余孝?！?guó)瑩　鐘明奎

摘要：目的探索凋亡蛋白Caspase-9/Caspase-3在慢性間歇性低氧模型小鼠肝損傷中的作用。方法將雄性C57小鼠隨機(jī)分為正常氧對(duì)照組（Sham）、慢性間歇性低氧組（CIH），CIH組小鼠放入低氧倉(cāng)進(jìn)行間歇性低氧處理（8 h/d，連續(xù)28d）。4周后HE 染色顯微鏡下觀察肝部病理形態(tài)學(xué)改變，比較兩組小鼠血清指標(biāo)白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。用Western blot檢測(cè)小鼠肝組織中凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的水平。結(jié)果與Sham組相比，CIH組肝組織形態(tài)學(xué)病理改變受損嚴(yán)重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著升高；凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表達(dá)上調(diào)。結(jié)論慢性間歇性低氧引起肝損傷，機(jī)制可能與凋亡蛋白上調(diào)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：慢性間歇性低氧，肝損傷，凋亡蛋白

中圖分類號(hào)：R531.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9545（2023）03-0102-（05）

DOI：10.19717/j.cnki.jjun.2023.03.019

間歇性低氧（chronicinter—mittent hypoxia，C1H）是阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）最為典型的病理生理特征，OSAS可以引起代謝綜合征損傷多種器官^[1]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）與抗氧化劑和活性氮之間的一種動(dòng)態(tài)平衡被打破。缺血再灌注模型可以模擬OSAS患者睡眠中反復(fù)出現(xiàn)的缺氧-復(fù)氧損傷，缺氧-復(fù)氧破壞了患者體內(nèi)抗氧化劑和促氧化劑平衡系統(tǒng)，體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生ROS，從而導(dǎo)致過(guò)氧化損傷^[2]。缺氧還可以造成引起慢性炎癥，慢性炎癥也是OSAS重要的病理生理學(xué)特征。OSAS引起的CIH在體內(nèi)可過(guò)量產(chǎn)生ROS，ROS的過(guò)度激活主要是兩方面參與機(jī)體調(diào)節(jié)，一方面參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，另一方面可以作為第二信使，可以激活低氧誘導(dǎo)因子-1α和核因子kB（Nuclear Factor-kB ，NF-kB）等核轉(zhuǎn)錄因子，NF-k B通路是比較常見(jiàn)的炎癥信號(hào)通路，同時(shí)可以使白介素IL-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子TNF-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）活化，引發(fā)炎癥反應(yīng)^[3，4]。 同時(shí)有研究顯示，CIH可以促進(jìn)非酒精性肝?。╪onalcoholic fatty liverdisease，NAFLD）患者的病情變化，從脂肪肝不斷進(jìn)展為肝硬化、甚至是肝癌。即使是沒(méi)有伴隨NAFLD大鼠，CIH也可通過(guò)促進(jìn)一系列炎癥反應(yīng)，從而調(diào)控炎癥因子活性，一定程度造成肝損傷^[5-6]。氧化損傷與細(xì)胞凋亡有很大關(guān)系，氧化損傷是導(dǎo)致肝損傷的原因之一。該研究目的是建立慢性間歇性低氧模型，觀察慢性間歇性低氧時(shí)凋亡蛋白在肝臟損傷中的作用，探討慢性間歇性低氧模型（CIH）小鼠對(duì)肝損傷機(jī)制。

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性C57小鼠，（n=16，體重=27±4g），由安徽長(zhǎng)臨河醫(yī)藥科技有限公司，按照安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例執(zhí)行，并嚴(yán)格遵守，合格證號(hào) Scxk（皖）2017-001。實(shí)驗(yàn)小鼠被養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)籠中，每籠不超過(guò)8只，12 h暗光循環(huán)保證晝夜節(jié)律，飼養(yǎng)期間不干預(yù)小鼠進(jìn)食和飲水，動(dòng)物房環(huán)境保持良好的通風(fēng)和溫濕度條件。自由進(jìn)水和實(shí)物充分，室內(nèi)溫度保持18～25℃，小鼠的使用嚴(yán)格執(zhí)行《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2儀器 測(cè)氧儀（CYS-1型，購(gòu)自南京新飛分析儀器公司）；液氮罐（醫(yī)用，成都金鳳液氮容器有限公司）；酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)公司）。

1.1.3 試劑 壓縮氧氣（濃度大于99. 9%） 、壓縮氮?dú)猓舛却笥?9. 99% ，高純氮?dú)猓?都是由合肥市醫(yī)用氧氣廠提供；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamie-pyruvic transaminase，ALT）（長(zhǎng)春匯力公司）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-Oxalacetie transaminase AST）；（長(zhǎng)春匯力公司）；Caspase3 antibody、Caspase9 antibody（博奧森生物技術(shù)有限公司）。白介素-l（interleukin-1，IL-1），白介素-6（interleukin-6，IL-6）（北方生物公司）。

1.2方法

1.2.1慢性間歇性低氧模型的制備和分組 小鼠在飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分成Sham組、CIH組，每組均為8只。該實(shí)驗(yàn)的原理是利用氮?dú)庀♂屧?，?duì)照該實(shí)驗(yàn)室先前的造模方法，將實(shí)驗(yàn)組小鼠輕輕放入含有測(cè)氧儀探頭的低氧艙內(nèi)，實(shí)時(shí)顯示數(shù)據(jù)，通過(guò)測(cè)氧儀探頭監(jiān)測(cè)氧濃度，通過(guò)兩個(gè)旋鈕調(diào)節(jié)氧氣和氮?dú)鈿怏w流量，氧濃度始終控制在6～21%范圍內(nèi)。氧氣和氮?dú)庥蓛蓚€(gè)旋鈕閥門控制，一個(gè)循環(huán)時(shí)間為9 min，先充入氮?dú)? min ，使低氧艙內(nèi)的氧濃度下降到約6% ，保持約 40 s ；隨即充入氧氣5 min ，氧濃度恢復(fù)至最高約21%，保持約 40 s，循環(huán)往復(fù)周期，每天8 h（ 9∶00 am～5∶00 pm） 共28d。造模第28d之后，將小鼠處死，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2體重的測(cè)定 低氧模型制備完成之后，首先進(jìn)行小鼠體重測(cè)量。

1.2.3 組織學(xué)觀察小鼠的肝臟 小鼠的肝組織被清水洗滌之后，用濾紙包裹吸干，多聚甲醛對(duì)其進(jìn)行沖洗，同時(shí)準(zhǔn)備含有多聚甲醛溶液的試管，在其中固定，實(shí)驗(yàn)室脫水機(jī)脫水之后，石蠟包埋技術(shù)將肝組織包埋成蠟塊以備后期觀察，將肝臟蠟塊標(biāo)本切成4μm 薄片，隨即放入溫水中任其自由展開(kāi)，展開(kāi)后用載玻片撈出，放入90℃烘烤箱中，約20 min后進(jìn)行脫蠟，準(zhǔn)備染色并封片，用光學(xué)顯微鏡下放大200倍觀察肝臟部病理改變，同時(shí)截圖留存。

1.2.4 血清指標(biāo)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用眼球取血，提前加入抗凝劑，離心后提取血清，ALT和AST水平采用化學(xué)法測(cè)定，放射免疫分析法檢測(cè)測(cè)定IL-1、IL-6水平，具體操作參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明。

1.2.5 小鼠肝臟凋亡蛋白的測(cè)定 小鼠處死后，在冰盤上取出肝臟，取適量肝臟組織與對(duì)應(yīng)劑量的RIPA裂解液在研缽器中充分研磨，裂解液的成分為：150 mol/L NaCl、50 mol/L Tris·base、1% NP-40、50 mol/L NaF、1% PMSF，充分研磨成勻漿后，放在4℃冰箱里，10min離心，用槍頭提取上清液，分別裝于準(zhǔn)備好的EP管中，臨時(shí)保存于-20℃冰箱中。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果x-±s表示，用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析兩組之間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組之間的比較選用單因素方差分析（ANOVA），p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1慢性間歇性低氧對(duì)小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 正常組在顯微鏡下肝臟組織細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，大小規(guī)整，細(xì)胞無(wú)明顯變性及壞死情況。顯微鏡下低氧組肝臟組織中肝細(xì)胞腫大及空泡化明顯，細(xì)胞排列紊亂無(wú)序，有細(xì)胞出現(xiàn)變性及壞死，有炎癥細(xì)胞聚集現(xiàn)象。

2.2慢性間歇性低氧對(duì)小鼠體重的影響 與Sham組相比，間歇性低氧28d后，CIH組小鼠體重[（25.53±1.49）vs（21.28±1.77），p＜ 0.05，]明顯減輕，見(jiàn)圖 2。

2.3慢性間歇性低氧對(duì)小鼠肝臟生化血清指標(biāo)的影響 肝臟生化血清指標(biāo)顯示CIH組ALT水平[（37.63±9.89）vs（63.06±11.79），p＜0.05]，AST水平[（88.74±13.56）vs（157.56±20.96），p＜0.05]顯著高于Sham組，見(jiàn)圖3。

2.4 慢性間歇性低氧對(duì)凋亡蛋白的影響 與Sham組相比，間歇性低氧28d后，CIH組凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9的蛋白表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖4。

2.5 慢性間歇性低氧對(duì)小鼠肝臟生化血清指標(biāo)IL-1、IL-6的變化

血清指標(biāo)顯示CIH組IL-1水平[（94.13±24.07）vs（134.06±21.02），p＜0.05]，IL-6水平[（61.99±7.66）vs（140.06±20.30），p＜0.05]顯著高于Sham組，見(jiàn)圖5。

3討論

OSAS以CIH最為典型病理生理學(xué)特征之一，是一種危險(xiǎn)性比較高的疾病類型，OSAS可引起高血壓、糖尿病和代謝綜合征等多種疾病。根據(jù)最新研究調(diào)查顯示：大概35～45％的肥胖患者伴有OSAS，超過(guò)4％的普通人群也患有OSAS^［7］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)間歇性低氧處理28 d后，CIH組肝臟組織中肝細(xì)胞腫大及空泡化明顯，細(xì)胞排列紊亂無(wú)序，有細(xì)胞出現(xiàn)變性及壞死，有炎癥細(xì)胞聚集現(xiàn)象，顯微鏡下CIH組肝組織形態(tài)學(xué)病理改變受損嚴(yán)重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著升高；凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表達(dá)上調(diào)，結(jié)果提示慢性間歇性低氧引起肝損傷，機(jī)制可能與凋亡蛋白上調(diào)相關(guān)。間歇性低氧一段時(shí)間后小鼠體重降低，由于低氧環(huán)境對(duì)小鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，小鼠減少攝食，導(dǎo)致體重減輕。有關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)：間歇性缺氧可通過(guò)誘導(dǎo)脂代謝紊亂導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生，脂代謝紊亂導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生同低氧水平呈正相關(guān)^［8-9］。CIH的最典型特征是機(jī)體不斷發(fā)生的血氧去飽和，同時(shí)ROS產(chǎn)生的重要來(lái)源也可以是組織氧利用度的振蕩不斷變化，機(jī)體在過(guò)氧化物與抗氧化物的相互失衡可產(chǎn)生過(guò)量的ROS，ROS的產(chǎn)生引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激可通過(guò)DNA損傷、細(xì)胞功能障礙、誘導(dǎo)凋亡、信號(hào)通路的激活等一系列途徑加重肝損傷。細(xì)胞內(nèi)線粒體作為維持細(xì)胞基本功能的關(guān)鍵細(xì)胞器，很容易不同程度上受到氧化應(yīng)激的影響，線粒體功能異常會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源性的 ROS 產(chǎn)生^［10］，氧化損傷與細(xì)胞凋亡有很大關(guān)系，氧化損傷與肝損傷密切相關(guān)，Caspase-9是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡經(jīng)過(guò)線粒體途徑的主要指標(biāo)之一，Caspase-9被激活后促進(jìn)慢性間歇性低氧誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，Caspase-3在各種凋亡方式中扮演了執(zhí)行小分子，所以它被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，同時(shí)Caspase-9被激活后引起一系列反應(yīng)，下游Caspase-3被激活，通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致肝損傷^［11-13］。OSAS對(duì)肝臟的損傷主要是病理性改變，表現(xiàn)為肝臟出現(xiàn)不同程度的損傷、炎癥、纖維化等^［14］。HIF是在缺氧情況下機(jī)體內(nèi)重要轉(zhuǎn)錄因子，分為α亞基和β亞基，α亞在低氧環(huán)境下，一般結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而在常氧環(huán)境下不穩(wěn)定而降解，與β亞基結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)作用，缺氧時(shí)，由于HIF-1αm RNA表達(dá)增加，增加HIF-1α活性及相關(guān)蛋白穩(wěn)定性，重新獲得氧氣后HIF-1α蛋白降解，HIF-1α和其結(jié)合序列多種基因作用來(lái)完成細(xì)胞缺氧反應(yīng)性的調(diào)節(jié)^[15]。

細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程中，有Caspase依賴機(jī)制，也有非Caspase依賴機(jī)制。陳素艷等^[16]對(duì)缺血再灌注模型取樣后，檢測(cè)腦組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和Caspase-3m RNA水平，提示凋亡蛋白Caspase-9和Caspase-3 m RNA的水平上調(diào)在48 h達(dá)到頂值，然后不斷下降，研究表明缺血再灌注模型大鼠神經(jīng)損傷與凋亡蛋白上調(diào)密切相關(guān)，凋亡蛋白Caspase是凋亡中重要的分子。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠慢性間歇性低氧28 d后，間歇性低氧組肝組織形態(tài)學(xué)病理改變受損嚴(yán)重，白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平顯著升高，凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9的表達(dá)上調(diào)，提示慢性間歇性低氧引起肝損傷，機(jī)制可能與凋亡蛋白上調(diào)相關(guān)。凋亡蛋白Caspase3 和Caspase9可能參與慢性間歇性低氧引起肝損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu JN，Zhang JX，Lu G，et al．The effect of oxidative stress in myocardial cell injury in mice exposed to chronic in—termittent hypoxia[J]．ChinMedJ，2010，123（1）：74．

[2]Lavie L. Oxidative stress in obstructive sleep apnea and intermittent hypoxia-revisited-the bad ugly and good： implications to the heart and brain[J]. Sleep medicine reviews， 2015，20（3）：27.

[3]Meléndez GC， Mc Larty JL， Levick SP， et al. Interleukin 6 mediates myocardial fibrosis， concentric hypertrophy， and diastolic dysfunction in rats[J]. Hypertension （Dallas， Tex. ： 1979）， 2010，56（2）：225.

[4]Zhao L， Cheng G， Jin R， et al. Deletion of Interleukin-6 Attenuates Pressure Overload-Induced Left Ventricular Hypertrophy and Dysfunction[J]. Circulation research， 2016，118（12）：1918.

[5]張香紅．間歇性低氧誘導(dǎo)大鼠心肌損傷及依達(dá)拉奉的干預(yù)作用[D]．蘭州：蘭州大學(xué)，2021．

[6]Paschetta E，Belci P，A1isi A，et a1．OSAS-related infla-matory mechanisms of liver injury in nonalcoholic fatty liverdisease[J]．Mediators Inflamm，2015，20（5）：815721．

[7]楊勝昌，陳玲玲，傅天，等. 氫氣對(duì)慢性間歇性低氧大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷的改善作用[J]．中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2018，34（1）;61．

[8]Karkinski D，Georgievski O，Dzekova-Vidimliski P，et a1．Obstructive Sleep Apnea and Lipid Abnormalities[J]．Open Access Maced J Med Sci，2017，5（1）：19．

[9]范風(fēng)云，沈婉婷，鄭青青，等. 低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠體內(nèi)脂質(zhì)水平的變化[J]．中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016，32（5）：463．

[10]Han D， Gu X， Gao J， et al. Chlorogenic acid promotes the Nrf2/HO-1 anti-oxidative pathway by activating p21（Waf1/Cip1） to resist dexamethasone-induced apoptosis in osteoblastic cells [J]. Free radical biology & medicine， 2019， 137（6）： 1.

[11]Wasilewski m，Scorrano L.The changing shape of mitochondrial apoptosis［J］.Trends in Endocrino logy and Metabolism，2009，20（6）：287.

[12]孫琳，李俠，趙玉軍.細(xì)胞凋亡機(jī)制在無(wú)機(jī)汞致腎臟損害中作用的研究進(jìn)展［J］.工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病，2020，46（4）：341.

[13]Wu P B，Song Q，Yu YJ，et al.Effect of metformin on mitochondrial pathway of apoptosis and oxidative stress in cell model of nonalcoholic fatty liver disease［J］.Chinese Journal of Hepatology，2020， 28（1）：64.

[14]馬克． TGR5在膽鹽引起的肝內(nèi)膽管結(jié)石病肝內(nèi)膽管纖維化中的作用及機(jī)制初探[D]．遵義：遵義醫(yī)科大學(xué)，2022．

[15]Wenger RH.Cellular adaptation to hypoxia：O2-sensing proteinhydroxylases，hypoxia-inducible transcription factors，and O2-regulated gene expression[J].FASEB J，2002，16（3）：1151．

[16]陳素艷，張振香，高峰，等．常壓氧療對(duì)大鼠腦缺血再灌注后腦組織Caspase-9及Caspase-3 m RNA表達(dá)的影響［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，49（2）：203．

（責(zé)任編輯 胡安娜）