杜麗欣，張峰瑞，鄒雪，韓慕蓉，張建斌，洪亮

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

在養(yǎng)豬業(yè)，斷奶仔豬腹瀉是最常見(jiàn)的疾病，仔豬斷奶后由于食物和環(huán)境改變，其腸道屏障功能減弱、機(jī)體代謝和免疫力下降，可能會(huì)增加病原菌在腸道菌群的占比，從而引起腹瀉，嚴(yán)重會(huì)導(dǎo)致仔豬死亡，繼而給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。為了預(yù)防斷奶仔豬腹瀉，許多養(yǎng)殖戶(hù)在飼料中添加抗生素。而抗生素的使用會(huì)破壞腸道菌群平衡并導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[2]，給動(dòng)物健康帶來(lái)不利影響，甚至?xí)埩粼谛螽a(chǎn)品中，危害人體健康。國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)中規(guī)定從2020 年1 月1 日起實(shí)施全面“禁抗”，抗生素替代劑的研發(fā)引起畜牧業(yè)廣泛關(guān)注。

通過(guò)關(guān)于替抗物質(zhì)的大量研究，發(fā)現(xiàn)益生菌具有安全和不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[3]，可以解決細(xì)菌耐藥性和藥物殘留的問(wèn)題，增加宿主腸道中有益微生物的數(shù)量并促進(jìn)動(dòng)物腸道健康[4]。因此，益生菌作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。有研究表明，乳酸菌在促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面有一定作用[5]，且能與腸道病原菌競(jìng)爭(zhēng)定殖使腸道微生物群達(dá)到平衡。因此，乳酸菌被廣泛應(yīng)用于改善斷奶仔豬應(yīng)激現(xiàn)象[6]。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是最主要的飼用益生菌之一[7]，其為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈過(guò)氧化氫酶陰性，主要包括乳桿菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬和腸球菌屬等。

隨著對(duì)飼料中添加單一乳酸菌的研究越來(lái)越多，有研究表明LP 和LR 對(duì)腸道病原菌有競(jìng)爭(zhēng)抑制、刺激宿主免疫系統(tǒng)、改善仔豬早期腸道屏障功能、有效預(yù)防腹瀉等作用[8-9]。為了尋求效果更好的乳酸菌添加劑，越來(lái)越多關(guān)于復(fù)合乳酸菌作為飼料添加劑的研究開(kāi)始出現(xiàn)[10]。本試驗(yàn)旨在將LP 與LR 復(fù)合乳酸菌制劑作為替抗飼料添加劑，探究腸道乳酸菌與大腸型細(xì)菌是否有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，評(píng)估其在預(yù)防斷奶仔豬細(xì)菌性腹瀉方面的效果，以期為復(fù)合乳酸菌制劑的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)乳酸菌：試驗(yàn)用LP 和LR 均分離于健康仔豬糞便，純化后保存于天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。

復(fù)合菌：培養(yǎng)LP 和LR 的單一菌落至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，乳酸菌培養(yǎng)液以4 000 r/min 離心15 min，去其上清液后稱(chēng)重，添加（W/V）10%脫脂牛奶后進(jìn)行冷凍干燥。0～14 d 在基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合乳酸菌制劑1×109CFU/kg，占飼料重0.1%，15～28 d 添加量減半，為5×108CFU/kg，占飼料重0.05%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于天津強(qiáng)源康農(nóng)業(yè)科技有限公司附屬豬場(chǎng)進(jìn)行，選取12 頭28 日齡斷奶平均初始體重為（6.77±1.30）kg 的三元仔豬。根據(jù)初始體重均衡的原則將其分成2 組，為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂添加復(fù)合LAB 制劑的基礎(chǔ)日糧。

1.3 基礎(chǔ)日糧與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)中所用的基礎(chǔ)日糧為天津勝騰飼料有限公司生產(chǎn)，表1 為飼料營(yíng)養(yǎng)成分。試驗(yàn)前對(duì)豬舍進(jìn)行徹底清掃消毒，并空欄7 d。試驗(yàn)期間，豬舍進(jìn)行全封閉式管理，保持豬舍衛(wèi)生、通風(fēng)、干燥。溫度控制在25～27 ℃。對(duì)照組和試驗(yàn)組同舍飼養(yǎng)，分別飼養(yǎng)于兩欄中，通過(guò)耳標(biāo)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，自由采食與飲水。每天定時(shí)觀察仔豬的情況并記錄其腹瀉的相關(guān)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)期共28 d。

表1 仔豬基礎(chǔ)日糧的營(yíng)養(yǎng)成分表 %

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能

每頭豬在0 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 空腹稱(chēng)重，記錄每天采食量，分別計(jì)算對(duì)照組和試驗(yàn)組0～14 d、15～28 d、0～28 d 平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）。

1.4.2 腸道LAB 以及大腸型細(xì)菌測(cè)定

在14 d 和28 d 早上采集每頭豬的新鮮糞便，分別放在有編號(hào)的塑料袋中，保存在有冷凍冰的泡沫箱中，立即送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。稱(chēng)取適量糞樣于2 ml 離心管中，用1 ml 蒸餾水稀釋?zhuān)来蜗♂屗膫€(gè)梯度10-1～10-4，分別取0.01 mL 接種于MRS 瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度3 個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)20 h 后進(jìn)行計(jì)數(shù)。菌落的數(shù)量以每克鮮豬糞樣中所含微生物的對(duì)數(shù)值（log）表示（CFU/g）。

1.4.3 腹瀉指標(biāo)

試驗(yàn)通過(guò)糞便指數(shù)、腹瀉率和腹瀉指數(shù)三個(gè)指數(shù)表示仔豬腹瀉情況。

糞便指數(shù)：0 分-正常糞便（固體）；1 分-濕糞（半固體）；3 分-稀便（輕度腹瀉）；5 分-水樣糞便（嚴(yán)重腹瀉）。輕度腹瀉和重度腹瀉均視為腹瀉。

腹瀉率和腹瀉指數(shù)的計(jì)算方式如下。

腹瀉率：腹瀉的天數(shù)/總試驗(yàn)天數(shù)

腹瀉指數(shù)：總糞便指數(shù)/總試驗(yàn)天數(shù)[11]

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 軟件進(jìn)行處理后，采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＞0.05 表示差異不顯著，P＜0.05 為具有顯著性差異，P＜0.01 為具有極顯著性差異。通過(guò)最小二乘法求14 d 和28 d 仔豬的體重和ADG與腸道LAB 的回歸方程，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合LAB 對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

通過(guò)表2 可知對(duì)照組和試驗(yàn)組斷奶仔豬的平均體重差距逐漸增大。試驗(yàn)期結(jié)束時(shí)與對(duì)照組相比，飼喂復(fù)合LAB 斷奶仔豬的平均體重增加了1.84 kg。0 d 時(shí)，試驗(yàn)組的斷奶仔豬體重最小值小于對(duì)照組體重最小值，14 d 時(shí)，試驗(yàn)組斷奶仔豬體重最小值與對(duì)照組接近，21 d 時(shí)，試驗(yàn)組的斷奶仔豬體重最小值超過(guò)對(duì)照組。表明在基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合LAB 后，提高了斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，體重增加更快。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的斷奶仔豬采食量增加（P＞0.05），F(xiàn)CR有所降低（P＞0.05）。表明在基礎(chǔ)日糧中添加復(fù)合LAB 可提高斷奶仔豬的采食量并改善其FCR。

表2 對(duì)照組及試驗(yàn)組斷奶仔豬每周體重與前兩周、后兩周和試驗(yàn)期平均日增重、平均日采食量、飼料轉(zhuǎn)換率差異顯著性分析

2.2 復(fù)合LAB 對(duì)斷奶仔豬腸道LAB 以及大腸型細(xì)菌的影響

圖1 中，飼喂復(fù)合LAB 兩周后的斷奶仔豬腸道菌群中LAB 數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增多（P＜0.01），大腸型細(xì)菌數(shù)量明顯減少（P＞0.05），但無(wú)顯著性差異；飼喂復(fù)合LAB 四周后的斷奶仔豬腸道菌群中的LAB 和大腸型細(xì)菌數(shù)量與對(duì)照組相比差異均顯著（P＜0.05）。圖2 中，與對(duì)照組相比，飼喂復(fù)合LAB 兩周后（A）和四周后（B）的斷奶仔豬腸道LAB 與大腸型細(xì)菌數(shù)量比率均有顯著性差異。飼喂復(fù)合LAB 的斷奶仔豬腸道LAB 與大腸型細(xì)菌數(shù)量比率顯著增加，表明飼料中添加復(fù)合LAB 能有效減少大腸型細(xì)菌數(shù)量，腸道LAB對(duì)大腸型細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)抑制作用增強(qiáng)，腸道病原菌被更有效抑制。

圖1 對(duì)照組與試驗(yàn)組斷奶仔豬腸道LAB數(shù)與大腸型細(xì)菌數(shù)差異顯著性分析

圖2 對(duì)照組與試驗(yàn)組斷奶仔豬腸道LAB 與大腸型細(xì)菌的比率

2.3 復(fù)合LAB 對(duì)斷奶仔豬腹瀉相關(guān)指標(biāo)的影響

表3 中，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組的斷奶仔豬在前兩周的糞便指數(shù)、腹瀉率和腹瀉指數(shù)均顯著下降（P＜0.05），在后兩周，其腹瀉相關(guān)指標(biāo)下降不明顯（P＞0.05）。但在表3 及圖3 中可以看到飼喂復(fù)合LAB 的斷奶仔豬在整個(gè)試驗(yàn)期的腹瀉相關(guān)指標(biāo)與對(duì)照組相比顯著下降（P＜0.05）。表明在飼料中添加復(fù)合LAB 可有效減少腹瀉相關(guān)指標(biāo)。且前兩周飼料中復(fù)合LAB添加量為109CFU/kg時(shí)，對(duì)腹瀉相關(guān)指標(biāo)的改善明顯優(yōu)于后兩周添加量為5×108CFU/kg 時(shí)的效果。表明在飼料中添加復(fù)合LAB的量為109CFU/kg 時(shí)對(duì)預(yù)防斷奶仔豬腹瀉效果更好。

表3 0～14 d，15～28 d，0～28 d 對(duì)照組及試驗(yàn)組斷奶仔豬糞便指數(shù)、腹瀉率（%）、腹瀉指數(shù)差異顯著性分析

2.4 體重與ADG 及腸道LAB 數(shù)量相關(guān)性分析

圖4 中，飼喂復(fù)合LAB 四周后斷奶仔豬體重與腸道LAB 數(shù)量的相關(guān)性（R2＝0.377 8，P＜0.000 1）比飼喂復(fù)合LAB 兩周后的相關(guān)程度（R2＝0.218 0，P＝0.004 1）更高。圖5 中，與飼喂復(fù)合LAB 四周后相比（R2＝0.233 8，P＝0.002 8），飼喂復(fù)合LAB 前兩周斷奶仔豬平均日增重與腸道LAB 數(shù)量的相關(guān)程度（R2＝0.443 2，P＜0.000 1）更高。圖4、圖5 中，斷奶仔豬平均日增重與腸道LAB 數(shù)量呈正相關(guān)。

圖4 對(duì)照組與試驗(yàn)組斷奶仔豬體重與LAB 活細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析圖

圖5 對(duì)照組與試驗(yàn)組斷奶仔豬平均日增重與LAB 活細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性圖

3 討論

3.1 復(fù)合LAB 對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響及體重、ADG 與腸道LAB 數(shù)量相關(guān)性分析

LAB 有助于增強(qiáng)腸道屏障，防止病原菌感染破壞，且能維持代謝穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)，從而對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和健康有促進(jìn)作用。LR 進(jìn)入腸道會(huì)產(chǎn)生乳酸、蛋白酶及細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物，可以顯著提高絨毛高度，促進(jìn)杯狀細(xì)胞增殖與黏蛋白分泌，從而促進(jìn)受損的小腸上皮細(xì)胞修復(fù)，同時(shí)增加小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的吸收面積[12]，促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)，所以腸道LAB 數(shù)量與斷奶仔豬體重及ADG呈正相關(guān)。楊陽(yáng)等[13]研究表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌和乳酸菌顯著提高了斷奶仔豬平均日增重，WANG 等[14]在飼料中添加丁羧酸菌和糞腸球菌顯著提高了斷奶仔豬體重，顯著降低FCR，提高仔豬生長(zhǎng)性能，與本試驗(yàn)一致。而ZHAO等[15]認(rèn)為飼料中添加LP 和LR 復(fù)合制劑對(duì)斷奶仔豬ADFI沒(méi)有影響，所以不同LAB 添加量可能是影響ADFI的重要因素。陳月茹等[16]研究了枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌三者復(fù)合的益生菌，按質(zhì)量比添加3.0‰復(fù)合益生菌，斷奶仔豬體重增加顯著高于添加2.0‰和1.0‰的試驗(yàn)組，生長(zhǎng)性能提高。為了探究復(fù)合LAB 添加量對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和腸道LAB 數(shù)的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)在后兩周將飼料添加劑的量減半為5×108CFU/kg，結(jié)果顯示雖然在后兩周減少了復(fù)合LAB 的量，但斷奶仔豬腸道LAB 數(shù)量維持在一定水平，同樣促進(jìn)了其生長(zhǎng)性能。關(guān)于在斷奶仔豬生長(zhǎng)后期減少飼料中復(fù)合LAB 的添加量同時(shí)維持?jǐn)嗄套胸i生長(zhǎng)水平的深入研究可以為養(yǎng)殖場(chǎng)節(jié)約成本作為參考。

3.2 復(fù)合LAB 對(duì)斷奶仔豬腸道微生物及腹瀉相關(guān)指標(biāo)的影響

仔豬斷奶腹瀉主要由條件致病菌和腸毒素引起，而最常見(jiàn)的是由于仔豬腸道微生物組成平衡被破壞，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，條件致病菌更容易定殖在腸道內(nèi)誘導(dǎo)炎癥。LAB 產(chǎn)生的丁酸可以通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)來(lái)緩解腹瀉，其機(jī)理是丁酸通過(guò)降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ 等表達(dá)和增加抗炎細(xì)胞因子TGF-β 表達(dá)來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，還可以增強(qiáng)腸道粘膜機(jī)械屏障功能，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而降低仔豬腹瀉相關(guān)指標(biāo)[17]。丁爽等[18]的研究中，添加屎腸球菌B13 的斷奶仔豬糞便中乳酸菌及屎腸球菌數(shù)量較對(duì)照組顯著增加，且大腸桿菌數(shù)量有下降趨勢(shì)。引起仔豬腹瀉的主要致病菌是大腸桿菌和沙門(mén)氏菌[19]，均屬于大腸型細(xì)菌。因此，本試驗(yàn)對(duì)腸道大腸型細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)間接表示腸道致病菌的定殖情況。HE 等[20]試驗(yàn)中用約氏乳桿菌L531 飼喂斷奶仔豬，腸道沙門(mén)氏菌數(shù)量顯著降低，WANG 等[8]研究結(jié)果表明飼喂LP 斷奶仔豬的相關(guān)腹瀉指標(biāo)降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

前兩周復(fù)合LAB 在飼料中的添加量為109CFU/kg，是后兩周的兩倍，以期達(dá)到前兩周預(yù)防仔豬腹瀉和后兩周維持預(yù)防作用的效果。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，后兩周添加量減半時(shí)，仔豬腹瀉相關(guān)指數(shù)雖然不像前兩周有顯著性差異，但預(yù)防腹瀉的效果在前兩周的基礎(chǔ)上有維持。

3.3 腸道LAB 與大腸型細(xì)菌比率變化

仔豬斷奶后由于環(huán)境和飲食改變，腸道微生物平衡被破壞，有些病原微生物可能會(huì)定殖于腸道內(nèi)，但部分微生物會(huì)展現(xiàn)出一定的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，比如LAB，其主要作用機(jī)制包括增強(qiáng)腸道上皮屏障，增加腸道黏膜的粘附作用，同時(shí)抑制病原微生物黏附，與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)定殖[21]。研究證實(shí)LAB 黏附于Caco-2 和IPEC-J2 細(xì)胞上與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)的作用機(jī)制可能是鈣促進(jìn)細(xì)胞表面與蛋白質(zhì)和多糖黏附蛋白分子的特異性黏附作用[22]。同時(shí)，LAB 可以調(diào)控腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子從而發(fā)揮抗炎作用，LR 通過(guò)抑制IPEC-J2 分泌白細(xì)胞介素-8（IL-8）從而抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)[23-24]。DELL 等[25]研究中復(fù)合LAB 作為飼料添加劑飼喂斷奶仔豬，增加有益微生物菌群相對(duì)豐度，其機(jī)制可能是LR 促進(jìn)腸道內(nèi)丁酸產(chǎn)生，梭菌XIVa 群增殖，從而提高短鏈脂肪酸含量，因?yàn)樗缶鶻IVa 群具有黏附黏蛋白的活性，可以減少腸道內(nèi)致病菌對(duì)黏蛋白的利用[12]。

試驗(yàn)中計(jì)算分析腸道LAB 與大腸型細(xì)菌比率后，發(fā)現(xiàn)飼喂添加復(fù)合飼料的斷奶仔豬腸道中大腸型細(xì)菌占比減少，腸道LAB 占比增加。這表明在飼料中添加復(fù)合LAB 可以抑制腸道大腸型細(xì)菌等病原微生物生長(zhǎng)。

3.4 復(fù)合LAB 是否具有協(xié)同作用

在一種復(fù)合益生菌中，可能會(huì)因?yàn)檗卓棺饔没蚋?jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致其作用效果減弱，也可能除了發(fā)揮單個(gè)益生菌的菌株特性，還與其他益生菌通過(guò)協(xié)同作用發(fā)揮更廣泛的抑菌效果[26]。因此，在復(fù)合LAB 的研究中，除了對(duì)復(fù)合LAB 與腸道病原菌是否具有拮抗作用的研究以外，復(fù)合LAB 進(jìn)入腸道是否能發(fā)揮協(xié)同作用也是研究的關(guān)鍵。與單個(gè)乳酸菌相比，具有協(xié)同作用的復(fù)合LAB 會(huì)更好地促進(jìn)其刺激宿主免疫系統(tǒng)、改善仔豬腸道屏障等功能，從而有效預(yù)防仔豬腹瀉。王漢星[27]研究表明，枯草芽孢桿菌與糞腸球菌在飼糧中單獨(dú)添加會(huì)顯著促進(jìn)仔豬腸道發(fā)育并提高氨基酸消化率，而枯草芽孢桿菌與糞腸球菌混合添加對(duì)提高仔豬的生長(zhǎng)性能、腸道發(fā)育以及氨基酸消化率有相互促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中在飼料中添加復(fù)合乳酸菌制劑同樣提高了仔豬的生長(zhǎng)性能，對(duì)預(yù)防斷奶仔豬腹瀉有良好的效果。與王漢星[27]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料中添加LP 和LR 復(fù)合制劑可加快斷奶仔豬體重增長(zhǎng)，增加斷奶仔豬采食量，并改善其飼料轉(zhuǎn)化率。LP 和LR 通過(guò)抑制腸道病原微生物生長(zhǎng)，有效降低了仔豬腹瀉相關(guān)指標(biāo)。