李敏婕 劉淑紅 陳洪云 余海青

1.山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科，山東臨沂 276000；2.山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院內(nèi)五科，山東臨沂 276000

肺癌是世界范圍內(nèi)第二常見和死亡率最高的惡性腫瘤，2020 年全球新發(fā)和死亡病例達(dá)220.7、179.6萬例，我國肺癌新發(fā)和死亡病例達(dá)81.6、71.5 萬例，居全球首位[1]。臨床超過80%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），晚期NSCLC 患者5 年生存率不足5%[2-3]。研究顯示，微RNA（microRNA，miRNA）參與NSCLC 發(fā)生和進(jìn)展[4-5]。有研究報道，miR-374b-5p在黑色素瘤和乳腺癌等惡性腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[6-7]。研究表明，血管生成與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF 家族的新成員，在血管生成中發(fā)揮重要作用[9]。研究報道，VEGF-C 參與膀胱癌、卵巢癌等惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[10-11]?；诖耍狙芯刻接懷錷iR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)與NSCLC 患者病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。

圖1 miR-374b-5p 與VEGF-C 結(jié)合位點(diǎn)圖

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年2 月至2019 年9 月山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的105 例接受手術(shù)切除的NSCLC 患者為NSCLC 組，其中男60 例，女45例；年齡41～82 歲，平均（59.27±8.32）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC；②初診且未接受過抗腫瘤治療；③TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期；④接受根治手術(shù)；⑤年齡≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②合并血液、免疫系統(tǒng)損害；③院內(nèi)死亡或不能接受隨訪。另選取我院同期54 名體檢健康者為對照組，其中男31 例，女23 例；年齡24～77 歲，平均（58.15±7.17）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究受試者或家屬知情并簽署知情同意書，并經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（2018 倫字011）。

1.2 研究方法

采集NSCLC 組入院次日和對照組體檢時靜脈血3 ml，離心后取上層血清，取部分血清通過Trizol 法提取血清總RNA，微量分光光度計(jì)驗(yàn)證純度、濃度合格后使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，編號：11111ES）合成cDNA。參考SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒（廣州威佳科技有限公司，編號：RR902Q）說明書進(jìn)行擴(kuò)增，miR-374b-5p：正向引物5’-TCAAGGAGAAGAGACTATATTTGC-3’，反向引物5’-ACTCCAAACTCCTTCCCCACAT-3’；內(nèi)參U6：正向引物5’-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’，反向引物5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3’；引物設(shè)計(jì)和合成由上海新貝生物科技有限公司完成。95℃90 s，95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循環(huán)40 次反應(yīng)結(jié)束后，2-ΔΔCT法計(jì)算血清miR-374b-5p 相對表達(dá)量。剩余部分血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（上海瓦蘭生物科技有限公司，編號：E01585）檢測VEGF-C水平。

1.3 分組方法

患者出院后通過門診或電話隨訪3 年（截至2022 年9 月）。根據(jù)NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)平均值分為miR-374b-5p 高、低表達(dá)組和VEGF-C 高、低表達(dá)組，統(tǒng)計(jì)不同組別患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 28.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；血清miR-374b-5p 與VEGF-C 的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)系數(shù)；miR-374b-5p 與VEGF-C 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測采TargetScan 數(shù)據(jù)庫https：//www.targetscan.org/；K-M 法繪制不同miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)NSCLC 患者生存曲線；NSCLC 死亡的影響因素采用Cox 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)比較

NSCLC 組血清miR-374b-5p 表達(dá)低于對照組，VEGF-C 表達(dá)高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)比較（）

表1 兩組血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)比較（）

注miR-374b-5p：微RNA-374b-5p；VEGF-C：血管內(nèi)皮生長因子C；NSCLC：非小細(xì)胞肺癌。

2.2 miR-374b-5p 與VEGF-C 結(jié)合位點(diǎn)

miR-3746-5p 與VEGF-C 結(jié)合下點(diǎn)預(yù)測采TargetScan 數(shù)據(jù)庫https：//www.targetscan.org/miR-374b-5p與VEGF-C 的3’-非翻譯區(qū)381-388 和585-591 處存在結(jié)合位點(diǎn)。見圖1。

2.3 NSCLC 患者血清miR-374b-5p 與VEGF-C 表達(dá)的相關(guān)性

NSCLC 患者血清miR-374b-5p 與VEGF-C 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.735，P＜0.001）。

2.4 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系

不同分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系（）

表2 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系（）

注NSCLC：非小細(xì)胞肺癌；miR-374b-5p：微RNA-374b-5p；VEGF-C：血管內(nèi)皮生長因子C。

2.5 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)與生存時間的關(guān)系

105 例NSCLC 患者隨訪3～36 個月，失訪5 例，死亡44 例，中位生存時間為29.4 個月。miR-374b-5p高表達(dá)組（≥1.09，55 例）中位生存時間為31.9 個月，低表達(dá)組（＜1.09，50 例）中位生存時間為26.5 個月；VEGF-C 高表達(dá)組（≥651.21pg/ml，52 例）中位生存時間為32.1 個月，VEGF-C 低表達(dá)組（＜651.21 pg/ml，53 例）中位生存時間為26.6 個月。不同miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)NSCLC 患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.402、8.108，P=0.007、0.004）。見圖2。

圖2 不同血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)NSCLC 患者K-M 生存曲線

2.6 NSCLC 死亡的單因素和多因素Cox 回歸分析

以性別（男=1；女=0）、年齡（≥60 歲=1；＜60 歲=0）、吸煙（是=1；否=0）、病理類型（腺癌=1；鱗癌=0）、腫瘤大?。ā? cm=1；＜5 cm=0）、分化程度（低分化=1；中高分化=0）、TNM 分期（Ⅲ期=1；Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=1；無=0）、miR-346-5p（連續(xù)變量）、VEGF-C（連續(xù)變量）為自變量，隨訪時間為時間變量，生存狀態(tài)（死亡=1；存活=0）為因變量進(jìn)行Cox 回歸分析。結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、VEGF-C 升高為NSCLC 死亡的獨(dú)立危險因素（HR=3.195、4.212、1.102，P＜0.05），miR-374b-5p 升高為獨(dú)立保護(hù)因素（HR=0.988，P＜0.05）。見表3。

表3 NSCLC 死亡的單因素和多因素Cox 回歸分析結(jié)果

3 討論

NSCLC 是起源于支氣管至終末肺泡所有上皮細(xì)胞惡性腫瘤的統(tǒng)稱，截至目前手術(shù)切除仍然是早中期NSCLC 最有效的治療方法[12]。盡管近年來腫瘤分子生物學(xué)的進(jìn)展推動實(shí)現(xiàn)了靶向和免疫療法，但僅部分NSCLC 患者獲得臨床效益，且隨著治療時間的延長獲得性耐藥越來越多，預(yù)后也越來越差[13-14]。NSCLC的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過程，表觀遺傳學(xué)在NSCLC 中扮演重要角色[15]。miRNA 是表觀遺傳學(xué)的新的研究熱點(diǎn)，能通過與mRNA 的3’-非翻譯區(qū)互補(bǔ)或配對引發(fā)mRNA 降解或轉(zhuǎn)錄后沉默，進(jìn)而調(diào)控NSCLC 發(fā)生發(fā)展[16-17]。miR-374b-5p 定位于人X 染色體長臂13.2 處，能通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞分化參與免疫炎癥反應(yīng)過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-374b-5p 參與腫瘤過程，如miR-374b-5p 能靶向高遷移率族蛋白B1/Wnt3a/β-連環(huán)蛋白通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和抑制凋亡[18]；同時能靶向基質(zhì)金屬蛋白酶14，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲[19]。miR-374b-5p 在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑制作用。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 患者血清miR-374b-5p低表達(dá)，并與分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示miR-374b-5p 在NSCLC 患者血清中低表達(dá)可能與其啟動子被甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默有關(guān)。而隨著miR-374b-5p 表達(dá)下調(diào)，可上調(diào)富含絲氨酸/精氨酸剪接因子7，能識別前體RNA 剪切元件招募組裝剪接體，促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和抑制凋亡[20-21]。

腫瘤細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖會消耗大量的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，高耗氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏不利于腫瘤細(xì)胞生長，為此腫瘤需要通過形成新的血管以獲取更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)[22]。腫瘤新生血管的生長和成熟是血管生成促進(jìn)因子和抑制因子復(fù)雜的協(xié)調(diào)過程，VEGF-C是血管生成因子VEGF 家族新發(fā)現(xiàn)的一個成員，能通過結(jié)合VEGF 受體2、VEGF 受體3 刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增生，促進(jìn)新生血管生成[23]。研究報道，VEGF-C 能通過促進(jìn)腫瘤新生血管生成促進(jìn)結(jié)直腸癌、肺腺癌等惡性腫瘤的進(jìn)展[24-25]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 患者血清VEGF-C 高表達(dá)，并與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示VEGF-C 在NSCLC 患者血清中高表達(dá)可能與其啟動子被癌基因激活有關(guān)，而隨著VEGF-C 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤新生血管生成，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC 惡性進(jìn)展[26]。本研究通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-374b-5p 與VEGF-C 存在結(jié)合位點(diǎn)；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清miR-374b-5p 與VEGF-C表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示二者可能共同參與NSCLC 發(fā)生發(fā)展。趙麗霞等[27]研究報道，上調(diào)miR-374b-5p 能靶向下調(diào)VEGF-C 表達(dá)，抑制NSCLC 細(xì)胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，血清miR-374b-5p 高表達(dá)和VEGF-C 低表達(dá)的NSCLC 患者中位生存時間長，且二者均為NSCLC 患者死亡的獨(dú)立影響因子。提示血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達(dá)與NSCLC 患者預(yù)后有關(guān)，有望成為NSCLC 患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。

綜上所述，NSCLC 患者血清miR-3 74b-5p 和VEGF-C 與病理參數(shù)和預(yù)后相關(guān)，二者可能共同參與NSCLC 進(jìn)展。但本研究還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究證實(shí)，并進(jìn)一步研究miR-374b-5p、VEGF-C 參與NSCLC的機(jī)制。