陳順德，沈 浮，鐘小龍，彭 芮，崔立生

（永州市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 永州 425000）

腰椎間盤突出癥（lumbar disc herniation，LDH）是指椎間盤纖維環(huán)破裂，椎間盤內(nèi)核狀物向脊髓管或神經(jīng)孔突出，壓迫或刺激椎間孔出口的神經(jīng)根或脊髓，引起臨床癥狀為腰痛、下肢疼痛、感覺異常、肌力減退、膝反射異常的退行性病變，嚴重影響患者的日常生活和工作能力[1-3]。目前主流觀點認為，LDH的發(fā)病與椎間盤組織退變、慢性過度使用、不良姿勢、勞動強度過大等因素有關(guān)。我國每年LDH的發(fā)病率為5.40%～15.21%，占腰腿痛疾病的62.36%以上[4]。此外，慢性炎癥、細胞因子和化學因子也被認為在LDH的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[5-6]。雖然病理學上存在一些共性，但LDH的發(fā)病機制仍不十分清楚。近期研究表明，免疫細胞浸潤在LDH的發(fā)病和進展中扮演了關(guān)鍵角色[7-8]。在這個過程中，多種免疫細胞，如T細胞、B細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等會聚集在椎間盤周圍，釋放出一系列細胞因子和趨化因子，導致局部炎癥反應和神經(jīng)病理學改變。這些免疫細胞及其釋放物與疼痛的誘發(fā)和加重密切相關(guān)[9-11]。目前對LDH免疫細胞浸潤的研究尚處于初步階段，但已取得一些重要的進展和發(fā)現(xiàn)。研究提示中醫(yī)藥治療LDH療效顯著，并可改善機體的免疫紊亂[12-13]。

生物信息學作為一種新興的交叉學科，對于研究疾病的分子機制具有重要意義?；蛐酒夹g(shù)是生物信息學中應用廣泛的技術(shù)之一，可以高效地獲取大規(guī)模的基因表達數(shù)據(jù)[14-15]。本研究利用生物信息學工具，對LDH患者和正常人在基因芯片數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中的差異基因數(shù)據(jù)進行了綜合分析，并運用CIBERSORT算法對LDH相關(guān)的免疫浸潤進行了研究。CIBERSORT算法是一種可靠的機器學習方法，可基于線性支持向量回歸算法進行細胞組成分析。其反卷積方法可通過使用線性回歸模型來解決混合細胞組成問題[15]。該算法基于公開可用的參考基因表達數(shù)據(jù)，并利用貝葉斯概率理論和線性回歸模型計算出各細胞類型的相對比例，進而估計未知樣本中各種細胞類型的組成比例。同時該算法可用于識別人類免疫細胞表型，廣泛應用于評估不同免疫細胞的相對含量和動態(tài)調(diào)節(jié)過程[16-17]。本研究旨在探討LDH的分子機制及其與免疫浸潤的相關(guān)性，并對與LDH免疫相關(guān)的中藥進行預測及篩選，從而為LDH的診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件工具 本研究使用了多個數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)分析軟件工具。其中，GEO基因表達數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）和STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）分別用于獲取基因表達和蛋白相互作用網(wǎng)絡信息，Coremine Medical數(shù)據(jù)庫（http://www.coremine.com/）則用于獲取與研究主題相關(guān)的文獻信息。數(shù)據(jù)分析軟件工具方面，本研究使用了Cytoscape-3.7.0（CentiScape插件）進行網(wǎng)絡可視化分析，同時利用R語言4.2.3程序中的bioconductor、limmar、clusterProfiler、pheatmap等數(shù)據(jù)包進行數(shù)據(jù)處理、差異分析和結(jié)果展示。

1.2 LDH差異表達基因獲取 從GEO數(shù)據(jù)庫中使用GEO的在線搜索工具檢索LDH患者的基因芯片數(shù)據(jù)，使用R語言中的“l(fā)imma”軟件包對基因探針進行t檢驗，并根據(jù)篩選條件進行差異基因分析。篩選條件為|log2FC|≥1和校正P＜0.05，即僅選擇在表達水平上有顯著變化的基因。負數(shù)代表下調(diào)，正數(shù)代表上調(diào)?；蛐酒瑪?shù)據(jù)中通常使用探針表示不同的基因。本研究使用GPL570平臺將探針轉(zhuǎn)換成基因名稱，獲得LDH差異表達基因的列表。

1.3 核心基因及功能注釋 差異基因通過STRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白互作網(wǎng)絡模型（protein protein interaction network，PPI network），然后將結(jié)果導入Cytoscape軟件，并利用CentiScape插件計算每個靶基因的DC（度）值。通過平均度值的2倍進行核心靶基因的篩選，并進行可視化。此外，使用R語言中的“clusterProfiler”插件包，進行差異基因的基因通路富集分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）。

1.4 獲取免疫浸潤矩陣及主成分分析 本研究基于R語言程序并鏈接CIBERSORT反卷積法對LDH的差異基因與22種免疫細胞（包括T細胞、原始和記憶B細胞、靜止和活化NK細胞等）建立一個線性回歸模型來計算其相對比例。對于每個未知樣本，CIBERSORT算法將其基因表達數(shù)據(jù)映射到參考基因表達數(shù)據(jù)的特征基因上，并利用已構(gòu)建的線性回歸模型計算出其細胞組成比例。由于存在測量誤差和噪聲，算法會進行1 000次反卷積計算，對P＜0.05的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析[17]。使用R語言進行LDH差異基因的主成分分析（principal component analysis，PCA），讀取CIBERSORT計算得到的免疫細胞含量數(shù)據(jù)，然后通過PCA對樣品進行降維，將高維度的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為二維平面坐標系上的點。接著，利用ggplot2包繪制PCA圖，將兩組樣品的點用不同顏色表示，并使用橢圓形表示每個樣品組的免疫細胞含量的方差，以及使用文字標記樣品組的平均值。

1.5 免疫細胞間相關(guān)性分析及組間差異分析 為了探究不同免疫細胞之間的相關(guān)性，本研究在CIBERSORT反演方法中篩選P＜0.05的可靠樣本數(shù)據(jù)，并計算不同免疫細胞間的Pearson相關(guān)系數(shù)。此外，還使用秩和檢驗來比較LDH患者與健康人群之間的差異。

1.6 LDH免疫浸潤過程中潛在中藥的篩選預測 將LDH差異核心靶基因及GO富集的與免疫浸潤相關(guān)生物學過程導入Coremine Medical數(shù)據(jù)庫中，篩選具有潛在效應機制的中藥，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LDH差異表達基因獲取結(jié)果 通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫，對LDH相關(guān)的基因探針進行篩選，最終本研究將GSE150408芯片數(shù)據(jù)作為本次的研究對象。GSE150408是來自NCBI的一個公共基因表達譜數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)集包括了來自25名LDH患者（LDH組）和25名正常人（正常組）的外周血樣本。經(jīng)篩選后獲得LDH組與正常組的差異基因588個，其中上調(diào)基因為210個，下調(diào)基因為378個。圖1A為差異基因的分布情況，圖1B熱圖展示前20個上調(diào)及下調(diào)基因的情況，紅色、黑色、綠色節(jié)點分別代表基因的上調(diào)、無差異、下調(diào)。

圖1 LDH 相關(guān)基因探針差異表達的熱圖及火山圖

2.2 核心靶基因獲取 在PPI模型中，節(jié)點顏色越深代表該節(jié)點的度值越大，重要程度越高。篩選出15個核心基因，它們的度值大于2倍平均度值。這些核心基因為INS、PLP1、KIF1A、SH3GL2、NRCAM、MPO、DUSP26、FCGR1A、GNAI1、IGFBP3、PTPRU、CD86、GPM6B、TCF7L2、AREG。（見圖2）

圖2 LDH 差異基因的PPI 網(wǎng)絡圖及核心靶基因

2.3 LDH差異基因的KEGG富集分析結(jié)果 運用R語言程序中的“clusterProfiler”插件包對LDH差異基因進行通路富集分析，結(jié)果顯示差異基因主要涉及Th17細胞分化、T細胞受體信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、NOD樣受體信號通路、成骨細胞分化、Toll樣受體信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、JAK-STAT信號通路、NF-κB信號通路、VEGF等通路。（見圖3）

圖3 LDH 差異基因的KEGG 富集分析

2.4 LDH免疫浸潤的PCA主成分分析 在PCA圖中，不同分組（正常組與LDH組）的樣本聚集在不同的區(qū)域內(nèi)，表明樣本之間存在顯著的差異，表明這些主成分與樣本的差異有關(guān)，結(jié)果較為可信。（見圖4）

圖4 LDH 免疫浸潤的PCA 主成分分析

2.5 免疫細胞間相關(guān)性分析 由圖5可知，γδ T細胞（T cells gamma delta，γδ T cells）與濾泡輔助性T細胞（T cells follicular helper，Tfh）呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.97），活化的CD4+T記憶細胞（T cells CD4 memory activated）與調(diào)節(jié)性T細胞（T cells regulatory，Tregs）呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.61），中性粒細胞（neutrophils）與單核細胞（monocytes）呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.68），CD8+T細胞（T cells CD8）與活化NK細胞（NK cells activated）呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.59）。

圖5 LDH 組中免疫細胞間的相關(guān)性分析

2.6 LDH組與正常組的免疫浸潤差異分析 LDH組與正常組在多種免疫細胞中表現(xiàn)出明顯差異（P＜0.05），包括漿細胞（plasma cells）、CD8+T細胞、活化的CD4+T記憶細胞、濾泡輔助性T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、γδ T細胞、激活的自然殺傷細胞、M1型巨噬細胞（macrophages M1）、激活的肥大細胞（Mast cells activated）和中性粒細胞。（見圖6）

2.7 免疫浸潤相關(guān)生物途徑的中藥預測 通過Coremine Medical預測具有潛在治療作用的中藥，以P＜0.05作為篩選標準，預測LDH核心差異靶基因及相關(guān)免疫反應生物學過程相關(guān)的中藥。該網(wǎng)絡中三七、人參、生地黃、枸杞子的度值較高，提示與LDH相關(guān)免疫浸潤的關(guān)系最密切。（見圖7）將導出的中藥進行性、味、歸經(jīng)及功效分析，可知多為辛溫、甘平之藥，歸經(jīng)多為肝經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)，功效多與補氣養(yǎng)血、益肝腎、補骨髓及活血化瘀相關(guān)。（見圖8）

圖7 LDH 免疫浸潤相關(guān)的中藥預測網(wǎng)絡圖

圖8 LDH 免疫浸潤相關(guān)的中藥特征分析

3 討論

本研究使用基因芯片分析，對LDH患者和正常人群進行差異基因篩選，通過PPI分析，確定了與LDH相關(guān)的15個核心靶基因。其中PLP1、CD86、NRCAM、FCGR1A、MPO、KIF1A等基因與LDH的髓核炎癥反應和椎間盤免疫反應有關(guān)。研究顯示，PLP1的表達水平與炎癥反應相關(guān)的細胞因子產(chǎn)生和免疫細胞活化有關(guān)[18]。PLP1基因敲除小鼠的脊髓具有更高的NF-κB激活水平，而這是一個重要的炎癥信號通路，表明PLP1可能對炎癥反應起著調(diào)節(jié)作用[19]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，PLP1缺陷會導致小鼠脊髓中B細胞數(shù)量的增加，并且這些B細胞具有增強抗原遞呈的功能，可加速脊髓炎癥的進展[20-21]。這些結(jié)果表明PLP1在腰椎髓核炎癥反應和免疫反應中可能具有重要作用。CD86是一種重要的共刺激分子，在免疫反應中發(fā)揮重要作用。研究表明，在腰椎髓核炎癥反應患者中，CD86的表達水平明顯升高，并且其與炎癥反應和疼痛程度密切相關(guān)[8]。NRCAM基因編碼神經(jīng)細胞黏附分子，可以通過調(diào)節(jié)T細胞的產(chǎn)生和炎癥介質(zhì)的釋放來影響免疫反應[22]。FCGR1A在退化的椎間盤中的巨噬細胞中高度表達，并能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞的活化和炎癥反應，從而參與椎間盤退變的進程[23]。MPO在免疫細胞的活化和炎癥反應中亦發(fā)揮著重要的作用。研究表明，在椎間盤退變組織中MPO的表達水平明顯升高[24]。MPO能夠參與調(diào)節(jié)免疫細胞的活化和炎癥反應，如增強TNF-α和IL-1β等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并參與氧化應激反應，導致氧化應激損傷和細胞凋亡等，進而促進椎間盤退變的發(fā)生[25]。總之，本研究篩選出的大部分核心靶基因與免疫反應和疼痛傳遞等方面有關(guān)，且與目前LDH相關(guān)的實驗研究相符合，進一步說明本研究預測結(jié)果的可靠性，提示其可能成為未來診斷LDH的潛在靶標及生物標志物。

本研究利用GEO基因芯片對LDH患者與正常人群進行差異基因的KEGG富集分析，提示Th17細胞分化通路、T細胞受體信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路可能與免疫反應密切相關(guān)。其中NF-κB通常被激活以調(diào)節(jié)炎癥反應和免疫細胞的增殖和分化[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在退變的椎間盤中NF-κB的活性明顯增強。一些炎癥介質(zhì)（如IL-1β和TNF-α）被發(fā)現(xiàn)可以誘導NF-κB的激活，并促進椎間盤細胞的炎癥反應[27]。近年來的研究表明，T細胞受體信號通路在椎間盤免疫反應中也扮演了重要角色，T細胞可以在椎間盤組織中識別并應對抗原，并通過TCR信號通路激活免疫反應[7]。椎間盤組織中存在大量的CD4+和CD8+T細胞。它們表達的TCR可以與椎間盤組織中的膠原蛋白等抗原結(jié)合，并誘導免疫反應[28]。而TNF信號通路介導的多種炎癥反應，在椎間盤的免疫反應中扮演著重要的角色。TNF可通過激活NF-κB信號通路，促進IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，同時還可以誘導MMP的表達，從而引發(fā)椎間盤的炎癥反應和破壞[29]。TNF還可以誘導炎癥細胞的浸潤和椎間盤細胞凋亡，加劇疾病的發(fā)展[30]。而在椎間盤組織中檢測到大量的IL-17和IL-22，可以誘導椎間盤細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子，并且IL-17和IL-22還可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，從而進一步加重椎間盤的退變[31]。因此，抑制Th17細胞分化和減少IL-17和IL-22等炎癥細胞因子的產(chǎn)生，可能成為治療椎間盤退變的重要策略之一。

為了進一步探討免疫細胞在LDH中的作用，本研究利用CIBERSORT反卷積法對兩組外周血樣本進行篩選，得出多種免疫細胞存在差異，其中部分結(jié)果已經(jīng)得到驗證。近些年來巨噬細胞浸潤在椎間盤的退變中的作用成為了研究熱點。本研究得出巨噬細胞M1在椎間盤退變中明顯增加，M1巨噬細胞可以從單核細胞中分化出來。其產(chǎn)生的IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子和產(chǎn)物，可導致椎間盤的退化和疼痛，且M1型巨噬細胞的存在與椎間盤炎癥反應和神經(jīng)根疼痛的發(fā)生密切相關(guān)[32]。而在LDH中明顯增加的還有肥大細胞。肥大細胞釋放的組織蛋白酶、白三烯、肥大細胞介素-4等介質(zhì)會誘導炎癥反應，促進退變。此外，肥大細胞還可以誘導神經(jīng)病理變化，如痛覺過敏和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。這些機制也可能參與了椎間盤退變過程中神經(jīng)病理變化[33]。而Treg細胞在LDH明顯減少，該結(jié)果與近期的基礎研究亦相符合，Treg主要功能是調(diào)節(jié)和控制免疫反應，椎間盤疾病患者的Treg數(shù)量和功能比正常人降低，這可能導致免疫系統(tǒng)的失控和疾病的發(fā)生和發(fā)展。此外，Treg還可以通過抑制其他免疫細胞的活動來減輕椎間盤炎癥反應，從而對椎間盤疾病的治療有一定的潛力[34]?？偟膩碚f，Treg在椎間盤免疫反應中的作用尚需深入研究。在免疫細胞間相關(guān)性分析中，本研究對于22種免疫細胞兩兩之間的關(guān)系進行了相關(guān)性比較。結(jié)果顯示，γδ T細胞與濾泡輔助性T細胞呈正相關(guān)關(guān)系，中性粒細胞與單核細胞呈負相關(guān)關(guān)系，側(cè)面反映不同免疫細胞之間在LDH的病程進展中存在協(xié)同或拮抗作用。而目前對于不同類型免疫細胞之間的相關(guān)性分析的基礎研究尚缺乏大規(guī)模的驗證，本預測具有一定程度的參考意義。

LDH屬中醫(yī)學“腰痹”范疇。中醫(yī)藥治療LDH的優(yōu)勢之一是能夠調(diào)節(jié)免疫反應，減輕免疫細胞的浸潤和炎癥反應，從而緩解LDH的癥狀。中醫(yī)藥強調(diào)整體觀念和個體化治療，能夠根據(jù)患者的具體病情和體質(zhì)特點，針對性地選用中藥配方，達到治療和調(diào)節(jié)免疫反應的效果。本研究從免疫浸潤的角度對LDH差異靶基因進行中藥反向預測，篩選得出多為辛溫、甘平之藥，歸經(jīng)多歸為肝經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)，功效多與補氣養(yǎng)血、益肝腎、補骨髓及活血化瘀相關(guān)。其中三七、人參、生地黃、枸杞子具有明顯相關(guān)性。三七中的主要成分三七皂苷可以減輕椎間盤細胞因子TNF-α誘導而產(chǎn)生的炎癥反應，并抑制NFκB和MAPKs信號通路的活化，從而抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生，改善椎間盤退變[35]。人參、生地黃均可以減輕椎間盤細胞的炎癥反應，促進椎間盤組織的再生和修復。枸杞多糖可以降低炎癥細胞浸潤和減少氧化應激反應[36-38]。

本研究也存在一些限制。首先，由于本研究所使用的LDH基因芯片數(shù)據(jù)來源于有限的樣本量，可能會因樣本量不足而導致數(shù)據(jù)分析的偏倚。因此，進一步整合多個LDH基因芯片數(shù)據(jù)以減少誤差是必要的。其次，本研究使用CIBERSORT反卷積算法對免疫細胞進行預測，但仍需進一步實驗驗證。