金 悅 ,程義東 ,王安喜

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中醫(yī)院,江蘇 南京 210000)

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis,CP)是男性常見(jiàn)疾病之一,多表現(xiàn)為下腹及會(huì)陰部疼痛、排尿及性功能異常,發(fā)病率高,病程長(zhǎng),在一定程度上影響患者的生活與精神狀態(tài)。流行病學(xué)顯示,我國(guó)有8.4%的男性患有前列腺炎癥狀,其中CP是最常見(jiàn)的類(lèi)型[1]。除應(yīng)用α受體阻滯劑、5-α還原酶抑制劑外[2-3],祖國(guó)醫(yī)學(xué)也展現(xiàn)出了獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。癃清片作為臨床上治療CP的常用藥物,在改善患者的疼痛及異常癥狀上療效較好。癃清片是以澤瀉、車(chē)前子、敗醬草、金銀花、牡丹皮、白花蛇舌草、赤芍、仙鶴草、黃連、黃柏十味中藥構(gòu)成的復(fù)方,能夠清熱涼血、解毒通淋,適用于CP。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明癃清片不僅具有良好的局部及中樞鎮(zhèn)痛效果,還能抑制小鼠體內(nèi)的炎癥因子[4]。多項(xiàng)臨床應(yīng)用也表明癃清片能改善CP患者臨床癥狀,提高患者生活質(zhì)量,減輕患者精神壓力[5-6]。癃清片治療CP的具體機(jī)制尚未明確,本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接對(duì)癃清片治療CP的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),探討治療CP的作用機(jī)制,為未來(lái)相關(guān)研究及臨床應(yīng)用帶來(lái)新視野。

1 材料與方法

1.1 癃清片中藥物活性成分及作用靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[7],分別以癃清片中單味藥物為關(guān)鍵詞,以口服利用度(OB)≥30%及藥物相似性(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn),篩選出藥物的活性成分及與之對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn),剔除重復(fù)數(shù)據(jù)后整理得到癃清片的潛在靶點(diǎn)。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇“Reviewed”“Human”下載人類(lèi)基因官方靶點(diǎn)名稱。利用R軟件進(jìn)行匹配。

1.2 CP靶點(diǎn)的獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Chronic prostatitis”為關(guān)鍵詞,檢索相應(yīng)靶點(diǎn)。利用Perl腳本及R軟件,將獲取的癃清片藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)選取其中交集部分,得到Drug-Disease潛在靶點(diǎn)及官方基因名稱,繪制相應(yīng)Veen圖。

1.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STING數(shù)據(jù)庫(kù),Organisms選擇“Homo sapiens”,最低互動(dòng)得分設(shè)置為0.9,去除游離節(jié)點(diǎn),構(gòu)建相應(yīng)PPI網(wǎng)絡(luò)。將潛在靶點(diǎn)的相互作用通過(guò)Cytosacpe軟件下載CytoNCA進(jìn)行拓?fù)浞治黾翱梢暬治觥?/p>

1.4 構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將Drug-Disease文件導(dǎo)入Perl腳本,獲取相應(yīng)的作用關(guān)系,再通過(guò)Cytoscape軟件,構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)通路圖。

1.5 富集分析

運(yùn)用R對(duì)Drug-Disease進(jìn)行GO富集分析,選擇生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)前10項(xiàng)繪制柱狀圖,選擇KEGG前30條通路繪制柱狀圖,預(yù)測(cè)癃清片治療CP的潛在作用機(jī)制。

1.6 分子對(duì)接

選擇排名前10的核心靶點(diǎn)與相應(yīng)的化合物,使用ChemDraw及Chem3D軟件構(gòu)建3D結(jié)構(gòu),在PDB網(wǎng)站獲取每個(gè)靶點(diǎn)所對(duì)接靶蛋白及配體結(jié)構(gòu),通過(guò)AutoDock Tools、AutoDock Vina[8]進(jìn)行分子對(duì)接,PyMoL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 癃清片中藥物活性成分及作用靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中,對(duì)癃清片中中藥篩選后共得到化合物158種,其中澤瀉10種、車(chē)前子9種、敗醬草13種、金銀花23種、牡丹皮11種、白花蛇舌草7種、赤芍29種、仙鶴草5種、黃連14種、黃柏37種,剔除重復(fù)成分,篩選出有效活性成分共118種。利用R軟件與進(jìn)行人類(lèi)基因官方靶點(diǎn)名稱匹配,剔除重復(fù)值后得到藥物靶點(diǎn)218個(gè)。

2.2 CP靶點(diǎn)的獲取

檢索到疾病靶點(diǎn)9116個(gè),利用R得到藥物與疾病相交集的靶點(diǎn)204個(gè)(圖1)。

圖1 Drug-Disease靶點(diǎn)Veen圖

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

利用STING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。將STING數(shù)據(jù)庫(kù)生成的文件導(dǎo)入Cytosacpe,篩選出33個(gè)滿足條件的靶點(diǎn),進(jìn)行可視化分析(圖3)。前10位的核心靶點(diǎn)CTNNB1、ESR1、JUN、AKT1、CAV1、EGFR、IL6、NCOA1、RELA、AR,推測(cè)其是癃清片在治療CP過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 以BC和Degree的中位數(shù)2倍值篩選出的核心靶點(diǎn)

2.4 構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

利用Perl腳本及Drug-Disease靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系,通過(guò)Cytoscape構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)通路(圖4)。網(wǎng)格中共有233個(gè)節(jié)點(diǎn)及435條邊,涉及27種活性成分和204個(gè)靶點(diǎn)。

圖4 疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)通路圖

2.5 富集分析

進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路分析(圖5、圖6)。GO富集中包括2452個(gè)BP、84個(gè)CC、197個(gè)MF,其中BP與CP相關(guān)主要為對(duì)活性氧應(yīng)答、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的應(yīng)答、對(duì)氧含量的應(yīng)答、神經(jīng)元凋亡等。CC主要為膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜小窩、質(zhì)膜筏、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物等。MF主要為DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA特異性聚合酶ⅡDNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性等。KEGG富集中包含信號(hào)通路174條,與CP相關(guān)的主要有IL-17 信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、HIF-1 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等。

圖5 GO富集分析

圖7 分子對(duì)接可視化分析

2.6 分子對(duì)接

除去少量無(wú)合適配體的蛋白(CAV1、IL6、RELA)外,各化合物與蛋白對(duì)接的最低結(jié)合能均<-1.2kcal/mol(表1),說(shuō)明化合物與相應(yīng)蛋白能自發(fā)結(jié)合,最低結(jié)合能越小說(shuō)明結(jié)合作用越緊密。利用PyMol軟件進(jìn)行可視化分析(圖8),可見(jiàn)關(guān)鍵靶標(biāo)的氨基酸殘基與呈黃色虛線的氫鍵相互作用。

表1 分子對(duì)接結(jié)果

4 討論

CP在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里被稱為“精濁”,以盆腔、會(huì)陰、陰莖區(qū)及下腹部疼痛,排尿或射精時(shí)疼痛為主要臨床癥狀[9]。當(dāng)前臨床方案主要改善臨床癥狀及抗感染,長(zhǎng)時(shí)間、大劑量抗菌藥物應(yīng)用易對(duì)人體產(chǎn)生耐藥性及不良反應(yīng)。近年來(lái),癃清片作為安全且有效的治療藥物被廣泛應(yīng)用于CP的治療。

癃清片治療CP的主要活性成分為bolusanthol B、β-胡蘿卜素(beta-carotene)、槲皮素(quercetin)、高車(chē)前素(Dinatin)、Hypolaetin等。槲皮素具有抑制COX-2、巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用,可減少炎癥細(xì)胞ROS的釋放,抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[10]。bolusanthol B是來(lái)源于敗醬草的黃酮類(lèi)物質(zhì),王莉萍等通過(guò)提取白花敗醬總黃酮,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)其有明顯抗氧化作用[11-12]。Hypolaetin是車(chē)前子治療CP的最可能發(fā)揮主要作用的化合物之一[13]。高車(chē)前素藥理活性主要表現(xiàn)在抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等[14]。

在GO富集分析中,脂多糖可提高血清中炎癥因子的含量,導(dǎo)致炎癥的發(fā)生以及相應(yīng)部位的疼痛。國(guó)外研究表明,大量活性氧(ROS)可通過(guò)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)增強(qiáng)炎性基因表達(dá)[15]。氧化應(yīng)激也是一種重要的病理機(jī)制,甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。也有研究證實(shí)免疫功能的強(qiáng)弱與機(jī)體的抗氧化水平有關(guān),ROS含量過(guò)高會(huì)損傷自身免疫功能[16]。在KEGG通路方面,Th17是一種能夠分泌IL-17的CD4+T細(xì)胞,能夠招募及活化各種炎性細(xì)胞,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),與慢性炎癥的關(guān)系密切[17]。IL-17是重要的炎癥介質(zhì),不僅能刺激多種炎癥因子的產(chǎn)生,還可與其他細(xì)胞因子協(xié)同作用,進(jìn)而加劇炎癥效應(yīng)[18,19]。C型凝集素受體信號(hào)通路激活不僅可以誘導(dǎo)各種炎癥因子和趨化因子的表達(dá),還能促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子[20],MAPK信號(hào)通路能夠廣泛參與細(xì)胞的各項(xiàng)增殖、凋亡及應(yīng)激反應(yīng),增加炎癥因子的表達(dá)[21]。HIF-1α缺氧條件下可大量合成并誘導(dǎo)血管通透因子VEGF的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的活化以誘導(dǎo)炎癥[22]。分子對(duì)接結(jié)果顯示蛋白的表達(dá)與文獻(xiàn)中報(bào)道的趨勢(shì)基本一致,癃清片治療CP是由于多成分、多靶點(diǎn)、多通路之間的復(fù)雜作用。

癃清片主要通過(guò)調(diào)節(jié)多種核心靶點(diǎn),對(duì)活性氧應(yīng)答、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程及IL-17、MAPK、C型凝集素受體等信號(hào)通路治療CP。本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接為基礎(chǔ),通過(guò)大量數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)提升了對(duì)于疾病的認(rèn)識(shí),初步揭示了癃清片治療CP的作用機(jī)制,對(duì)今后疾病的診治提供了新的指導(dǎo),但也存在一定的局限性。首先,由于部分靶點(diǎn)蛋白未能匹配相應(yīng)配體,后續(xù)需針對(duì)相關(guān)成分及靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試;其次,癃清片進(jìn)入人體后吸收及代謝存在差異,囿于客觀條件及時(shí)間限制,未能結(jié)合試驗(yàn)完成進(jìn)一步驗(yàn)證;最后,本文選取癃清片的主要成分及靶點(diǎn),可能未涵蓋癃清片中10味中藥的全部有效活性成分,在今后的研究中仍可進(jìn)一步探討。