田立杰 聶丹丹 丁旭 閆聰 李玲 孫玉 羅雁非*

（1.長春海關(guān)技術(shù)中心 吉林長春 130062；2.吉林國際旅行衛(wèi)生保健中心；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)研究院）

0 引言

食源性致病菌是引起食品安全問題的主要因素之一，新鮮水產(chǎn)品中往往帶有大量微生物，多種致病菌可同時長期存活于水體環(huán)境中，增加水產(chǎn)品在養(yǎng)殖過程中被致病菌污染的可能性，進而造成人類食物中毒[1-4]。 沙門氏菌、阪崎腸桿菌等致病菌可導(dǎo)致許多嚴重疾病，沙門氏菌是一種廣泛分布于自然界中的危害極大的腸道致病菌，人類感染沙門氏菌可引起傷寒、副傷寒、感染性腹瀉、食物中毒、敗血癥、胃腸炎和菌血癥等癥狀[1-2，4]，感染阪崎腸桿菌主要表現(xiàn)為敗血癥、致死性小腸結(jié)腸炎、膿毒癥、腦膜炎和菌血癥等[4]。

隨著人們對食品安全的重視程度與食品安全監(jiān)督監(jiān)測需求的不斷提高，以及進出口貿(mào)易的需要，傳統(tǒng)的微生物檢測方法通過增菌培養(yǎng)、分離純化、生化鑒定等進行鑒定[17]，因檢測步驟繁瑣、檢測周期長、效率低、對人員要求高，同時因低靈敏度和低特異性導(dǎo)致容易錯判等問題[5-7]，難以滿足現(xiàn)代貿(mào)易快速檢測的要求和食品安全監(jiān)督監(jiān)測的需要。 水產(chǎn)品中致病菌檢測的現(xiàn)行標準GB 4789.20[8]仍要求使用傳統(tǒng)方法，檢測步驟繁瑣、檢測時間長，難以滿足新鮮水產(chǎn)品的貿(mào)易和檢測需求，因此，開發(fā)更加快速高效的檢測水產(chǎn)品中沙門氏菌和阪崎腸桿菌的方法具有實際意義。

如今，有許多免疫學(xué)、分子生物學(xué)、生物傳感器等新檢測方法被應(yīng)用于水產(chǎn)品中致病菌的檢測鑒定[11-13，16]。目前，對于水產(chǎn)品中沙門氏菌的檢測，有多重PCR 方法、實時熒光PCR、微滴數(shù)字PCR 方法[11-13，16]，例如：麻麗丹等[2]建立了Taqman MGB PCR 定量檢測水產(chǎn)品中沙門氏菌的方法；麻春陽等[14]建立了多重實時熒光串聯(lián)PCR 技術(shù)高通量檢測生蠔中9 種致病菌的方法；李亞茹等[15]采用免疫磁珠分離實時熒光PCR 快速檢測蝦中沙門氏菌。但對于水產(chǎn)品中阪崎腸桿菌的分子生物學(xué)等快速檢測方法并不多見，尚未有一種簡單高效的多重檢測方法，能在短時間內(nèi)同時快速地檢測水產(chǎn)品中沙門氏菌和阪崎腸桿菌這2 種致病菌。

本研究以水產(chǎn)品中常見的貝類產(chǎn)品為目標，設(shè)計引物探針， 建立雙重實時熒光PCR 檢測方法，可用于水產(chǎn)品中沙門氏菌和阪崎腸桿菌的同時快速檢測，對指導(dǎo)水產(chǎn)品中致病菌的檢測、加強食品安全監(jiān)督監(jiān)測工作、保護水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)、促進水產(chǎn)品進出口貿(mào)易發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

研究中所需海虹、扇貝、蜆子、鮑魚、牡蠣、毛蚶、血蚶、鳳螺、烏賊、蟶子，10 種貝類產(chǎn)品均采購于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

對實驗室樣品（紅貝、黃貝、紋貝、象貝）4 種貝類產(chǎn)品進行本底實驗，每種平行3 次。

對未添加標準物質(zhì)的樣品進行本底測試實驗，檢測樣品本底是否有含有目標菌。確定陰性樣品后，將已購置的待檢測2 種標準菌： 沙門氏菌（ATCC 12011）和阪崎腸桿菌（JL.2046），以及本研究選用的非目標菌株如上處理進行特異性實驗， 選用的菌株如下：金黃色葡萄球菌（ATCC 12600）、蠟樣芽胞桿菌（ATCC 11176）、李斯特菌（ATCC 19119）、普通變形桿菌（ATCC 33420）、小腸耶爾森菌（ATCC 23715）、大腸桿菌（ATCC 11229）、克雷伯氏菌（ATCC 43086）、糞腸球菌（ATCC 14500）、單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111）、陰溝腸桿菌（ATCC10146）、志賀氏菌（JL 08036）。

1.2 試劑

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實驗用水符合GB/T 6682 中二級水的要求。

緩沖蛋白胨水（BPW，見GB 4789.4 中A.1）：2×Taq PCR Master Mix（批號：N20630）、2% CTAB（批號：HC28172940）、10×Tris/Tricine/SDS Buffer（批號：20200510）；蛋白酶K（批號：No.160020444，QIAGEN）；三氯甲烷（氯仿） CHCl3（批號：20161225，北京化工廠）；異戊醇C5H12O（批號：20000805，沈陽市水豐化學(xué)試劑）；無水乙醇 C2H5OH（批號：20180518，北京化工廠）；TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（批號：#S7628）；實時熒光PCR 2 倍預(yù)混液（批號：00699230，ABi）。

1.3 儀器

Milli-Q-Integral 5 型純水/超純水系統(tǒng)（美國密理博）；AL104IC 型電子天平 （中國梅特勒）；MLS-3780 型高壓滅菌器 （日本三洋）；7A0-0052 型核酸蛋白檢測儀（日本日立公司）；Elf-Pad 型金屬浴（中國北京佰歐創(chuàng)投生物科技有限公司）；FORCE 7 型離心機（美國丹法）；E-centrlfuge 型離心機（美國威泰克）；MICRO ONE 型離心機（日本 TOMY）；S20K型酸度計（中國上海梅特勒）；Vortex.Genie 2 型漩渦混合器（美國SI 公司）；SLM-140AY65 型制冰機（日本三洋）；QuantStudio 7 熒光定量PCR 儀 （美國ABI）；0.1～2.5 μL 型移液器、2～20 μL 型移液器、20～200 μL 型移液器、100～1 000 μL 型移液器（德國eppendorf 公司）。

1.4 樣品處理

對紅貝、黃貝、紋貝、海虹、扇貝、蜆子、象貝7種常見水產(chǎn)品進行本底實驗，每種平行3 次。 取樣方法：使用無菌剪刀打開至少10 個貝類，取出貝類消化腺置于無菌培養(yǎng)皿中，收集2.0 g，將消化腺勻漿后裝入無菌離心管中，在無菌條件下對貝類進行取樣并均質(zhì)。 對未添加標準物質(zhì)的樣品進行本底測試實驗，檢測樣品本底是否含有目標菌。 確定陰性樣品后，將已購置的待檢測2 種標準菌復(fù)壯，制成陽性對照品，制成一定濃度的菌懸液，按照濃度0.5、1、5、10 CFU/mL對原樣品進行添加、均質(zhì)，做靈敏度實驗及特異性實驗。

沙門氏菌按照GB 4789.4—2016 方法進行[9]；阪崎腸桿菌培養(yǎng)按照GB 4789.40—2016 方法進行[10]；非目標菌株增菌采用LB 培養(yǎng)液36℃培養(yǎng)24 h 的方法。

1.5 細菌模板DNA 的提取

對于上述方法培養(yǎng)的增菌液，各取增菌液1 mL均加至1 個1.5 mL 無菌離心管中，8 000 r/min 離心5 min，盡量吸棄上清液，加入500 μL CTAB、40 μL蛋白酶K，震蕩均勻，65℃溫浴30 min；加入500 μL三氯甲烷：異戊醇（24∶1），震蕩，12 000 r/min 離心15 min；吸取上層水相至1.5 mL 離心管中，加入等體積的異丙醇，震蕩均勻，12 000 r/min 離心10 min；棄上清液，用預(yù)熱至65℃TE 緩沖液溶解DNA（TE 量視DNA 沉淀的多少而定）；加入5 μL RNA 酶溶液，37℃溫浴30 min； 加入200 μL 三氯甲烷： 異戊醇（24∶1），震蕩，12 000 r/min 離心15 min；吸取上層水相至新的1.5 mL 離心管中， 加入等體積的異丙醇，震蕩均勻，12 000 r/min 離心10 min；棄上清液，加入70%乙醇洗滌沉淀DNA，12 000 r/min 離心1 min；棄上清液，干燥，加50 μL 預(yù)熱至65℃TE 緩沖液溶解DNA。

取適量DNA 溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后， 使用核酸蛋白檢測儀測定260 nm 和280 nm 處的吸收值，從而確定DNA 濃度最優(yōu)濃度范圍，以便PCR 擴增。

1.6 引物探針

參考了國內(nèi)外學(xué)者相關(guān)研究論文和試驗結(jié)論，引物的序列見表1。 沙門氏菌特異性基因序列、阪崎腸桿菌的特異性基因序列。

表1 PCR 檢測的靶基因、引物序列Table 1 Target Gene and primer sequence of PCR

沙門氏菌和阪崎腸桿菌得到如下的反應(yīng)體系和擴增參數(shù)：沙門氏菌模板DNA 5 μL，上、下游引物各1 μL， 探針1 μL； 阪崎腸桿菌模板DNA 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，探針0.5 μL；2×dd PCR 預(yù)混液15 μL，反應(yīng)體積為20 μL（見表2）。

表2 雙重PCR 反應(yīng)體系Table 2 Dual PCR reaction system

1.7 目的基因片段PCR 擴增

實時熒光PCR 循環(huán)參數(shù)：50℃預(yù)變性2 min，94℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，循環(huán)40 次。

1.8 PCR 擴增產(chǎn)物測序及數(shù)據(jù)處理

將剩余的PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行雙向測序，應(yīng)用EditSeq 軟件編輯整理，在GenBank 上進行Blast 比對驗證物種。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料已均數(shù)±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法檢驗，檢驗水準（雙側(cè)），P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 表示極差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗

本研究采用雙重實時熒光PCR 方法對沙門氏菌和阪崎腸桿菌的引物進行特異性研究 （見圖1）。陰性菌為：副溶血弧菌（ATCC 17802）、霍亂弧菌（JL.08108）、單核細胞增生李斯特氏菌（ATCC 19111）、李斯特菌（ATCC 19119）、普通變形桿菌（ATCC 33420）、金黃色葡萄球菌（ATCC 12600）、小腸耶爾森菌（ATCC 23715）、克雷伯氏菌（ATCC 43086）、糞腸球菌（ATCC 14500）、蠟樣芽胞桿菌（ATCC 11176）、奇異變形桿菌（JL08017）。沙門氏菌和阪崎腸桿菌均在35 個循環(huán)內(nèi)發(fā)生顯著擴增，而對照菌株均無顯著性檢測信號，亦未出現(xiàn)非特異性擴增信號，表明設(shè)計的2 對引物特異性好、識別度高、無干擾現(xiàn)象。 實驗結(jié)果表明，引物對沙門氏菌和阪崎腸桿菌的擴增具有特異性。

圖1 沙門氏菌和阪崎腸桿菌雙重引物特異性實時熒光PCRFig.1 Dual primer specific real-time fluorescent PCR of Salmonella and Enterobacter sakazakii

2.2 重復(fù)性試驗

本研究對沙門氏菌和阪崎腸桿菌設(shè)定30 次重復(fù)性實驗（見圖2），實驗結(jié)果表明，實時熒光PCR對其擴增穩(wěn)定且重復(fù)性良好，實驗數(shù)據(jù)可信。

圖2 沙門氏菌和阪崎腸桿菌重復(fù)性實驗Fig.2 Repeatability experiment of Salmonella and Enterobacter sakazakii

2.3 靈敏性試驗

將測得濃度為108CFU/mL 的DNA 溶液按照10 倍濃度依次稀釋， 取濃度為108～103CFU/mL 的基因序列進行檢測，前4 個梯度設(shè)置8 個重復(fù)，后4 個梯度設(shè)置4 個重復(fù)，其結(jié)果見圖3 和圖4。

圖3 沙門氏菌和阪崎腸桿菌雙重靈敏性實驗Fig.3 Double sensitive experiment of Salmonella and Enterobacter sakazakii

圖4 沙門氏菌和阪崎腸桿菌6 個連續(xù)稀釋度標準曲線Fig.4 Standard curves for six consecutive dilutions of Salmonella and Enterobacter sakazakii

從濃度103CFU/mL 開始，各梯度均出現(xiàn)明顯擴增曲線，可判斷該引物探針的檢出限為濃度103CFU/mL。實驗結(jié)果表明， 引物探針對沙門氏菌和阪崎腸桿菌的擴增有較好的靈敏性。

2.4 本底試驗

本實驗采用14 種貝類進行本底實驗，每種平行3 次，進行本底實驗，經(jīng)實驗驗證均未檢出沙門氏菌和阪崎腸桿菌。

3 討論

按照我國食品安全國家標準要求， 沙門氏菌和阪崎腸桿菌在水產(chǎn)品中均不得被檢出， 這2 種致病菌的快速檢測方法開發(fā)也成為食品安全檢測中的研究熱點。

傳統(tǒng)的水產(chǎn)品中沙門氏菌和阪崎腸桿菌的檢測方法，對檢驗人員的經(jīng)驗要求較高，且耗時長、效率低，容易造成檢測結(jié)果誤判。 而實時熒光PCR 技術(shù)成本低、準確性高、靈敏度高、操作簡單、自動化程度高，可同時檢測大量樣品，提高了檢測效率，縮短了檢測周期，實用性強，而且不易出現(xiàn)結(jié)果誤判。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，RT-PCR 技術(shù)鑒定病原菌具有較高的靈敏度，且檢測周期明顯縮短，因可同時檢測2 種致病菌， 比單一RT-PCR 檢測更迅速、簡便，且更節(jié)約成本。 雙重RT-PCR 雖在時效性及操作簡便等方面有明顯優(yōu)勢， 但其要求多個不同靶基因片段同時擴增， 因而在引物設(shè)計、 反應(yīng)條件的優(yōu)化、反應(yīng)體系的配置等環(huán)節(jié)均需反復(fù)試驗，建立最佳反應(yīng)條件， 以期最大程度上避免非特異性擴增及片段間的競爭性擴增，實現(xiàn)高效靈敏、特異性強的擴增反應(yīng)，具有一定難度。

傳統(tǒng)水產(chǎn)品中致病菌檢測方法耗時較長， 在國際貿(mào)易中形成時間障礙， 應(yīng)用有效的分子生物學(xué)等快速檢測方法有助于解決主要問題。 本研究開發(fā)出了一種可用于貝類中沙門氏菌和阪崎腸桿菌的雙重實時熒光PCR 檢測方法， 可在一個PCR 管內(nèi)特異靈敏地檢測2 種目標致病菌， 適用于沙門氏菌和阪崎腸桿菌的鑒定， 在食品和水源的衛(wèi)生監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查方面也有一定的應(yīng)用潛力。 該方法具有成本低、可靠性高和檢測快速的優(yōu)點，易于推廣使用，在食源致病菌同時多重檢測平臺的建立中具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究建立的雙重實時熒光PCR 檢測方法具有快速高效、靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好的優(yōu)點， 可用于貝類中沙門氏菌和阪崎腸桿菌的同時快速檢測，本研究為貝類中沙門氏菌、阪崎腸桿菌的快速鑒定探索了有效的檢測方法， 為控制貝類產(chǎn)品致病菌污染提供了有效手段。