肖于凡 綜述,張志勇 審校

(重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院 風濕免疫科/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室/兒童感染免疫重慶市重慶重點實驗室,重慶400014)

重度先天性中性粒細胞減少癥(SCN)的致病基因有ELANE、 GFI1、HAX1、SBDS等,其中最常見的致病基因是ELANE突變,稱為SCN1型,遺傳方式為單基因常染色體顯性遺傳。骨髓細胞分化都在早期階段停止,不能產(chǎn)生正常功能或數(shù)量的成熟中性粒細胞,表現(xiàn)為中性粒細胞數(shù)量的絕對缺乏,根據(jù)中性粒細胞絕對計數(shù)(ANC)變化規(guī)律不同和臨床癥狀的差異,ELANE突變的表型為SCN和周期性中性粒細胞減少癥(CyN),目前報道的SCN患者遠多于CyN患者[1-3]。ELANE突變通過影響中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的結(jié)構(gòu)或功能,最終致中性粒細胞減少的具體機制尚不清楚,最常見的是未折疊蛋白反應(UPR)理論。無論SCN或CyN患者,都表現(xiàn)為早發(fā)、反復的呼吸道感染、皮膚黏膜感染,嚴重感染者可危及生命、惡性轉(zhuǎn)化為骨髓增生異常綜合征(MDS)或急性髓細胞白血病(AML)是預后不良的重要原因[2-3]。此病臨床的治療方式少且局限,盡早使用粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是目前改善臨床癥狀的一線選擇和終身治療方式[4],造血干細胞移植(HSCT)是目前唯一根治手段[2,5],基因編輯是未來根治的方向[5]。

1 發(fā)病機制

1.1ELANE基因突變 ELANE基因位于染色體19p13.3上,含有5個外顯子和6個內(nèi)含子。目前,ClinVar數(shù)據(jù)庫中有超過200個ELANE基因突變,包括錯義突變、無義突變、同義突變、移碼突變、內(nèi)含子剪切等多種形式,以錯義突變?yōu)橹鱗1,3,6-7],散發(fā)突變病例和家族遺傳病例在目前已有的報道中無明顯數(shù)量差異。突變位點不僅包括成熟酶的編碼區(qū),還包括酶原區(qū)和啟動子區(qū),突變部位傾向于酶活性位點附近(外顯子3、4、5和內(nèi)含子3、4)[5-6]。A57V、G97P、S126L、P139L、V190_F199del、W241X在文獻中既有SCN也有CyN病例報道[1,8-10],同一基因型有2種不同的臨床表型,目前尚不清楚具體機制。ELANE突變?nèi)鏥65del、N116D、C151Y、G185R、P205R、G214R、G214V,無論SCN還是CyN,都傾向表現(xiàn)出更嚴重的臨床癥狀,發(fā)展為MDS/AML或死亡的風險更高[3,6]。CyN病例中的雙位點突變傾向于表現(xiàn)出更嚴重的臨床癥狀,如A233P合并V235WfsX突變、G192A合并193_195del突變[11-12]。

研究發(fā)現(xiàn),少數(shù)SCN患者父母的外周血有ELANE基因突變,但未表現(xiàn)出相應的臨床癥狀,提示存在體細胞嵌合體或不完全外顯遺傳的可能性[13-14],或親代生殖系嵌合的可能[13]。反映了ELANE基因突變的遺傳不穩(wěn)定性,ELANE突變本身可能并不是完全導致中性粒細胞減少的原因,或許需要合并其他遺傳事件才能發(fā)生,需要進一步研究,并且在進行遺傳咨詢時引起重視。

1.2中性粒細胞彈性酶 中性粒細胞彈性蛋白酶是由ELANE基因編碼的267個氨基酸翻譯為N-、單個前二肽、C-前肽,經(jīng)過4次蛋白修飾為具有催化活性的酶(PDB:1HNEE,RefSeq 30-247),成熟的中性粒細胞彈性蛋白酶含有218個氨基酸,主要功能是水解蛋白質(zhì)底物和參與細胞外誘捕功能。有研究認為,ELANE突變是功能缺失型突變(LOF),翻譯修飾不完全導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)缺失,不能正確折疊、加工、分泌或降解[15]。也有研究認為,ELANE突變與NE結(jié)構(gòu)破壞無關(guān),而與NE功能障礙有關(guān)[16],但都不能完全解釋NE的結(jié)構(gòu)和功能障礙是如何導致中性粒細胞分化成熟停滯。目前,相關(guān)的假說較多,歸納為以下幾類:(1)ELANE基因無義突變會影響NE肽鏈的C-端,致NE不易被銜接蛋白3(AP-3)識別,進而錯誤定位影響早幼粒細胞發(fā)育[6,16]。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管控蛋白質(zhì)折疊,ELANE突變產(chǎn)生結(jié)構(gòu)或功能異常的NE,過多異常NE累積可促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,啟動未折疊蛋白反應(UPR)促進早幼粒細胞凋亡[17]。(3)有學者發(fā)現(xiàn),未發(fā)生UPR的情況下,NE錯誤折疊會產(chǎn)生早幼粒細胞核體(PML-NB),進而致活性氧(ROS)水平升高,ROS誘導突變NE降解[7,18]。(4)Wnt3a與CSF3R聯(lián)合刺激造血細胞中中性粒細胞的成熟,研究發(fā)現(xiàn)SCN患者中淋巴樣增強子結(jié)合因子1(LEF-1)顯著下降,LEF-1表達下降中斷WNT3a信號通路,影響NE成熟[16]。

2 臨床特征

2.1臨床特點 中性粒細胞組成人體抗感染的固有免疫系統(tǒng),嚴重中性粒細胞減少癥容易引起嚴重的反復細菌或真菌感染,其中金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌最常見[4,7,9,11,15]。ELANE突變相關(guān)的SCN患者起病年齡常在生后6個月以內(nèi),CyN患者常在1歲以內(nèi)。2020年法國嚴重慢性中性粒細胞減少癥登記處(FSCNR)研究表明SCN和CyN診斷年齡中位數(shù)分別為0.19、0.8歲(95例SCN,49例CyN)[2];2004年BELLANNE-CHANTELOT等[6]研究中SCN或CyN診斷年齡中位數(shù)分別為2.8、16月齡(54例SCN,27例CyN)。

SCN患者常以臍炎、口炎或肺炎起病[4],CyN多數(shù)以口炎為首發(fā)臨床癥狀[18]。SCN患者大多遭受終身反復感染,CyN比SCN發(fā)病率低,表現(xiàn)為周期性的中性粒細胞數(shù)量減少,周期為14～36 d(多數(shù)21 d左右),持續(xù)約3～7 d,臨床癥狀也呈周期性變化[3,8,19]。兩者均以呼吸系統(tǒng)、皮膚黏膜為最常見的感染部位,2015年MAKARYAN 等[3]研究報道,307例ELANE突變相關(guān)中性粒細胞減少的患者中,常見的感染分別為口腔潰瘍(80%)、肺炎(49%)、膿腫(19%)、敗血癥(17%)、蜂窩織炎(12%)和腹膜炎(3%)[3]。CyN患者呼吸系統(tǒng)的感染多數(shù)集中在口咽部,周期性出現(xiàn)口腔潰瘍是最主要的癥狀,SCN患者口咽部感染更多表現(xiàn)為牙周炎,包含牙齦炎、牙齒松動、牙齦紅腫、牙齦出血、牙槽骨吸收等,慢性損傷可能導致早期齒齦壞死、牙齒脫落[8,20]。SCN出現(xiàn)下呼吸道感染的頻率比CyN更高,肺部感染起病早、易反復,部分患者出現(xiàn)氣管、支氣管發(fā)育不良或肺纖維化[1,13]。MAKARYAN等[3]研究報道,97例SCN患者63%發(fā)生了肺炎,相比之下26例CyN發(fā)生肺炎的比率僅有19%。嚴重感染時可出現(xiàn)呼吸衰竭,需要吸氧甚至氣管插管維持氧飽和度[2,19,21]。兩者皮膚黏膜感染常表現(xiàn)為無或少膿液的膿腫,SCN常見的感染部位是肛周和臍部[15],嚴重時需要外科手術(shù)治療[7,21]。除此之外,中耳炎、乳突炎、淋巴結(jié)炎、骨量下降、貧血也常有報道[7-8,15,22]。2021年有1例SCN患者感染新型冠狀病毒的相關(guān)報道,患者為20月齡的男嬰,因肺炎入院,病程中因銅綠假單胞菌感染出現(xiàn)典型的腮腺潰瘍、肛周膿腫,中性粒細胞數(shù)量在新型冠狀病毒感染后進一步下降,呼吸道癥狀整體不重,可解釋為中性粒細胞胞外陷阱(NETs)的形成減少[21]。

CyN患者的臨床癥狀相比SCN普遍更輕,少數(shù)患者直到其子代確診后才被發(fā)現(xiàn),部分患者隨著年齡增長臨床癥狀明顯改善,僅表現(xiàn)為口炎、不再出現(xiàn)感染癥狀或不出現(xiàn)任何癥狀[23]。少部分CyN患者表現(xiàn)出嚴重的臨床癥狀,呼吸衰竭需要氣管插管支持,或出現(xiàn)膿毒血癥、顱內(nèi)感染、急性壞死性筋膜炎[13,19],僅2016年報道了1例CyN惡性轉(zhuǎn)化為急性白血病的病例,A233P合并V235WfsX雙位點突變的女性患者,4周時首次出現(xiàn)銅綠假單胞菌膿毒血癥,17歲時發(fā)展為急性髓細胞白血病,需接受造血干細胞移植治療[11]。

普遍認為ELANE突變導致的SCN比CyN患者的臨床癥狀更嚴重,部分患者惡性轉(zhuǎn)化為MDS、AML或更罕見的急性淋巴細胞白血病(ALL),尤其G-CSF普遍應用后,雖延長了SCN患者的生存時間,但SCN惡性轉(zhuǎn)化率也隨之增加。2006年國際嚴重慢性粒細胞減少癥登記(SCNIR)確認了高劑量G-CSF暴露與白血病轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系[24],同年相繼提出了SCN惡性轉(zhuǎn)化的累積發(fā)生率超過25%[6,24]。2010年ROSENBERG等[25]研究表明,使用G-CSF 15年后,MDS/AML死亡的累積發(fā)生率為22%,因膿毒血癥死亡的累積發(fā)生率為10%;2020年FSCNR研究提示MDS/AML的10年累積發(fā)生率為4.4%,20年累積發(fā)生率為5.5%[2]。除了惡性轉(zhuǎn)化外,膿毒血癥、呼吸衰竭、顱內(nèi)感染或移植失敗都會導致SCN死亡[2,13-15,21,23,25]。

2.2輔助檢查 血常規(guī)是首次發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測中性粒細胞減少癥的重要檢查,重癥中性粒細胞減少癥患者長期維持中性粒細胞計數(shù)降低,至少3次出現(xiàn)中性粒細胞水平低于0.5×109L-1有助于診斷[15]。CyN患者中性粒細胞數(shù)量呈周期性減少,潛在患者建議3～4個月血常規(guī)連續(xù)監(jiān)測,每周至少3次,連續(xù)計數(shù)超過2個周期[11],少部分CyN患者成年后中性粒細胞數(shù)量周期性改變會消失[23]。

骨髓細胞學檢查是協(xié)助診斷的重要檢查,無論是SCN還是CyN,骨髓涂片中成熟中性粒細胞均罕見,粒細胞左移,停滯在早幼粒細胞/中幼粒細胞階段,髓樣細胞數(shù)量顯著減少,成髓細胞和早幼粒細胞水平低,單核細胞和嗜酸性粒細胞水平較高[13,15,21-22],定期的骨髓細胞學檢查也有利于早期發(fā)現(xiàn)患者是否惡化為骨髓增生綜合征或急性白血病。

基因檢測是診斷的“金標準”,對患者及潛在攜帶者的ELANE基因組DNA和cDNA序列進行分析,測序包括啟動子區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子-外顯子邊界,有助于臨床癥狀及預后的預測[3,15]。

鑒于ELANE突變與MDS/AML的相關(guān)性,建議每年進行血常規(guī)監(jiān)測和骨髓細胞學檢查,尤其出現(xiàn)不典型癥狀或體征時,臨床醫(yī)生更應進行積極的檢查。

3 治 療

3.1感染管理 預防和控制感染對患者生存質(zhì)量至關(guān)重要。盡管G-CSF治療可以改善中性粒細胞計數(shù),但仍存在感染的風險,尤其是口腔感染,定期監(jiān)測血常規(guī)和口腔科隨訪,保持個人口腔衛(wèi)生、定期牙齒檢查,有助于改善患者預后[7,15,20]。目前少見報道SCN或CyN患者使用滅活或減毒活疫苗免疫后出現(xiàn)不良反應。

3.2粒細胞集落刺激因子 粒細胞集落刺激因子作為一線治療方法,通過代償機制糾正中性粒細胞水平及降低發(fā)生膿毒血癥的風險,提高患者的生存率和改善生活質(zhì)量。2006年P(guān)HILIP等[24]研究的374例SCN患者在G-CSF使用后SCN患者膿毒血癥死亡率下降到每年0.9%。

幾乎所有ELANE突變相關(guān)的中性粒細胞減少癥患者對G-CSF治療有反應,但每例患者使用劑量差異非常大,2004年BELLANNE-CHANTELOT 等[6]研究表明,SCN使用G-CSF劑量的中位數(shù)高于CyN。2020年FSCNR隨訪研究表示,112例ELANE突變患者使用G-CSF治療的患者平均劑量為9.8 μg/(kg·d)[2]。普遍推薦(包括ISCNR)治療的初始劑量為5 μg/(kg·d)[15,24],根據(jù)患者臨床癥狀增減劑量,中性粒細胞絕對計數(shù)超過1.0×109～1.5×109L-1為治療目標,且<25 μg/(kg·d)的G-CSF用量可明顯改善大多數(shù)患者的臨床癥狀[14]。G-CSF難治性患者需要大劑量G-CSF治療來控制頻繁和嚴重的感染,最大用量可高達300 μg/(kg·d)[22]。

隨著生存時間的延長,SCN患者惡性轉(zhuǎn)化風險成為日益關(guān)注的問題。有研究指出長期使用G-CSF治療的患者發(fā)生MDS/AML的風險較高[15,24-25]。2015年MAKARYAN等[3]研究報道的307例患者中,SCN或CyN使用G-CSF 20年后發(fā)生MDS/AML、移植或死亡的累計發(fā)生率分別為46%、7%。80%發(fā)展為AML的SCN患者被發(fā)現(xiàn)有集落刺激因子3受體(CSF3R)的獲得性體細胞突變,且大劑量G-CSF治療(>8 μg/(kg·d))或累積劑量超過10 000 μg/kg的患者會增加惡性轉(zhuǎn)化的風險[3,11,26]。

3.3造血干細胞移植 造血干細胞移植仍是目前唯一根治方法,移植供體來源多為無關(guān)供者,其中臍帶血和骨髓干細胞較為常用。目前,關(guān)于移植指針總結(jié)為以下幾點:(1)G-CSF治療效果差:①<1歲開始使用G-CSF[1];②中性粒細胞數(shù)量無法上升至0.5×109/L或仍繼續(xù)下降[24],G-CSF使用后,仍有反復或嚴重感染[1,7];③大劑量G-CSF(>8 μg/(kg·d))治療后粒細胞無升高的難治性SCN[2,6,25];(2)隨訪過程中發(fā)現(xiàn)CSF3R基因突變[2];(3)嚴重膿毒血癥或惡性轉(zhuǎn)化MDS/AML/ALL[1-2,7]。

從理論上來講,移植后最理想的情況是完全嵌合體,因此預處理方案十分重要,優(yōu)先選擇清髓的預處理方案,比如白消安(Bu)、環(huán)磷酰胺(Cy)、抗人胸腺細胞免疫球蛋白(ATG)組成的Bu-Cy-ATG(MAC)預處理方案[2,4]和氟達拉濱(Fu)、白消安(Bu)、抗人胸腺細胞免疫球蛋白(ATG)組成的Fu-Bu-ATG(MAC)預處理方案[4]。56%的SCN患者移植后中性粒細胞計數(shù)穩(wěn)定,不再出現(xiàn)反復感染,無需G-CSF治療。目前,預防GvHD常用的藥物有環(huán)孢霉素(CSA)、霉酚酸酯(MMF)、甲氨蝶呤(MTX)、氟達拉濱(Fu)、他克莫司(Fk)、強的松(Pred)等藥物[2]。FSCNR提出ELANE相關(guān)的中性粒細胞減少癥患者的HSCT預后良好,移植后5年生存率為87.5%,移植生存率為95.0%,長期生存率為90.0%[2],目前GvHD是患者移植后預后差和死亡的主要原因[1-2]。

3.4其他 目前,治療方式少且局限性多,因此一些基于CRISPR/Cas9 ELANE基因編輯[5]、NE抑制或增強G-CSF功能的新治療方法可能在未來應用于臨床。2021年EKATERINA等[9]研究提出煙酰胺與G-CSF協(xié)同治療可改善療效,2017年MAKARYAN等[27]提到一些內(nèi)源性重組或合成的NE抑制劑已進入臨床前階段,如K562、MEG-01、MK0339等藥物,抑制中性粒細胞彈性蛋白酶可能是未來的一種治療選擇,2020年有研究提到CRISPR/Cas9 介導的ELANE基因熱源性校正編輯或突變的等位基因敲除治療在ELANE突變患兒中的潛在應用,開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas9-AAV6的基因修復方法[26]。2022年MAKARYAN又將NE抑制劑和基因編輯兩種治療方法通過人早幼粒細胞HL60進行實驗比較,2種方法對SCN和CyN的療效都有巨大潛力,但NE抑制劑作為口服藥物似乎是更好的治療方式[28]。

4 小 結(jié)

ELANE突變導致的中性粒細胞減少癥有SCN和CyN 2種表現(xiàn)型,常染色體顯性遺傳,是罕見的原發(fā)性免疫缺陷病,突變位點多,以雜合錯義突變?yōu)橹鳌Ｄ壳?發(fā)病機制研究不清,臨床特征為起病早、感染反復、部位多,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌感染最常見,呼吸系統(tǒng)、皮膚黏膜為最常見的感染部位,SCN比CyN的臨床表現(xiàn)更加嚴重,部分患者惡性轉(zhuǎn)化為骨髓增生異常綜合征或急性白血病,甚至死亡。血常規(guī)、骨髓涂片有利于早期發(fā)現(xiàn),基因分析不僅是診斷的“金標準”,還有助于預測臨床表現(xiàn),如V65del、N116D、C151Y、G185R、P205R、G214R、G214V突變、A233P合并V235WfsX、G192A合并193_195del都傾向于表現(xiàn)出更嚴重的癥狀,因此同一基因型表現(xiàn)為不同表型、基因型與臨床癥狀的關(guān)系亟待研究。預防感染有助于患者的長期管理,G-CSF藥物治療有助于改善臨床癥狀,HSCT是目前應用于根治此病的唯一治療手段。NE抑制劑作為G-CSF的替代治療藥物仍處于非常早期的階段,基因編輯也是未來治療的研究方向。