馬致潔+李奇+趙奎君+王伽伯++肖小河

[摘要]該文采用液相色譜質譜方法測定服用何首烏大鼠的血清代謝指紋譜，同時利用多元統(tǒng)計分析方法比較代謝譜差異并篩查顯著相關的生物標志物，考察其動態(tài)變化趨勢。探討何首烏致大鼠肝臟損傷的代謝組學動態(tài)變化，尋找其顯著相關的生物標志物，并考察標志物的動態(tài)變化趨勢，以期為何首烏致肝損傷的內(nèi)在機制與臨床早期診斷提供依據(jù)。結果顯示給藥后不同時間點大鼠的血清代謝輪廓存在一定的差異，經(jīng)比較分析，共篩選得到6個潛在生物標志物：oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol 和 7ahydroxydehydroepiandrosterone，這些標志物在何首烏致肝損傷動態(tài)過程中呈現(xiàn)一定的變化趨勢。所篩選到的生物標志物在給藥1周后含量即出現(xiàn)明顯變化，相比于ALT，AST來說更加敏感。一定程度上可揭示出何首烏造成肝損傷的動態(tài)機制以及肝臟自我修復表現(xiàn)，對于監(jiān)測服用何首烏患者肝功能、早期發(fā)現(xiàn)何首烏肝損傷具有潛在的應用價值和意義。

[關鍵詞]何首烏； 肝損傷； 代謝組學； 動態(tài)變化； 早期診斷； 內(nèi)在機制

近年來，中藥引發(fā)的肝損傷事件較為頻繁，尤其是一些傳統(tǒng)不認為是有毒的中藥如何首烏、決明子、大黃、柴胡、麻黃等的肝毒性問題日益突出[12]。何首烏始載于《開寶本草》，生何首烏性平，味甘、苦，歸心、肝、大腸經(jīng)；具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的功效。制何首烏性微溫，味甘、澀，歸肝、腎經(jīng)；具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、化濁降脂等功效，含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣質、磷脂和多糖等多種化學成分[3]。何首烏是傳統(tǒng)補益類中藥，與人參、靈芝和冬蟲夏草并列為祖國“四大仙草”。而關于何首烏肝毒性的頻發(fā)趨勢更是愈演愈烈，檢索知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫2005年至2014年10年間共有183例關于何首烏肝毒性的報道。近年來，國內(nèi)外不斷有文獻報道因服用生、制何首烏或含何首烏相關制劑而導致黃疸、肝炎和肝功能異常等患者[45]。以至于2014年度國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品不良反應中心公開通報口服何首烏及其成方制劑引起的肝損傷風險，并要求相關廠家根據(jù)品種實際和不良反應監(jiān)測情況完善藥品說明書的安全性信息等。

然而，何首烏致肝損傷的機制目前尚不明確，對其引發(fā)肝損傷的動態(tài)過程也缺乏有效的數(shù)據(jù)，因此導致臨床上辨識和診斷較為困難。課題組前期對何首烏致肝損傷進行了系列研究，臨床流行病學數(shù)據(jù)調查結果顯示，何首烏致肝損傷與患者服藥劑量、時間、性別、年齡均缺少明確的對應關系，具有特異質屬性[6]，同時發(fā)現(xiàn)何首烏本身也存在潛在肝毒性，為了充分暴露何首烏潛在毒性，前期課題組采用大劑量何首烏醇提物，考察其對大鼠多臟器的損傷作用，結果從組織病理上可以看出何首烏大劑量提取物對肝臟有明顯的損傷作用，但臨床常用的ALT，AST轉氨酶指標并無顯著變化[7]。鑒于此，本文采用課題組前期實驗的血清標本，對何首烏致肝損傷的大鼠進行動態(tài)血清代謝組學研究，旨在描述何首烏造成肝損傷的動態(tài)過程，運用代謝組學的方法尋找動態(tài)變化的生物標志物，初步探討何首烏致肝損傷的體內(nèi)代謝機制，以期為臨床何首烏肝損傷的動態(tài)監(jiān)測提供一定的依據(jù)，為臨床何首烏致肝損傷的臨床早期診斷提供輔助參考。

1材料與方法

11儀器與試劑高效液相色譜（Agilent 1200 HPLC，美國Agilent公司）四級桿飛行時間串聯(lián)質譜儀（Bruker microTOFQⅡ，德國Bruker公司），DataAnanlsis 工作站，Gradient A10 MillQ超純水器（法國Millipore公司），邁瑞B(yǎng)S300全自動生化分析儀（上海富眾生物科學有限公司），冷凍離心機（Sigma公司，德國），微量分析天平（Mettler Toledo AL204 瑞士），渦旋混勻器（HYQ 2121A）。生首烏購于北京綠野藥業(yè)有限公司（批號10050904），經(jīng)解放軍第三〇二醫(yī)院肖小河研究員鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥塊根；甲醇（色譜級，德國Merck公司）；去離子水經(jīng)（182 MΩ） Millipore MilliQ 系統(tǒng)（Millipore Co，美國） 超純水器凈化，其他試劑均為市售分析純。谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）檢測試劑盒（南京建成科技有限公司）。

12動物SD大鼠，SPF級，體重160 g左右，雄性，共12只，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號SCXK軍2007004。動物飼養(yǎng)于屏障動物房，室溫（20±2） ℃，相對濕度60%～70%，通風良好、環(huán)境安靜，室內(nèi)保持12 h照明，12 h黑暗，并定期消毒。

13試藥將生何首烏粉碎得粗粉，加6倍量的75%乙醇冷浸提取，共提取5次，每次48 h，合并醇浸提取液，濃縮并減壓干燥，制得干粉備用。每次給藥前按配制藥液，水浴加熱至37 ℃時使用。

14樣本收集給藥劑量為40 g·kg-1，按每200 g體重5 mL灌胃給藥，連續(xù)給藥28 d（4周）以制備肝損傷大鼠模型。給藥期間大鼠自由飲食，每日觀察給藥前后每只動物的外觀體征、行為活動、毛發(fā)變化、大小便形狀、顏色及有無異常分泌物等。給藥期間每7 d大鼠眼眶取血，分離血清后置于-80 ℃冰箱。

15樣品預處理與LCMS/MSQTOF檢測樣品預處理：將大鼠血清于-80 ℃冰箱中取出，復融，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL的甲醇溶液，混勻，靜置，4 ℃下冷凍離心（1萬 r·min-1，10 min），取上清，并用022 μm微孔濾膜濾過，備用。

LCMS/MSQTOF檢測：采用Agilent ZORBAX SBC18（21 mm×150 mm，5 μm）色譜柱；柱溫25 ℃，流速025 mL·min-1，進樣量為20 μL，樣品溫度4 ℃，檢測波長420 nm；流動相A：甲醇，流動相B：水；梯度洗脫（0～5 min：甲醇30%～90%；5～51 min：甲醇90%；51～40 min：甲醇90%～30%）；離子源ESI±；毛細管電壓3 500V；相對分子質量數(shù)50～1 000；碰撞能7 eV；錐孔能5 eV；脫溶劑氣流量60 L·min-1；脫溶劑氣溫度180 ℃。

16數(shù)據(jù)處理與分析將所測數(shù)據(jù)采用DataAnalysis和Mzmine軟件進行色譜峰識別，再將數(shù)據(jù)導入SIMCAP 11軟件，標準化后進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別（PLSDA）分析。運用variable influence in the projection（VIP）方法來預測各個數(shù)據(jù)對模型的貢獻值，VIP>1說明具有明顯的貢獻，有統(tǒng)計學意義，為可能的潛在標志物。再采用OneWay ANOVA的方法，根據(jù)P<005的原則，排除沒有顯著性差異的數(shù)據(jù)。最后在Human Metabolome Database，KEGG數(shù)據(jù)庫中進行匹配，并用標準品進行定位后，最終得到潛在的生物標志物。

2結果

2結果

21何首烏致肝損傷大鼠的動態(tài)血清PCA主成分分析本實驗連續(xù)給藥4周，經(jīng)PCA分析各周大鼠的血清代謝物，結果表明：從第1周到第4周，大鼠血清代謝物呈現(xiàn)順時針的變化趨勢，也就是說何首烏擾亂了大鼠的體內(nèi)代謝平衡，從第1周的輕微擾亂到第4周的嚴重擾亂，同時也體現(xiàn)出大鼠體內(nèi)生物代謝發(fā)生紊亂，從而反映到代謝物的不斷變化水平上。

22何首烏致肝損傷大鼠的動態(tài)血清PLSDA分析為了進一步闡明何首烏肝損傷大鼠血清代謝物的變化，本文在PCA模型基礎上擬合偏最小二乘法判別分析（PLSDA）模型，旨在發(fā)現(xiàn)各周大鼠血清之間的差異，以尋找引起肝損傷變化的因素。PLSDA分析也表明各周大鼠血清的代謝物呈現(xiàn)一定的變化趨勢，同時也反映出何首烏肝損傷大鼠體內(nèi)代謝的紊亂程度以及變化情況。從載荷圖中可以看出：圖中每一個“”代表一種代謝□給藥1周后；給藥2周后；給藥3周后；*給藥4周后。

物，其距離中心越遠，說明該代謝物在各周大鼠中的差異性越大，也就是說此代謝物可能是何首烏導致大鼠發(fā)生肝損傷的生物標志物，其隨著肝損傷的不斷惡化而相應改變，在微觀水平上體現(xiàn)何首烏肝損傷大鼠體內(nèi)代謝的紊亂以及變化趨勢；再者，通過結合VIP變量權重分析，可以看出大鼠血清中的生物標志物的變量權重，變量權重越大，說明該標志物在各周大鼠血清之間的差異性也越大（圖4）。一般意義上認為VIP>1為具有統(tǒng)計學意義，說明該物質對模型的構建具有顯著的貢獻。本文則選取VIP>2的物質作為潛在的生物標志物，旨在發(fā)現(xiàn)與何首烏致肝損傷大鼠動態(tài)血清變化高度相關的生物標志物，同時也探索與肝損傷嚴重程度高度相關的生物標志物。圖2何首烏致肝損傷大鼠的動態(tài)血清PLSDA分析

23何首烏致肝損傷大鼠的動態(tài)血清生物標志物篩查通過檢索人類代謝物數(shù)據(jù)庫（HMDB），發(fā)現(xiàn)與何首烏肝損傷大鼠動態(tài)血清變化（1～4周）內(nèi)顯著相關的6個生物標志物，具體為oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol 和 7ahydroxydehydroepiandrosterone。這6個生物標志物的VIP值均在20以上，且在各周大鼠的血清中呈現(xiàn)一定的變化趨勢（表1）。如oleamide在第1周時含量最高，但從第2周時開始迅速下降；lysoPC（16∶0）從第2周時迅速升高，第3周時則出現(xiàn)明顯下降，第4周仍處于下降趨勢（圖5）。由此可見，何首烏致肝損傷大鼠在第1周到第4周時其中的標志物呈現(xiàn)一定的變化趨勢。

3討論

本實驗結果表明，何首烏在引發(fā)大鼠肝損傷的過程中血清代謝物呈現(xiàn)一定的變化趨勢，但是常規(guī)肝功指標ALT和AST對于何首烏引發(fā)的肝損傷不敏感，本實驗中大鼠分別給予何首烏4周后ALT和AST未見明顯升高，而僅在第3天生首烏組一過性升高[7]，ALT和AST對何首烏引發(fā)的肝損傷不敏感，無法進行早期監(jiān)測。而本文動態(tài)代謝組學研究表1何首烏致肝損傷大鼠動態(tài)血清生物標志物篩查

結果表明在第2周時大鼠體內(nèi)即發(fā)生輕微程度的代謝紊亂，體內(nèi)代謝物對何首烏肝損傷的敏感性高于臨床常用的ALT和AST肝功能生化指標。

同時本文對何首烏造成大鼠肝損傷的1～4周進行動態(tài)血清代謝組學監(jiān)測，結合多維統(tǒng)計學方法篩選出高度相關的6個生物標志物，分別為oleamide，lysoPC（16∶0），leukotriene A4，transtetradec2enoic acid，dihydrocortisol和7ahydroxydehydroepiandrosterone，這些標志物在肝損傷動態(tài)期間也呈現(xiàn)一定的變化趨勢。其中，oleamide（油酸酰胺）屬于脂肪酸，作為動物體內(nèi)的一種內(nèi)源性物質，參與體內(nèi)的神經(jīng)遞質系統(tǒng)發(fā)揮受體激動作用。有關研究表明[89]：oleamide在乙型肝炎病毒導致的肝癌患者的肝臟組織中含量相比于正常人群顯著降低，但是在酒精性肝硬化患者中則顯著升高。而該文研究也表明oleamide在何首烏致大鼠肝損傷的動態(tài)過程中呈現(xiàn)總體下降的趨勢，其可作為體現(xiàn)肝臟病變的重要標志物。lysoPC（16∶0）是一種溶血卵磷脂，是構成生物膜的重要組分，起到細胞內(nèi)外物質交換的作用。Chamulitrat等研究發(fā)現(xiàn)四氯化碳誘導的急性肝損傷模型中肝臟的卵磷脂合成也受到抑制[10]，而溶血卵磷脂作為卵磷脂的亞型，當肝臟受到損傷時體內(nèi)的溶血卵磷脂也會發(fā)生一定程度的紊亂。leukotriene A4（白三烯A4）可參與宿主防御反應、直接過敏及炎癥相關反應，是花生四烯酸代謝的中間體。其在體內(nèi)的生物合成與催化主要位于肝臟細胞的微粒體中[11]，一旦肝臟受到損傷，其含量水平必然會發(fā)生異常。transtetradec2enoic acid是體內(nèi)肝臟合成脂肪酸的中間體，至今為止尚未發(fā)現(xiàn)其與肝損傷有關的相關報道，本研究是首次發(fā)現(xiàn)該標志物與何首烏造成的肝損傷密切相關。dihydrocortisol是膽汁酸合成的中間體、甾體激素代謝以及P450代謝的重要組分，至今也未有其與肝損傷相關的報道。7ahydroxydehydroepiandrosterone是肝臟P450酶催化脫氫表雄酮的主要代謝物[12]，有研究表明[13]其是體內(nèi)調節(jié)糖皮質激素水平的重要物質。

所發(fā)現(xiàn)的代謝標志物如lysoPC（16∶0）從第2周時迅速升高，第3周時則出現(xiàn)明顯下降，第4周仍處于下降趨勢，比ALT，AST更敏感，因此對于監(jiān)測服用首烏患者肝功能、早期發(fā)現(xiàn)首烏肝損傷具有潛在應用價值和意義，后續(xù)將在人體標本中進行深入驗證和檢驗。

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[收稿日期]20160907

[基金項目]國家自然科學基金項目（81373944）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（2012KTCQ0313）

[通信作者]*王昌利，教授，主要從事中藥制劑工藝質量評價體系研究，Email：wcl3433@163com；*宋逍，博士，副教授，主要從事天然藥物純化及新劑型的研究，Email：songxiao1999@sohucom

[作者簡介]柏希慧，碩士研究生，主要從事中藥制劑工藝質量評價體系研究，Email：295974924@qq