宋玉瑩,任 睿,羅紅艷,李海舟*

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500;2. 云南雷允上理想藥業(yè)有限公司,云南 昆明 650000)

致病微生物入侵呼吸道并繁殖導(dǎo)致呼吸道感染的發(fā)生,主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽、咯痰等,且由于急性呼吸道感染病情進(jìn)展較快,若不及時(shí)進(jìn)行治療則容易導(dǎo)致肺炎的發(fā)生[1]。因此臨床一般采用抗炎退熱、止咳化痰、抗病毒、抗細(xì)菌、營(yíng)養(yǎng)支持等治療呼吸道感染[2]。雖然抗生素的應(yīng)用能有效治療細(xì)菌性呼吸道感染,但對(duì)于病毒性感染效果不佳。而中醫(yī)認(rèn)為本病因外邪入侵臟腑,邪氣上升,肺胃郁熱導(dǎo)致。表熱清顆粒作為一種中成藥,系云南省臨床應(yīng)用40余年之傣醫(yī)處方,用于治療感冒發(fā)熱、急性咽炎、急性支氣管炎、單純性肺炎、腮腺炎等病癥,該方在抗炎退熱方面,療效顯著。該方以傣醫(yī)藥特色藥材柘樹(shù)根(具有清火瀉毒退熱功效)為主,組方增加進(jìn)的柴胡,配合以金銀花、板藍(lán)根、石膏、甘草等中醫(yī)常用感冒風(fēng)熱證用藥,具解毒退熱、解表之功效,臨床用于瘟疫時(shí)毒、熱風(fēng)毒邪所致病毒性感染癥狀[3-6]。

Hopkins在2008年提出的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是運(yùn)用計(jì)算機(jī)等技術(shù)對(duì)多靶點(diǎn)藥物進(jìn)行多層次的網(wǎng)絡(luò)分析,其基于藥物-靶點(diǎn)-疾病之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,揭示藥物治療疾病的作用機(jī)制,是探索中藥生物活性物質(zhì)和整體分子機(jī)制的合適手段[7]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,研究表熱清顆粒治療呼吸道感染的的關(guān)鍵活性成分及其藥理作用機(jī)制。并通過(guò)分子對(duì)接方法進(jìn)行驗(yàn)證,增加結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材資料與方法

1.1 篩選表熱清顆粒的活性化合物及其潛在靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集表熱清顆粒中七味中藥的化學(xué)成分和潛在靶點(diǎn)。采用ADME(吸收、分布、代謝和排泄)模型對(duì)表熱清顆粒的化合物進(jìn)行篩選,為了篩選出具有良好口服吸收和使用效果的成分,選擇篩選口服生物利用度(OB)≥30%,類(lèi)藥物度(DL)≥0.18的化合物。同時(shí),將活性成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以獲取化合物結(jié)構(gòu)。對(duì)于每個(gè)活性成分,從上述數(shù)據(jù)庫(kù)和PubChem的文獻(xiàn)中收集其相應(yīng)的靶點(diǎn),還在“Homo Sapiens”條件下通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)篩選,并利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 呼吸道感染的潛在靶點(diǎn)的篩選

在Genecards(https://www.genecards.org/)中使用關(guān)鍵詞“呼吸道感染”來(lái)搜索與其相關(guān)的靶點(diǎn)。此外,表熱清顆粒-呼吸道感染共同靶點(diǎn)被R語(yǔ)言相交,并作為表熱清顆粒治療呼吸道感染的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

在string數(shù)據(jù)庫(kù)(http://stringdb.org)中,建立一個(gè)由表熱清顆粒作用靶點(diǎn)與呼吸道感染作用靶點(diǎn)重疊組成的PPI網(wǎng)絡(luò),生物體被設(shè)置為“Homo Sapiens”。然后,利用Cytoscape軟件中的CytoNCA選項(xiàng),根據(jù)度中心性(degree),中介中心性(Betweenness)和接近中心性(Closeness)對(duì)其網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行富集分析,得到關(guān)鍵靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,選取degree值較高的節(jié)點(diǎn)作為PPI網(wǎng)絡(luò)中假定的關(guān)鍵目標(biāo)。

1.4 基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(shū)(KEGG)路徑豐富分析

通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/)對(duì)作用靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO功能與KEGG路徑富集分析,以P<0.05為篩選條件,篩選結(jié)果用于進(jìn)一步分析涉及生物學(xué)過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分和功能信號(hào)通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)建設(shè)與分析

用Cytoscape軟件分析中藥-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),可以對(duì)中草藥中有效成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系有可靠的表示。根據(jù)該網(wǎng)絡(luò),可以來(lái)分析表熱清顆粒的關(guān)鍵活性成分。

用Cytoscape軟件分析PPI網(wǎng)絡(luò)。并將string數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape軟件中,繪制并分析表熱清顆粒-呼吸道感染共同作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)呼吸道感染治療的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選,根據(jù)degree值、Betweenness值以及Closeness值三個(gè)參數(shù)篩選后,得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

為了對(duì)藥物中有效成分,共同作用靶點(diǎn)和KEGG通路之間的關(guān)系有可靠的表示,用Cytoscape軟件對(duì)藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。根據(jù)該網(wǎng)絡(luò),可以利用三個(gè)參數(shù)來(lái)篩選出表熱清顆粒的關(guān)鍵活性成分和表熱清顆粒治療呼吸道感染的關(guān)鍵藥理機(jī)制。

1.6 分子對(duì)接

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù),得到關(guān)鍵活性成分,在ChemBio 3d進(jìn)行能量最小化,保存為SDF格式文件;并運(yùn)用Pymol軟件將化合物轉(zhuǎn)化為pdb文件格式。使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(pdb, http://www.rcsb.org/)收集核心目標(biāo)的晶體結(jié)構(gòu)。

使用AutoDock工具(http://mgltools.scripps.edu/)進(jìn)一步用于去除水和將氫原子添加到核心靶的晶體結(jié)構(gòu)中,并保存為PDPQT格式。利用AutoDock實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵活性成分與核心靶標(biāo)之間的分子對(duì)接。最后,選擇結(jié)合能絕對(duì)值最高的結(jié)合模式進(jìn)行深入分析。使用PYMOL軟件將分子對(duì)接結(jié)果可視化為3D圖。

2 結(jié)果

2.1 表熱清顆粒的活性化合物及其潛在靶點(diǎn)

從TCMSP和文獻(xiàn)中進(jìn)行搜索,匯總?cè)ブ?并且由于表熱清顆粒主要由口服給藥,故選擇ADME參數(shù)中的OB≥30%和DL≥0.18對(duì)成分進(jìn)行初篩。結(jié)合文獻(xiàn)參考,最后得到172個(gè)主要成分,其所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)量如下:柘樹(shù)根4個(gè)、金銀花29個(gè)、板藍(lán)根43個(gè)、石膏1個(gè)柴胡18個(gè)、黃芩38個(gè),甘草39個(gè)。對(duì)這些主要成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)277個(gè)的作用靶點(diǎn)。構(gòu)建藥材-化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步闡明表熱清顆粒有效成分與相應(yīng)靶點(diǎn)之間的相互作用,如圖1所示?；诰W(wǎng)絡(luò)分析,在七種中藥材中,對(duì)藥材-化合物-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的degree值、Betweenness值以及Closeness值進(jìn)行篩選,終得到18個(gè)潛在活性成分,如表1和圖2。

2.2 表熱清顆粒對(duì)呼吸道感染主要藥理靶點(diǎn)篩選

在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索了9977個(gè)與呼吸道感染相關(guān)的靶基因。為了獲得與呼吸道感染相關(guān)聯(lián)的表熱清顆粒的作用靶點(diǎn),對(duì)于表熱清顆粒與呼吸道感染的靶點(diǎn)使用R語(yǔ)言進(jìn)行相交,并在圖3中顯示韋恩圖信息。

圖3 表熱清顆粒靶點(diǎn)-呼吸道感染靶點(diǎn)圖

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

對(duì)248個(gè)共同靶點(diǎn)之間的相互作用進(jìn)行分析,將共同靶標(biāo)上傳到String數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的繪制,并用Cytoscape軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析,網(wǎng)絡(luò)如圖4所示。使用網(wǎng)絡(luò)分析儀計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù),以確定樞紐節(jié)點(diǎn)和關(guān)鍵目標(biāo)。在圖4中,使用節(jié)點(diǎn)的大小和顏色來(lái)描述目標(biāo)的拓?fù)鋮?shù)。度較大的節(jié)點(diǎn)用較大的尺寸描述,度較大的節(jié)點(diǎn)用較暗的顏色描述。根據(jù)degree,betweennes,closeness數(shù)值,篩選后,發(fā)現(xiàn)ESR1,PPARG,CTNNB1,IL1B,MYC,TP53,EGFR,AKT1,VEGFA,MMP9,IL6,PTEN,CASP3,HIF1A,TNF,EGF,PTGS2,CCND1,FOS被確定為PPI網(wǎng)絡(luò)重要靶點(diǎn)。

圖4 表熱清顆粒與呼吸道感染共有靶點(diǎn)的相互作用圖

2.4 GO和KEGG路徑富集物分析

將共同的靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)被用于分析GO和KEGG途徑富集,以探索表熱清顆粒治療呼吸道感染的作用機(jī)制。P≤0.05時(shí),GO和KEGG通路明顯豐富。生物過(guò)程(BP),細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)是基因本體功能分析的三個(gè)組成部分。使用R語(yǔ)言繪制生物過(guò)程(BP),細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)各前10個(gè)豐富的結(jié)果(圖5)與KEGG通路的前20個(gè)的結(jié)果(圖6)。

圖6 表熱清顆粒治療呼吸道感染的KEGG

2.5 化合物-目標(biāo)-路徑網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了進(jìn)一步探索活性成分,關(guān)鍵靶標(biāo)和關(guān)鍵通路之間的關(guān)系,用Cytoscape建立了一個(gè)化合物-靶點(diǎn)-途徑網(wǎng)絡(luò),對(duì)其進(jìn)行分析簡(jiǎn)化后得到化合物-靶點(diǎn)-途徑網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)。18個(gè)核心化合物分別為Wogonin,Quercetin,1-Methoxyphaseollidin,Glabridin,Licoagrocarpin,Vestitol,Shinpterocarpin,Formononetin,Naringenin,Acacetin,Luteolin,Moslosooflavone,Methyllinolenate,Kaempferol,Baicalein,Stigmasterol,Glyasperins M,Oroxylin a。另外靶標(biāo)是化合物和途徑之間的橋梁。故通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)和化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)來(lái)確定為核心靶標(biāo),這意味著它們?cè)赑PI網(wǎng)絡(luò)和化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中都起著至關(guān)重要的作用。最終確定ESR1,PPARG,CTNNB1,IL1B,MYC,TP53,EGFR,AKT1,VEGFA,MMP9,IL6,PTEN,CASP3,HIF1A,TNF,EGF,PTGS2,CCND1,FOS為核心靶點(diǎn)。

圖7 化合物-目標(biāo)-路徑網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接

在18個(gè)核心化合物和19個(gè)核心靶點(diǎn)之間進(jìn)行對(duì)接研究,以驗(yàn)證藥物-靶點(diǎn)相互作用的可靠性。這些靶點(diǎn)之所以被選為核心靶點(diǎn),是因?yàn)樗鼈冊(cè)贙EGG途徑中起著至關(guān)重要的作用,并且也是PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn),這意味著這些靶點(diǎn)可能是表熱清顆粒治療呼吸道感染的關(guān)鍵靶點(diǎn)。表2列舉了最好的前10個(gè)對(duì)接結(jié)果,如luteolin,baicalein和oroxylin a與MMP9結(jié)合,baicalein,wogonin與PPARG結(jié)合有較強(qiáng)的相互作用。圖8顯示了生物活性化合物與核心目標(biāo)在最低結(jié)合能下的對(duì)接模式,氫鍵由一條黃色的虛線(xiàn)表示。結(jié)果表明預(yù)測(cè)的靶標(biāo)蛋白與化合物有較強(qiáng)結(jié)合,可能是表熱清顆粒的作用靶點(diǎn)。此外,這些化合物也對(duì)新冠病毒直接感染宿主細(xì)胞相關(guān)的靶標(biāo)蛋白3CL蛋白水解酶和Rdrp(RNA依賴(lài)RNA聚合酶)進(jìn)行了分子對(duì)接,但未發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)結(jié)合物。

表2 分子對(duì)接結(jié)果

(a)MMP9-luteolin

3 討論

本研究采用計(jì)算機(jī)技術(shù),對(duì)表熱清顆粒治療呼吸道感染的作用機(jī)制和生物活性物質(zhì)進(jìn)行研究,以探索表熱清顆粒對(duì)呼吸道感染的治療作用。

本研究的藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析表明18個(gè)主要活性成分,包括Wogonin,Quercetin,1-Methoxyphaseollidin,Glabridin,Licoagrocarpin,Vestitol,Shinpterocarpin,Formononetin,Naringenin,Acacetin,Luteolin,Moslosooflavone,Methyllinolenate,Kaempferol,Baicalein,Stigmasterol,Glyasperins M,Oroxylin a,它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵作用,是表熱清顆粒起作用的關(guān)鍵化合物。其中l(wèi)uteolin可通過(guò)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(mito-genactivated protein kinase, p38 MAPK)干預(yù)MAPK通路,減輕中性粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[8];quercetin可抑制脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和NO,從而減少炎癥反應(yīng)[9-10];而quercitrin可通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能、降低過(guò)氧化作用來(lái)改善細(xì)胞活性[11];Kaempferol則能夠調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用,抑制炎癥反應(yīng)[12]。有研究證實(shí)據(jù)報(bào)道Baicalein具有改善腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展中的炎癥反應(yīng)的作用[13],它可以通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路來(lái)阻斷腎纖維化期間的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程,同時(shí)抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),以及抑制細(xì)胞因子釋放TNF-α、IL-1β 和 MCP-1,從而抑制炎癥過(guò)程,發(fā)揮治療作用[13-15]。Wogonin是一種重要的黃酮類(lèi)化合物,具有廣泛的生物活性,如抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤和抗病毒等[16]。Wogonin主要通過(guò)抑制iNOS和COX-2的誘導(dǎo),以及選擇性地抑制COX-2來(lái)減少NO和前列腺素E2的產(chǎn)生,發(fā)揮抗炎活性[17-19]。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示,表熱清顆粒的靶點(diǎn)涉及MMP9,PPARG,ESR1,CTNNB1,IL1B,MYC,TP53,EGFR,AKT1,VEGFA, IL6,PTEN,CASP3,HIF1A,TNF,EGF,PTGS2,CCND1,FOS等。進(jìn)一步的GO和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示表熱清顆粒發(fā)揮作用主要集中在炎癥、細(xì)胞凋亡、病毒感染等方面,作用于MAPK、PI3K-Akt、IL-17炎癥信號(hào)通路和Th17免疫細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)等多個(gè)信號(hào)通路。MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶9)屬于基質(zhì)金屬蛋白酶,能分解呼吸道和肺內(nèi)的結(jié)構(gòu)復(fù)合物如ECM和基底膜,若結(jié)合抑制后可緩解對(duì)呼吸道細(xì)胞外基質(zhì)的損傷[20]。PPAR-γ(結(jié)合過(guò)氧化物酶體增殖物)已被報(bào)道為先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞,從促炎介質(zhì)向抗炎介質(zhì)的轉(zhuǎn)化[21]。與MAPK1密切相關(guān)的MAPK信號(hào)通路在DNA損傷、氧化應(yīng)激及病毒感染中具有關(guān)鍵性作用,在炎癥中,TNF-α可誘導(dǎo)MAPK1磷酸化產(chǎn)生炎性趨化因子IL-8,介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化從而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)[22-23]。PI3K-Akt、IL-17等信號(hào)通路均參與了炎癥應(yīng)答、調(diào)控凋亡過(guò)程和氧化還原過(guò)程等生物過(guò)程。CASP3,TP53在影響RNA病毒的復(fù)制以及在治療肺炎的過(guò)程中有重要作用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),化合物-靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò),分子對(duì)接技術(shù)分析驗(yàn)證,探索表熱清顆粒治療呼吸道感染的多種活性成分和關(guān)鍵藥理作用機(jī)制。結(jié)果表明,表熱清顆粒治療呼吸道感染具有多組分、多靶點(diǎn)、多途徑、協(xié)同作用的特點(diǎn)。luteolin,baicalein和oroxylin a等為關(guān)鍵活性化合物,以PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和Apoptosis信號(hào)通路為關(guān)鍵分子機(jī)制,在抑制炎癥因子、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、改善氧化應(yīng)激狀態(tài)起重要作用。結(jié)合作用最強(qiáng)的MMP9靶標(biāo)若被抑制后可緩解對(duì)呼吸道細(xì)胞外基質(zhì)的損傷,并有潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。研究初步揭示了表熱清顆粒治療病毒性呼吸道感染的關(guān)鍵作用機(jī)制,證實(shí)對(duì)病毒性呼吸道感染所致炎癥和細(xì)胞以及黏膜損傷有緩解保護(hù)作用。

雖然本研究基于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道從化學(xué)成分、活性靶標(biāo)等方面,提出表熱清顆粒對(duì)呼吸道感染的關(guān)鍵活性化合物和潛在藥理機(jī)制,但在需要進(jìn)一步的體內(nèi)和體外藥理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。