耿 梅,趙艷利,蔣紅霞,侯慶明*

(1.山東勝利生物工程有限公司,山東濟(jì)寧 272000;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,國家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens, Cp)是一種革蘭氏陽性厭氧菌,又名為魏氏梭菌,能夠產(chǎn)生孢子,廣泛存在于土壤、污水、沉積物以及人和動(dòng)物的消化道中,可以在環(huán)境中水平傳播[1]。產(chǎn)氣莢膜梭菌作為雞腸道中的常在菌,一般不發(fā)病,但在外界誘因下如患球蟲病,飼養(yǎng)衛(wèi)生條件不良,飼料營養(yǎng)缺乏等造成雞群機(jī)體抵抗力降低時(shí),誘發(fā)壞死性腸炎(Necrotic Enteritis,NE)。目前該病已廣泛分布于世界各地,呈全球流行態(tài)勢(shì),嚴(yán)重危害各國養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。Cp所分泌的外毒素已經(jīng)達(dá)到 20 余種,基于其產(chǎn)生的外毒素 α、β、ε 和 ι的差異,將Cp分成A、B、C、D和E型[2],目前國內(nèi)流行的感染禽類的產(chǎn)氣莢膜梭菌主要是A型[3]。隨著限抗禁抗政策的落地,一些對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌高敏的藥物被禁止使用。海南霉素是一種聚醚類抗球蟲藥,是我國具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的原創(chuàng)性藥物,用于防治雞球蟲病藥物且效果較好[4-5]。鹽霉素是第一種被中國引進(jìn)的離子載體類藥,前期被廣泛應(yīng)用。恩拉霉素對(duì)革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的活性,特別是對(duì)腸內(nèi)的有害產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium)抑制力很強(qiáng),但目前已被禁用。三丁酸甘油酯在幼齡動(dòng)物上使用,有減少幼齡動(dòng)物斷奶后的腹瀉,減少斷奶應(yīng)激,增加成活率和日增重的作用。在目前限抗、禁抗的養(yǎng)殖環(huán)境下可選擇藥物較少,且一些藥物易產(chǎn)生耐藥性,使得NE的問題愈發(fā)嚴(yán)重,給養(yǎng)殖帶來了巨大的困難[6]。本研究選擇了幾種不同的藥物對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果作了比較,以期為養(yǎng)殖中選擇有效的抗生素控制產(chǎn)氣莢膜梭菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及試驗(yàn)菌株 2019年從廣東省某大型養(yǎng)雞場(chǎng)采集209份雞腸道樣本。參考菌株A型產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13124,質(zhì)控菌株脆弱擬桿菌ATCC25285和艱難梭菌ATCC700057均保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理教研室。

1.2 主要試劑和儀器 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FT)、胰月示-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基(TSC)、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯(BHI)、水解酪蛋白培養(yǎng)基(MH)、布氏瓊脂培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;海南霉素、恩拉霉素、鹽霉素由山東勝利生物工程有限公司提供,丁酸甘油酯購自湖北浩華生物技術(shù)有限公司;PCR Mix、DNA Marker和瓊脂糖購自廣州擎科生物技術(shù)有限公司;微生物質(zhì)譜鑒定儀MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)購自島津公司。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定 將采集的雞腸道樣品置于3 mL FT培養(yǎng)基,厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)20 h。將增菌液劃線接種于TSC平板,厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)24～36 h。挑單菌落劃線接種于含有卵黃的TSC培養(yǎng)基中,置于厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)24～36 h。挑單菌落劃線接種于無菌含脫纖維綿羊血的哥倫比亞平板上,于厭氧袋中37 ℃培養(yǎng)24 ～36 h。挑單菌落進(jìn)行增菌,采用MALDI-TOF-MS對(duì)疑似菌株進(jìn)行菌種鑒定。將鑒定的菌株在 BHI 營養(yǎng)瓊脂平板上涂布,置于厭氧袋37 ℃培養(yǎng)36 h后,將菌苔刮取下來置于30%甘油BHI肉湯中,渦旋混勻后-80 ℃保存。

1.4 菌株分型 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)合成四種基因的引物,采用多重PCR方法對(duì)菌株進(jìn)行分型[7]。反應(yīng)體系為25 μL,DNA模板2 μL、PCR Mix 12.5 μL、上下游引物(cpa、cpb、etx、iap)各0.125 μL、ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s共 30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min(表1)。

表1 分型引物序列Tab 1 Typing primer sequence

1.5 藥敏試驗(yàn)

1.5.1 藥物稀釋液的制備 按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn),依據(jù)公式:質(zhì)量×效價(jià)=體積×濃度,計(jì)算所需抗菌藥物的量,配置成5120 μg/mL藥物稀釋液。海南霉素、鹽霉素用甲醇溶解,恩拉霉素用鹽酸溶解,丁酸甘油酯用DMSO溶解,藥物現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.2 瓊脂稀釋法 挑選單菌落接種于3 mL營養(yǎng)肉湯中,厭氧培養(yǎng)12～18 h后用生理鹽水調(diào)整菌液濃度為107CFU/mL。將制備好的菌液接種于強(qiáng)化布氏瓊脂平板,每點(diǎn)接種的菌量約為104CFU,質(zhì)控菌株為脆弱擬桿菌ATCC25285和艱難梭菌ATCC700057。每種菌株分別加入兩個(gè)未加藥物的平板作為生長(zhǎng)對(duì)照,一個(gè)置于有氧環(huán)境檢測(cè)有無需氧菌污染,一個(gè)置于厭氧環(huán)境作為厭氧生長(zhǎng)質(zhì)控的起點(diǎn)。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,判讀結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定 如圖1所示,挑取TSC平板中的黑色單菌落,劃線接種于含有卵黃的TSC培養(yǎng)基中。再選取在卵黃TSC板中呈黑色并有2～4 mm寬的白色沉淀環(huán)的單菌落,劃線接種于含無菌脫纖維綿羊血的哥倫比亞平板,選取在血平板上形成雙溶血環(huán)的單菌落菌株,采用MALDI-TOF-MS對(duì)疑似菌株進(jìn)行菌種鑒定。共鑒定出61株產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離率為29.2%。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(a. TSC卵黃囊瓊脂培養(yǎng)基,b.血液瓊脂培養(yǎng)基)Fig 1 Colony morphology of Clostridium perfringens on selective medium; a. TSC yolk sac agar medium, b. Blood agar medium.

2.2 分離菌株的分型 多重PCR方法對(duì)61株分離菌株分型結(jié)果顯示(圖2),所有菌株僅擴(kuò)增到324 bp左右的cpa片段,因此判定所分離的雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖2 部分產(chǎn)氣莢膜梭菌多重PCR分型結(jié)果(泳道M為DL2000;“-”為陰性對(duì)照;1～22為分離株;“+”為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC13124)Fig 2 Partial mμLtiplex PCR typing resμLts of Clostridium perfringens

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 隨機(jī)選擇50株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行海南霉素MIC值測(cè)定,10株進(jìn)行恩拉霉素、鹽霉素和丁酸甘油酯MIC值測(cè)定。結(jié)果顯示菌株對(duì)海南霉素敏感性差異不大,總MIC值范圍為0.004～0.06 μg/mL之間,MIC50為0.008 μg/mL,MIC90為0.015 μg/mL(圖3)。10株菌株對(duì)恩拉霉素和鹽霉素均敏感,總MIC值范圍分別為0.004～0.06 μg/mL和0.008～0.06 μg/mL之間,對(duì)三丁酸甘油酯均不敏感,總MIC值范圍為64～>512 μg/mL之間。

圖3 產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)4種藥物的MIC分布圖Fig 3 MIC distribution map of Clostridium perfringens for four drugs

3 討論與結(jié)論

產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道穩(wěn)態(tài)遭到破壞時(shí)則會(huì)誘發(fā)NE的產(chǎn)生,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。據(jù)報(bào)道,NE 每年可造成全球養(yǎng)雞生產(chǎn) 20 億的經(jīng)濟(jì)損失[8]。Chalmers 等對(duì)加拿大的兩個(gè)肉雞場(chǎng)進(jìn)行雞源產(chǎn)氣莢膜梭菌分離,分離率分別為 24.72%、23.28%[9]。馬壯等報(bào)道2016 年產(chǎn)氣莢膜梭菌在廣州超市的冷鮮雞肉中的污染率為 68.68%且均為A型[10],由產(chǎn)氣莢膜梭菌A型引起的食物中毒是目前美國第二常見的食源性疾病[11],我國對(duì)因該病引起的食物中毒也屢有報(bào)道[12-13]。產(chǎn)期莢膜梭菌作為一種常見的食源性人獸共患病原微生物,可通過動(dòng)物性食品傳播給人類,不僅危害養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展且對(duì)人類的健康有潛在的威脅,應(yīng)當(dāng)引起我們的重視[14]。

本研究中對(duì)廣東省某大型養(yǎng)雞場(chǎng)共采集了209份雞腸道樣本,分離鑒定出61株產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離率為29.2%,對(duì)菌株進(jìn)行分析結(jié)果均為A型。陳祥杰等對(duì)珠三角地區(qū)的產(chǎn)氣莢膜梭菌的流行情況進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示陽性檢出率為35%,且都為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌[15]。陸宗浩等對(duì)澳門地區(qū)供應(yīng)的禽類食品進(jìn)行產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究發(fā)現(xiàn),所分離到的均為A型且檢出率為37.5%[16]。產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離受養(yǎng)殖環(huán)境、抗生素的使用、采樣地區(qū)等因素影響,本研究中的分離率與分型結(jié)果與國內(nèi)其他研究大致相符。

據(jù)研究報(bào)道,球蟲感染后改變了雞腸道的PH,延長(zhǎng)了有毒物質(zhì)排除體外的時(shí)間從而有利于產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道的增殖[17]。有試驗(yàn)表明球蟲病可能使禽類易患NE,當(dāng)球蟲和梭狀芽孢桿菌混合感染時(shí)比球蟲單獨(dú)感染的癥狀更嚴(yán)重[18-19]。海南霉素主要用于防治雞球蟲病,為調(diào)查其對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用,隨機(jī)選取50個(gè)分離株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示,海南霉素的MIC值范圍為0.004～0.06 μg/mL之間,MIC50為0.008 μg/mL。為了與其他藥物進(jìn)行簡(jiǎn)單的比較,隨機(jī)選取了10株進(jìn)行恩拉霉素、鹽霉素和丁酸甘油酯的抑菌效果的研究。結(jié)果表明,海南霉素與對(duì)梭狀芽孢桿菌有強(qiáng)抑制性的恩拉霉素的抑菌效果相當(dāng),MIC值范圍為0.004～0.06 μg/mL,其次為鹽霉素,MIC值范圍為0.008～0.06 μg/mL。

產(chǎn)氣莢膜梭菌 (Clostridium Perfringens) 是一種革蘭氏陽性的專性厭氧桿菌[20],而海南霉素作為一種新型的離子載體抗生素,能夠較好的抑制革蘭氏陽性菌[21],因此,表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗梭菌效果。丁酸甘油酯有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育、提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用,有研究報(bào)道在飼糧中添加丁酸甘油酯可對(duì)感染大腸桿菌的雞群有一定的保護(hù)作用[22]。本研究通過瓊脂法MIC對(duì)丁酸甘油酯的抑菌效果進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明丁酸甘油酯的抑菌效果不明顯。

本試驗(yàn)從209份雞腸道樣本共分離鑒定出61株產(chǎn)氣莢膜梭菌,分離率為29.2%,且均為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌。海南霉素不僅可以防治球蟲,對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌也有良好的抑菌效果且與恩拉霉素相當(dāng),其次為鹽霉素,丁酸甘油酯的抑菌效果不明顯。