阿木提江·馬合木提 鄭堅(jiān)江 迪里夏提·阿力木

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胰腺外科，新疆烏魯木齊 830001

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）相關(guān)死亡率居中國癌癥相關(guān)死亡率的第六位[1]，盡管手術(shù)、化療和放療等方法取得了巨大進(jìn)步，但其5 年生存率仍較差[2-3]。微RNA（microRNA，miRNA）是短鏈非編碼RNA 分子，其通過與靶基因結(jié)合的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4-5]。最近，許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在腫瘤中表達(dá)異常[6-8]，其中miR-142-5p 在疾病中存在表達(dá)失調(diào)[9-13]。E2F 轉(zhuǎn)錄因子家族在細(xì)胞周期和腫瘤進(jìn)程中起作用[14-15]，研究發(fā)現(xiàn)E2F7在許多類型的腫瘤中上調(diào)[16]，但其在不同癌癥中所起的作用存在爭議。因此，本研究探討miR-142-5p與E2F7 基因的關(guān)系及其影響PC 增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為PC 的生物標(biāo)志物篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選擇2016 年12 月至2019 年1 月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）接受手術(shù)治療的35 例PC 患者，患者術(shù)前未接受任何化療、放療或免疫治療，其癌及癌旁組織切除后在液氮中保存?；颊呔炇饛V泛性知情同意書，本研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批[2016 年（12）01 號(hào)]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人PC 細(xì)胞系（CFPAC-1、SW1990、Capan-1、PANC-1）和正常胰管上皮細(xì)胞系（HPDE）購自北納生物有限公司。細(xì)胞放置在5%CO2和37℃的培養(yǎng)箱中，在含有10%胎牛血清（美國Gibco，10099）的RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Gibco，A1049101）中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測mRNA 相對(duì)表達(dá)量

使用SYBR Green PCR 試劑盒（日本TaKaRa，RR 407A）分析miR-142-5p 及E2F7 mRNA 的表達(dá)。U6和GAPDH 分別為miR-142-5p 和E2F7 mRNA 的內(nèi)參基因。miR-142-5p 引物正向序列為5’-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3’，反向序列為5’-UAGUGCUUUCUACUUUAUGUU-3’；U6 引物正向序列為5’-CTCGCTTCGGCAGAC-3’，反向序列為5’-AACGCTTACGAATTT-3’；E2F7 mRNA 引物正向序列為5’-CAAGCTAGTAGTCCTTGGTTCAG-3’，反向序列為 5’-GGAATCTTCTATCGTTGGGTCAT-3’；GAPDH引物正向序列為5’-AACAGCAACTCCCACTC -TTC-3’，反向序列為5’-CCTGTTGCTGTAGCCGTATT-3’。循環(huán)條件：95℃變性10 min，隨后95℃10 s、55℃10 s 和72℃30 s 40 個(gè)循環(huán)。PCR 反應(yīng)體系為SYBR染色劑（2×）10 μl，正向引物（10 μmol/L）0.5 μl，反向引物（10 μmol/L）0.5 μl，cDNA 1.0 μl；ddH2O 9.0 μl。采用2-△△Ct法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白的相對(duì)表達(dá)量

蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)印后用5%脫脂牛奶的磷酸鹽緩沖液封閉后用anti-E2F7（廣州西格生物科技有限公司，XG-K9691），anti-GAPDH（美國Abcam，ab8245），濃度為1 μg/ml，孵育過夜后加入辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗（Santa Cruz Company）（1∶5 000）。通過化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Millipore Company，mc175968）檢測條帶灰度值。

1.6 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測

采用Starbase 數(shù)據(jù)庫（https://starbase.sysu.edu.cn/）對(duì)miR-142-5p 和E2FE 基因的靶向位點(diǎn)和結(jié)合序列進(jìn)行預(yù)測。合成miR-142-5p 預(yù)測靶位點(diǎn)內(nèi)的E2F7 基因野生型（wild type，wt）或突變體（mutant，mut），并克隆到pGL3 控制載體（美國Promega Madison，WI）。將1×105個(gè)細(xì)胞接種到24 孔板中，待融合度達(dá)到80%后再轉(zhuǎn)染。通過Lipofectamine2000 試劑（美國Life Technologies）將E2F7 的wt 或mut 的3’非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）共轉(zhuǎn)染到miR-142-5p minmics 組、NC 組中，通過雙螢光素酶（美國Promega，E1960）報(bào)告系統(tǒng)評(píng)估螢光素酶活性。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

通過CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，C0037）來確定細(xì)胞活力，按照制造商的操作說明檢測各細(xì)胞增殖情況。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測

收集各組細(xì)胞后用5 μl 膜聯(lián)蛋白V 和5 μl 碘化丙啶稀釋的100 μl 緩沖液，應(yīng)用凋亡檢測試劑盒（南京建成科技有限公司，G003-1-2）染色20 min 后，通過流式細(xì)胞儀（美國FACScan，F(xiàn)A-4570）檢測凋亡率。

1.9 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell 上室涂有基質(zhì)膠。將2×105個(gè)細(xì)胞與不含血清的培養(yǎng)基一起加入上室，下室含有DMEM 和20%胎牛血清（美國Gibco，10099）。然后將細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。隨后，使用棉簽去除上室中的細(xì)胞，下室固定并用DAPI 染色5 min?；陲@微鏡捕獲的數(shù)字圖像，使用Image J 軟件計(jì)算侵入膜的細(xì)胞數(shù)量。

1.10 劃痕實(shí)驗(yàn)

將各處理組細(xì)胞接種到6 孔培養(yǎng)皿中，在適當(dāng)條件下培養(yǎng)48 h。用消毒的移液管尖端在細(xì)胞單層上產(chǎn)生傷口，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞并在含有10%FBS 的DMEM 中孵育48 h。在倒置顯微鏡下分別在0、24 h 觀察劃痕愈合情況，并通過從相應(yīng)的原始劃痕寬度中減去愈合后劃痕寬度來測量。

1.11 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

20 只雄性BALB/c 裸鼠（4～6 周齡）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，用于建立裸鼠異種移植模型采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為NC 裸鼠組、si-E2F7裸鼠組、E2F7 裸鼠組及miR-142-5p mimics+E2F7 裸鼠組，每組5 只。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有裸鼠都被置于無病原體的環(huán)境中，將5×106個(gè)不同處理組細(xì)胞與100 μl 的人工基膜混合后皮下注射于裸鼠前腿下方的皮膚。所有裸鼠于注射后第30 天處死，腫瘤體積每5 天用卡尺測量，腫瘤體積=長（mm）×寬（mm）×寬（mm）/2。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-142-5p 在PC 中的表達(dá)

PC 患者癌組織中miR-142-5p 表達(dá)低于癌旁組織，CFPAC-1、SW1990、Capan-1、PANC-1 細(xì)胞中miR-142-5p 表達(dá)低于HPDE 細(xì)胞（P＜0.05）。見圖1。

圖1 miR-142-5p 在PC 中的表達(dá)

2.2 E2F7 基因在PC 中的表達(dá)及與miR-142-5p的關(guān)系

PC 患者癌組織中E2F7 mRNA 表達(dá)高于癌旁組織，Capan-1、PANC-1 細(xì)胞中E2F7 mRNA 及其蛋白表達(dá)高于HPDE 細(xì)胞（P＜0.05）。Starbase 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，miR-142-5p 與E2F7 基因的3’UTR 存在互補(bǔ)。雙螢光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染E2F7-wt后，miR-142-5p mimics 組螢光素酶活性低于NC 組（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染E2F7-mut 后，miR-142-5p mimics組螢光素酶活性與NC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 E2F7 基因在PC 中的表達(dá)及與miR-142-5p 的關(guān)系

2.3 miR-142-5p 調(diào)控E2F7 基因?qū)apan-1 細(xì)胞功能的影響

E2F7 組E2F7 mRNA 及其蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力、劃痕愈合面積、相對(duì)侵襲細(xì)胞數(shù)高于NC 組，細(xì)胞凋亡率低于NC 組（P＜0.05）。miR-142-5p mimics+E2F7 組mRNA 及其蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力、劃痕愈合面積、相對(duì)侵襲細(xì)胞數(shù)低于E2F7 組，細(xì)胞凋亡率高于E2F7 組（P＜0.05）。見圖3。

2.4 miR-142-5p 調(diào)控E2F7 基因?qū)δ[瘤生長的影響

E2F7 裸鼠組腫瘤體積、重量高于NC 裸鼠組，miR-142-5p mimics+E2F7 裸鼠組腫瘤體積、重量低于E2F7 裸鼠組（P＜0.05）。蘇木精-伊紅染色顯示，E2F7 裸鼠組腫瘤具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，而miR-142-5p mimics+E2F7 裸鼠組腫瘤的轉(zhuǎn)移能力較差。見圖4。

圖4 miR-142-5p 調(diào)控E2F7 基因?qū)δ[瘤生長的影響（n=5）

3 討論

miRNA 調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展中的細(xì)胞增殖、凋亡、分化、侵襲和遷移，其通過調(diào)控不同靶基因發(fā)揮作用[17-18]。另有數(shù)據(jù)顯示，miR-142-5p 過表達(dá)會(huì)抑制PC 生長[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-5p 在PC 中低表達(dá)，miR-142-5p能夠抑制E2F7 基因過表達(dá)的PC 細(xì)胞增殖且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能原因?yàn)閙iRNA 通過降解mRNA 或抑制其翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[20-25]。本研究結(jié)果顯示，E2F7基因是miR-142-5p 的靶基因之一，并且在PC 中高表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-142-5p 模擬物的細(xì)胞活力受到抑制，而E2F7 基因過表達(dá)PC 細(xì)胞的活力增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，E2F7 組細(xì)胞凋亡率低于NC 組，miR-142-5p mimics+E2F7 組細(xì)胞凋亡率高于E2F7組，同時(shí)E2F7 組細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，而miR-142-5p mimics+E2F7 組細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到抑制。

綜上，本研究結(jié)果提示miR-142-5p 通過調(diào)控E2F7 基因表達(dá)抑制PC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可為預(yù)測PC 的預(yù)后和治療靶點(diǎn)提供新的生物標(biāo)志物。