汪菊 王維霞 姜永莉 陳天藍 梁譽斌 楊丁一 王苗苗 鄒明強

（1．綿陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 四川綿陽 621050；2．中國檢驗檢疫科學研究院；3．吉林國際旅行衛(wèi)生保健中心；4.珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司）

0 引言

隨著涮肉、燒烤、火鍋的興起，牛肉、羊肉、鴨血市場消費群體在快速擴大，但目前其產(chǎn)量遠遠達不到市場需求，肉制品、鴨血成為在食品生產(chǎn)、加工、流通及餐飲領域中造假摻假的主要目標[1-2]。 部分不法企業(yè)和商販用低價肉或非肉成分冒充高價肉，在牛肉、羊肉、鹿肉等高價肉制品中摻雜雞肉、鴨肉等低價肉及采用廉價的雞血、牛血、豬血等動物血冒充鴨血，這些造假摻假的欺詐違法行為對人民健康、消費者權益、 市場公平交易機制及宗教信仰等造成巨大威脅[3-4]，已成為社會關注的焦點。

近年來，以蛋白質(zhì)和核酸為基礎的肉類摻假檢測技術逐漸興起，研究表明，利用免疫學方法可以定量地測定出動物源成分[5-8]。 其中微孔板ELISA 在定量靶標表征上有較高的精確度[9-10]。 Macedo-Silva 等[11]采用ELISA 檢測法制作牛、馬、豬、雞蛋白的抗血清來鑒別漢堡中可能摻入的廉價肉類成分， 靈敏度為0.6%。 胡連霞等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GNM C7-8 實時熒光PCR 檢測法能夠對同時添加4 類假肉的成分進行檢測，使檢測速率得到進一步提高。但這些傳統(tǒng)的動物源性成分檢測方法仍存在檢測時間長、效率低、成本高等問題，難以滿足批量大、操作簡便、現(xiàn)場快速的檢測要求?；谝陨显颍⒁环N快速、即時、高效、成本低且適于大批量樣本的檢測方法迫在眉睫。本文運用數(shù)字微流控芯片平臺并結合聚合酶鏈反應法（PCR）對牛肉、羊肉、鴨血樣品進行源性成分初篩檢測，并與GB/T 38164—2019 和SN/T 2051—2008標準方法進行比對。

1 數(shù)字微流控芯片平臺原理

1.1 環(huán)介導等溫擴增技術LAMP （loop-mediated isothermal amplification）原理

為克服傳統(tǒng)PCR 技術的反復升降溫過程，數(shù)字微流控芯片平臺應用了環(huán)介導等溫擴增技術LAMP（loop-mediated isothermal amplification）技術，使實驗過程快速、簡便，儀器便攜，檢測結果特異性強、靈敏度高。

LAMP 擴增反應體系主要包括核苷酸、Bst DNA聚合酶、 引物組和含有鎂離子的反應緩沖液。 Bst DNA 聚合酶由嗜硬脂芽孢桿菌中分離得到，具有鏈置換活性和5′-3′聚合酶活性的耐熱DNA 聚合酶，但缺乏任何3′-5′外切酶活性，因此不會水解先前合成的DNA 鏈[13]。 LAMP 擴增一般需要4～6 個特異性引物， 靶向DNA 上有6 個不同區(qū)域（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c 和B3c）。 該組引物包括2 個內(nèi)部引物，稱為正向內(nèi)部引物（FIP）和反向內(nèi)部引物（BIP），而F3和B3 是2 個外部引物，也稱為“置換引物”（圖1，擴增過程使用恒溫60～65°C 進行快速連續(xù)擴增，無需變性或退火）[14]。

圖1 靶向DNA 的6 個不同區(qū)域（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c 和B3c）；正向內(nèi)部引物（FIP），反向內(nèi)部引物（BIP）；正向外部引物F3 和反向外部引B3Fig.1 Targeting six different regions on the DNA（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c and B3c），F(xiàn)orward inner primer（FIP），Reverse internal primers（BIP），F(xiàn)orward external primer F3 andReverse external reference B3

LAMP 反應分3 步完成， 即起初反應物模板合成、循環(huán)擴增及延伸和再循環(huán)。

1.1.1 反應模板合成階段

內(nèi)部引物FIP 和模板DNA 的F2c 區(qū)段結合，啟動互補鏈的合成；F3 與模板鏈上F3c 區(qū)段結合，通過Bst 酶引發(fā)鏈置換反應，與模板DNA 形成雙鏈結構，并釋放內(nèi)部引物FIP 置換合成的互補鏈；FIP 延伸單鏈5′端F1 序列以與F1c 序列堿基互補，形成莖環(huán)結構。

內(nèi)部引物BIP 以與模板DNA 互補的FIP 延伸單鏈為模板，啟動互補鏈的合成，形成雙鏈DNA；B3插入雙鏈DNA 中，與FIP 延伸鏈的B3c 區(qū)段結合，引發(fā)鏈置換反應， 釋放出兩端具有互補區(qū)域的DNA，形成啞鈴狀結構的起始反應模板[15]。

1.1.2 循環(huán)擴增階段

啞鈴型結構中，以F1 片段的3′端為起點，以自身為模板進行DNA 合成延伸。 同時，F(xiàn)IP 引物的F2與啞鈴環(huán)上的單鏈F2c 雜交， 開始新一輪的鏈置換反應。 解離由F1 片段合成的雙鏈核酸，解離出的單鏈核酸上會形成環(huán)狀結構[15]。

1.1.3 延伸和再循環(huán)階段

環(huán)狀結構上有單鏈形式的B2c，BIP 引物上的B2 與其雜交，開始新一輪擴增。經(jīng)過一系列放大，形成新的產(chǎn)物鏈和雙鏈長度延伸的錘狀結構， 并將以同樣方式進一步延伸。隨后的循環(huán)反應，莖的長度和環(huán)的數(shù)量逐漸增加， 最終產(chǎn)物是莖環(huán)DNA 的混合物， 即含有數(shù)個莖長度和椰菜花狀結構的莖環(huán)結構（圖2）[16-17]。

圖2 反應物模板合成；循環(huán)擴增階段以及延伸和再循環(huán)Fig.2 Reactant template synthesis；Cyclic amplification stages as well as elongation and recirculation

1.2 數(shù)字型微流控芯片結構及運行

本研究采用數(shù)字微流控Virus Hunter 檢測設備及動物源性6 項成分核酸檢測芯片試劑盒。

動物源性6 項成分核酸檢測芯片的工作原理是： 當一個液滴覆蓋2 個電極時， 其中一個電極通電，EWOD 力將液滴從未帶電的電極拖到帶電的電極上。 檢測芯片結構如圖3 所示，分為加樣區(qū)、移液區(qū)、分液區(qū)和反應區(qū)。

圖3 數(shù)字型微流控恒溫擴增芯片結構示意圖Fig.3 Structure diagram of digital microfluidic thermostatic amplification chip

待測樣本核酸與擴增反應試劑的混合液從加樣區(qū)通過電場驅動力移動至分液區(qū)， 再通過特殊的電極將液滴平均分成5 μL 體積，并移動至芯片反應區(qū)的反應點上與預存的檢測試劑融合進行擴增反應。芯片的反應點上存儲了檢測目標動物源性引物檢測試劑，不同反應點分別檢測不同目標動物源性基因，因此能夠同時對不同目標動物源性基因進行多靶點檢測。 檢測芯片的反應點通過發(fā)熱絲加熱給反應區(qū)提供熱量至恒溫擴增所需溫度， 通過熒光讀取檢測信號，用于結果判斷。

1.3 數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測原理

數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測是運用數(shù)字微流控介電潤濕型液滴操縱技術，利用液滴在疏水化表面介電潤濕現(xiàn)象，通過控制微電極陣列上液滴接觸角變化，實現(xiàn)離散液滴精確控制。 該快速檢測技術既有樣品消耗量少、熱轉換快速的特點，又有高平行性和自動化功能，同時不依賴微泵、微閥或微混合器等元件，無需復雜的三維流體體通道，具有構建簡單、可動態(tài)配置的優(yōu)點。因此特別適用于高集成度、高性能、操作復雜的生物、化學微全分析體系，見圖4。

圖4 數(shù)字微流控芯片平臺檢測多種動物源性成分示意圖Fig.4 Digital microfluidic chip platform for the detection of various animal-derived components process diagram

當檢測點對應的曲線為S 型擴增曲線時， 則表示該檢測點對應的待測結果為陽性； 當檢測點對應的曲線無S 型擴增曲線時， 則表示該檢測點對應的待測結果為陰性。 如圖5 所示，該結果表明，豬動物源性成分、牛動物源性成分均為陽性，雞、鴨、鵝及羊動物源性成分均為陰性。

圖5 微流控芯片平臺檢測多種動物源性成分結果圖Fig.5 Results of various animal-derived components detected by microfluidic chip platform

2 實驗部分

2.1 儀器設備與材料

熒光定量PCR 儀（德國耶拿公司）；Virus Hunter檢測設備（中檢國研（北京）科技有限公司）；動物源性6 項成分核酸檢測芯片試劑盒（雞、鴨、鵝、豬、牛、羊恒溫熒光法，械檢科技（北京）有限公司）；動物組織基因組DNA 快速提取試劑盒（含Buffer A、Buffer B 等，械檢科技（北京）有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品準備

隨機采購市售牛肉、 羊肉、 鴨血樣品共100 批次，其中牛肉49 批次，羊肉20 批次，鴨血31 批次。

2.2.2 樣品預處理

取樣要求：對于整塊組織樣品，剪取樣品的中心組織成分5～10 g；對于小切塊的混合樣品，選取若干小塊樣品，各切塊分別剪取其中心組織1～2 g，混合各組分對于加工樣品如肉卷、肉片、肉丸等樣品，選取若干片/個組分，混合各組分；對于粉碎加工的肉沫樣品，在樣品5 個不同部位分別稱取1～2 g，混合各組分。

均質(zhì)處理： 使用均質(zhì)機對上述樣品進行破碎處理，轉移破碎后的樣品5 g 至無菌均質(zhì)袋中，加入10 mL 生理鹽水進行均質(zhì)混勻。

2.2.3 基因組DNA 提取及檢測

取均質(zhì)處理后的均質(zhì)組織20～30 mg，轉移至離心管A 中，加入500 μL Buffer A，震蕩混勻，80℃下熱浴10～15 min。 熱浴完成后，取10 μL 上清液至離心管B 中，加入90 μL Buffer B 進行中和混勻，中和后的液體即為DNA 溶液。按照動物源性6 項成分核酸檢測芯片試劑盒（雞、鴨、鵝、豬、牛、羊恒溫熒光法）使用說明書進行上機檢測（于潔凈環(huán)境下操作）。

3 結果與分析

3.1 數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測法

本實驗共采購樣品100 批次， 采用2.2 方法進行檢測。結果顯示，14 批次明示肉源結果的樣品（牛肉3 批次，羊肉4 批次，鴨血7 批次）中，鴨血的陽性檢出率為22.5%， 牛肉、 羊肉的陽性檢出率分別為6.1%和20.0%， 且所有樣品均未檢測出雞源性成分及鵝源性成分，具體結果見表1。

表1 14 批與明示肉源不符合的樣品檢測結果Table 1 Test results of 14 batches of samples that do not match the stated meat source

3.2 與實時熒光PCR 法對比

根據(jù)3.1 可知， 本次檢測出的肉源性成分只有牛動物源性成分、羊動物源性成分、鴨動物源性成分及豬動物源性成分。因此，本文按照國家標準GB/T 38164—2019 《常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR 法》[18]和SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時PCR法》[19]只對牛、羊、鴨、豬等4 種動物源性成分進行了確證檢測實驗。 其中，按照GB/T 38164—2019 方法對鴨、豬動物源性成分進行檢測，按照SN/T 2051—2008 方法對牛、羊動物源性成分進行檢測，具體檢測結果見表2。 結果顯示，其中有3 組樣品檢測結果有所差異，采用數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測法未在羊肉、羊肉串、羔羊肉片中檢測出羊動物源性成分，而采用PCR 法檢測羊動物源性成分結果為陽性。

表2 數(shù)字微流控芯片平臺-快速檢測法及實時熒光PCR 法的檢測結果對比Table 2 Comparison of detection results by digital microfluidic chip platform-rapid detection method and real-time fluorescent PCR method

由表2 可知，數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測法經(jīng)與實時熒光PCR 法檢測結果對比，出現(xiàn)3 組結果偏差。 引起偏差的原因可能是數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測法與SN/T 2051—2008 檢測方法的檢出限有差異，快速篩查檢測法與實驗室確證檢測法相比不夠靈敏（見表3），具體原因有待進一步實驗分析。 從總的對比數(shù)據(jù)來看，數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測法的大部分檢測結果與實時熒光PCR 法吻合度較好，可用于樣品中動物源性成分的快速篩查檢測。

表3 不同檢測方法的檢出限Table 3 Detection limits of different detection methods

4 討論

目前，牛肉、羊肉和鴨血的摻假問題仍很嚴重，隨著人們對食品安全重視程度的提高， 確保動物源性成分真實屬性的摻假檢測越來越重要。 盡管已有多種各具特點的核酸分析新技術用于動物源性成分摻假檢測，但建立一種低成本、快速篩查檢測方法對市場摻假檢測監(jiān)管尤為重要。

數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測可同時對樣品的雞、鴨、鵝、豬、牛、羊6 項成分進行檢測，全程用時僅需45～60 min，具有成本低、自動化、便攜性好、快速靈活、多靶標檢測等優(yōu)點。

為了驗證數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測法的準確性和高效性，本文通過對市售牛肉、羊肉、鴨血（共計100 批次）樣品進行快速檢測，發(fā)現(xiàn)14 批次問題樣品， 采用國家標準方法GB/T 38164—2019和SN/T 2051—2008 對問題樣品進行確證檢測，通過對2 種檢測方法進行對比分析， 發(fā)現(xiàn)有3 組樣品檢測結果存在偏差。 引起偏差的原因可能是實驗室確證檢測法較快速篩查檢測法的檢出限更低。

實驗結果表明， 數(shù)字微流控芯片平臺快速篩查檢測法具有快速、高效、成本低且適用于現(xiàn)場操作等特點，既能夠實現(xiàn)大批量檢測，又能保證檢測結果的準確性， 可滿足市場上動物源性成分快速篩查檢測的需求。當然，數(shù)字微流控芯片平臺在實際應用中也存在一定的局限性，例如，檢出限指標尚未達到國家標準方法水平，上機檢測對環(huán)境要求較高，有待于進一步研究完善。

5 建議及措施

5.1 對監(jiān)管部門建議

（1）加強銷售經(jīng)營者監(jiān)管。建議市場監(jiān)管部門加強對食品經(jīng)營者的許可證明及合格證明的監(jiān)管，將動物源性成分摻假檢測納入監(jiān)督抽檢范圍。 對抽檢中發(fā)現(xiàn)的問題牛肉、羊肉及鴨血產(chǎn)品進行依法查處，逐級追溯，直至生產(chǎn)企業(yè)和源頭。

（2）加強生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)管。建議加強對問題企業(yè)的監(jiān)管力度，督促牛肉、羊肉及鴨血產(chǎn)品經(jīng)營者進行自查自糾，規(guī)范進貨渠道，主動索取并留存《動物檢疫合格證明》等證明文件和進貨憑證，同時建立食品安全追溯體系和誠信體系，嚴厲打擊欺詐失信行為，確保食品質(zhì)量安全。

5.2 對消費者購買和就餐建議

（1）建議消費者外出就餐時盡量選擇大型正規(guī)和口碑較好的餐館，不要一味追求價格低廉，避免食用假冒偽劣產(chǎn)品。

（2）消費者在購買牛肉、羊肉和鴨血等食材時，可先通過感官初步辨別真假。新鮮的羊肉呈較均勻的紅色，有光澤，肉質(zhì)堅而細，無異味；新鮮的牛肉呈暗紅色，肌肉纖維很均勻，有光澤，外表微干，同時富有彈性，指壓凹陷后立即恢復，具有牛肉特有的氣味；鴨血呈暗紅色，烹制后彈性較好，用水焯時不會掉色，煮熟后表面比較粗糙，且有少量不規(guī)則的氣孔。