng)對多種應(yīng)激刺激。然而,自噬紊亂會導(dǎo)致心臟損傷,引發(fā)心臟性疾病,例如心肌病、心肌肥大和缺血/再灌注損傷。據(jù)報道,持續(xù)的高血糖和胰島素信號傳導(dǎo)受損可以通過增強(qiáng)心肌細(xì)胞中的mTOR信號進(jìn)一步抑制心臟自噬[7]。此外,糖尿病患者體內(nèi)過度的心肌炎癥也會通過損害心臟自噬而導(dǎo)致DCM。同時,攝入高脂肪和精制碳水化合物的飲食會導(dǎo)致心臟胰島素代謝信號受損、氧化應(yīng)激和心臟纖維化[8]。而miR-122a可通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。在本研究中,在給予高脂高糖飲食飼養(yǎng),腹腔注射STZ誘導(dǎo)小鼠DCM后,通過檢測小鼠自噬相關(guān)蛋白(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1)的表達(dá),初步發(fā)現(xiàn)DCM小鼠心肌細(xì)胞自噬水平降低,這與前人研究結(jié)論一致。而使用攜帶miR-122a BMSC-Exos治療后,小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)水平升高,說明攜帶miR-122a BMSC-Exos可以提高DCM小鼠的心肌細(xì)胞自噬能力。

綜上所述,本研究在高脂高糖飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)小鼠DCM模型中,心肌細(xì)胞自噬水平降低,而攜帶miR-122a的BMSC-Exos可通過恢復(fù)心肌細(xì)胞自噬水平,降低炎性水平和細(xì)胞損傷,改善DCM的疾病癥狀。本研究從恢復(fù)DCM患者心臟自噬的角度,揭示攜帶miR-122a的BMSC-Exos對于心臟功能的改善作用,為DCM的臨床治療提供新的治療思路。