蘇雅航，侯忠余，寇肖迪，劉 爽，朱成林，陳 娟，刀筱芳，唐俊妮,,*

（1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

變形桿菌屬（Proteus）是腸桿菌科的一個種屬，革蘭氏陰性菌，廣泛存在于爬蟲、鳥類、哺乳動物和人類腸道內(nèi)。目前已鑒定出5 種：普通變形桿菌（Proteus vulgaris）、奇異變形桿菌（P.mirabilis）、產(chǎn)黏變形桿菌（P.myxofaciens）、潘氏變形桿菌（P.penneri）和豪氏變形桿菌（P.hauseri）[1]。此外，根據(jù)表型、化學(xué)分類學(xué)和基因型分析，國內(nèi)外學(xué)者提出了6 個新定義菌種：土壤變形桿菌（P.terrae）、卡氏變形桿菌（P.cibarius）、愛滿變形桿菌（P.alimentorum）、天鴿變形桿菌（P.columbae）、矢米變形桿菌（P.faecis）和食物變形桿菌（P.cibi）[2-3]，其中普通變形桿菌和奇異變形桿菌與臨床關(guān)系最為密切[4]。變形桿菌可引發(fā)創(chuàng)傷感染、膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等。長期接受抗生素、激素、免疫抑制劑、抗腫瘤藥物治療的抵抗力下降的病人容易感染變形桿菌[5]。普通變形桿菌是常見的細(xì)菌性感染與食物中毒的病原菌[6]。據(jù)報道，1962—2007年國內(nèi)發(fā)生變形桿菌屬食物中毒事件264 起，中毒人數(shù)達(dá)1.7萬 人[7]。近年來由奇異變形桿菌造成動物發(fā)病率和死亡率逐年增加[8]，給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失及公共衛(wèi)生威脅越來越嚴(yán)重。鴨[9]、犬[10]、牦牛[11]、熊貓[12]等動物感染奇異變形桿菌的報道屢見不鮮。在牦牛屠宰過程中，如未及時清除變形桿菌的污染，人們接觸或誤食也會對健康造成一定的威脅。

目前，多用抗生素防控變形桿菌引起的疾病，但細(xì)菌耐藥性的問題越來越嚴(yán)重，新種類抗生素出現(xiàn)短缺現(xiàn)象，在治療嚴(yán)重的細(xì)菌感染方面產(chǎn)生了大量的未得到滿足的醫(yī)療需求[13]。如果不采取有效措施解決細(xì)菌耐藥性問題，到2050年，將可能導(dǎo)致全球每年約1 000萬 人的死亡和60～100萬億 美元的生產(chǎn)力損失[14]。

噬菌體是細(xì)菌的天然“殺手”，不會被細(xì)菌的耐藥性制約，能特異性識別并殺滅病原菌，不會破壞其他菌群[15]。同時，噬菌體分布廣泛且具有自我繁殖能力強、專一性高等優(yōu)點，噬菌體生物控制是處理食物生產(chǎn)鏈中致病菌污染的理想方法[16]。為了保障食品安全和消費者健康，噬菌體已獲得美國農(nóng)業(yè)部食品及藥物管理局和食品安全與美國農(nóng)業(yè)部的批準(zhǔn)，作為食品原料和加工產(chǎn)品的抗生素代替物[17-19]。關(guān)于變形桿菌噬菌體的研究，目前還處于起步階段，Wirjon等[20]對從污水中分離出的奇異變形桿菌噬菌體pPM_01的生物學(xué)特性與基因組進(jìn)行分析研究，表明分離的噬菌體對奇異變形桿菌具有高度溶解能力，基因組中無毒力基因，可用于開發(fā)噬菌體治療。周祥瑩等[21]以貉源奇異變形桿菌為宿主菌，分離出裂解性噬菌體，為貉奇異變形桿菌病的治療提供了參考。宋軍等[10]從泌尿系統(tǒng)結(jié)石反復(fù)發(fā)作犬的尿液中分離到的奇異變形桿菌為宿主菌，分離到3 株奇異變形桿菌噬菌體，為奇異變形桿菌及其引起的泌尿系統(tǒng)感染的治療奠定基礎(chǔ)。多項研究和患者實驗證明，噬菌體能夠抑制導(dǎo)管表面奇異變形桿菌生物被膜形成[22-25]。以上研究說明對變形桿菌噬菌體的探究非常有意義。關(guān)于變形桿菌噬菌體基因組的研究較少，NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中保存的變形桿菌噬菌體基因組序列不到30 個[26]，少數(shù)變形桿菌噬菌體在形態(tài)、基因組序列長度、寄主范圍和基因含量方面差異很大[27-28]。對變形桿菌噬菌體進(jìn)行分離鑒定及分析非常必要。

本研究通過對牦牛屠宰場采集污水中的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA鑒定，發(fā)現(xiàn)在牦牛屠宰場存在變形桿菌污染，對食品安全造成潛在的威脅。為了更好地防治該細(xì)菌污染，減少抗生素使用，本研究以變形桿菌為宿主菌，從牦牛屠宰場采集的污水中分離得到1 株裂解型噬菌體，通過研究該噬菌體的生物學(xué)特性，以及進(jìn)行噬菌體基因組分析，旨在豐富變形桿菌的噬菌體庫，為進(jìn)一步開發(fā)新型噬菌體抗菌劑提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主菌來自于牦牛屠宰場分離后經(jīng)16S rRNA測序鑒定到的變形桿菌，其他受試菌株均為本實驗室分離保存；污水樣品來源于四川省成都市某牦牛屠宰場。

肉湯培養(yǎng)基（lysogeny broth，LB）、LB瓊脂培養(yǎng)基、SM緩沖液、Phage DNA Isolation Kit試劑盒加拿大N o r g e n B i o t e k 公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；Master Mix 北京擎科新業(yè)科技有限公司；1×TAE緩沖溶液、1×TE緩沖液、REGULARAGAROSEG-10型瓊脂糖 西班牙Biowest公司；含藥紙片 美國Oxiod Limited公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WD800B型微波爐 順德市格蘭仕微波爐電器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；UV-6100分光光度計 上海美普達(dá)儀器有限公司；GHP-9080水式恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市實驗設(shè)備廠；MLS-3020電熱自動滅菌鍋 日本Sanyo公司；5804R型冷凍離心機 Eppendorf中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離菌株的16S rRNA鑒定

將實驗室從牦牛屠宰場多次分離純化保存的菌株接種到T S B 培養(yǎng)基中，3 7 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h，參照文獻(xiàn)[29]報道的方法快速提取菌株DNA。以16S rRNA通用引物27F與1492R對67 株菌株進(jìn)行P C R 擴增，具體引物序列為：上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’[30]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR體系為20 μL，包含Taq1.1×T3 Super PCR Mix 17 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性20 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸30 s；共35 個循環(huán)，72 ℃延伸2 min。

1.3.2 菌株耐藥表性分析

藥敏實驗根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的K-B紙片擴散法進(jìn)行操作，實驗結(jié)果按照CLSI 2019的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[31]。

1.3.3 噬菌體的富集

參照湯婷婷[32]的方法，將采集的污水樣品充分混合均勻后，用4 層紗布過濾，再用2 層濾紙過濾，將過濾的液體在10 000 r/min離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，最終得到混合液體100 mL。將濾液接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基，加入變形桿菌的菌懸液各2 mL，在37 ℃、160 r/min搖床中過夜培養(yǎng)得到1 次富集液。將過夜培養(yǎng)的1 次富集液10 000 r/min離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，取100 mL過濾液再次加入100 mL LB液體培養(yǎng)基和變形桿菌的菌懸液各2 mL進(jìn)行2 次富集，共富集3 次后，將富集液過濾除菌于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 噬菌體的分離與純化

取將放置于冰箱保存的噬菌體原液100 μL分別加入到10 mL無菌EP管中，在每個管中分別加入10 株菌的菌懸液各100 μL，充分混勻后靜置15 min，使噬菌體和宿主菌充分吸附。采用雙層瓊脂平板法[32]進(jìn)行過夜培養(yǎng)，觀察平板生長情況。選出能夠產(chǎn)生噬菌斑的宿主菌接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)6 h后，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

在上述形成噬菌斑的雙層平板上，挑取形態(tài)大小一致的單個噬菌斑，用10 μL槍頭穿刺目的噬菌斑，將穿刺后帶有噬菌體的槍頭伸入2 mL宿主菌懸液中充分混勻，并于37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)6 h。將混合液于8 000 r/min離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后得到噬菌體液。取噬菌體液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，將100 μL處對數(shù)期生長的宿主菌與100 μL噬菌體稀釋液加入5 mL半固體培養(yǎng)基中充分混勻后制成雙層平板，待凝固后倒置，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜，重復(fù)雙層平板純化操作5 次后得到純噬菌體。

1.3.5 噬菌體的透射電鏡觀察

噬菌體純化后測定其效價[33]，得到效價為1010PFU/mL的噬菌體液。將其送檢進(jìn)行透射電鏡觀察，具體方法為：將樣本滴于碳支持膜正面，等待2 min，取出碳支持膜吸干水分，再用磷酸鎢室溫下染色2.5 min，吸干水分，使用JEM-1400PLUS型透射電鏡觀察[34]。

1.3.6 噬菌體裂解譜測定

應(yīng)用點斑法[35]測定噬菌體的裂解譜，將受試菌：29 株糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、10 株變形桿菌、16 株沙門氏菌（Salmonellasp.）、16 株大腸桿菌（Escherichia coli）、47 株阪崎克羅諾桿菌（Cronobacterspp.）培養(yǎng)至OD600nm約為0.3，取100 μL新鮮菌液涂布于LB固體平板，待完全干燥后，于平板中央滴加5 μL噬菌體上清裂解液，室溫靜置至干燥后倒置于37 ℃溫箱中過夜培養(yǎng)后，觀察有無噬菌斑產(chǎn)生，以不添加噬菌體作為對照。

1.3.7 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）

參照并改良Lu等[36]的測定方法，按照不同感染比例（MOI=0.001、0.01、0.1、1、10、100）將噬菌體與生長期的宿主菌混合，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h后取上清液于8 000 r/min離心10 min，收集噬菌體上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，稀釋成不同的梯度與宿主菌混合進(jìn)行雙層平板法培養(yǎng)，次日計算噬菌體效價，重復(fù)3 次，計算平均值。

1.3.8 噬菌體一步生長曲線

參考Lu等[36]的方法，將宿主菌菌懸液與噬菌體菌懸液按照MOI=0.1混合均勻后，37 ℃孵育15 min，將培養(yǎng)物于8 000 r/min離心10 min，用LB液體培養(yǎng)基洗滌3 次，加入5 mL 37 ℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，快速置于37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)，在0～100 min內(nèi)每隔10 min取樣，在100～240 min每隔20 min取樣，測定噬菌體效價。以時間為橫坐標(biāo)，效價為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體的一步生長曲線。裂解量=裂解末期噬菌體效價/裂解初期宿主菌濃度。

1.3.9 理化因素對噬菌體活性的影響

溫度對噬菌體活性的影響[10]：取1 mL噬菌體分別于25、35、45、55、65 ℃和75 ℃中孵育1 h后，雙層平板法測其效價，每組重復(fù)3 次。

pH值對噬菌體活性的影響[10]：將噬菌體按體積比1∶9分別添加到pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0的SM緩沖液中，37 ℃孵育1 h后測其效價，每組重復(fù)3 次。

有機試劑對噬菌體活性的影響：將1 mL噬菌體液（6.4×109PFU/mL）分別加入到1 mL 75%乙醇、80%丙酮、氯仿和50%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液中，室溫作用30 min后，雙層平板法測定噬菌體效價[32]，將噬菌體接種于SM緩沖液中作為對照組，每組重復(fù)3 次。

紫外照射對噬菌體活性的影響：為評價噬菌體對紫外線的敏感性[37]，取7 mL噬菌體液（1010PFU/ml）于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于距紫外燈10 cm處照射，在0～60 min內(nèi)每隔10 min取樣一次，雙層平板法測定其效價，每組重復(fù)3 次。

1.3.10 不同MOI噬菌體對宿主菌的裂解效果

將噬菌體與宿主菌按照不同的MOI（0.1、10、100、1 000）各取100 μL加入96 孔板中[37]。另設(shè)空白為200 μL的LB液體培養(yǎng)；對照組為100 μL宿主菌與100 μL LB培養(yǎng)基，將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，每隔1 h測定其在600 nm波長處的吸光度，共測定10 h。

1.3.11 噬菌體基因組提取與全基因組測序

對純化后的噬菌體測序，進(jìn)行基因組分析。具體的步驟為：使用Phage DNA Isolation Kit試劑盒提取噬菌體總DNA，采用Illumina測序技術(shù)完成噬菌體的基因組擴增及深度測序，構(gòu)建了Illumina PE文庫，將去除污染序列后得到的reads進(jìn)行de novo組裝。使用SPAdes和MEGAHIT軟件對二代數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝。同時可以選取不同的k-mer長度進(jìn)行組裝。根據(jù)提取序列病毒結(jié)果，統(tǒng)計測序相關(guān)深度和覆蓋度；根據(jù)實際測序深度計算每100 bp區(qū)間的平均深度。將提取到的序列選用prokka進(jìn)行注釋，將注釋結(jié)果與NCBI NT、NR庫比對。

1.4 數(shù)據(jù)處理

16S rRNA測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行比對，將比對結(jié)果用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析。噬菌體的生物學(xué)特性實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和Origin 2021軟件進(jìn)行分析繪圖。噬菌體的基因組測序、組裝、拼接與注釋由北京擎科生物有限公司完成，用CGView Comparison Tool繪制基因圖譜，用MEGA 7.0完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的16S rRNA鑒定

分離菌株用16S rRNA基因通用引物擴增后，將67 株菌PCR產(chǎn)物送檢測序得到菌株的核酸序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)菌株29與糞腸球菌同源性較高，10 株與變形桿菌同源性高達(dá)98%～99%，1 株與葡萄球菌同源性99%。選取同源性較高的變形桿菌菌株序列，用MEGA X的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果顯示，2、7、8、12、22、23、29、65、66菌株和普通變形桿菌（P.vulgaris）在同一分支上，親緣關(guān)系較近，從分子水平確定10 株菌株為普通變形桿菌。

圖1 分離菌株16S rRNA基因的進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of the isolated strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 宿主菌的耐藥表型分析

臨床上普通變形桿菌與奇異變形桿菌關(guān)系較密切[2,4]，本研究選取1 株與普通變形桿菌同源性較高的菌株66為代表，探究其藥物敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株66對頭孢曲松、頭孢他啶、諾氟沙星、苯唑西林等6 種抗生素敏感，對阿米卡星、卡那霉素、鏈霉素等6 種抗生素中度敏感，對頭孢西丁、青霉素、氨芐西林、紅霉素、萬古霉素等9 種抗生素耐受（表1）。

表1 藥敏分析Table 1 Antibiotic susceptability of host bacteria

2.3 分離噬菌體的噬菌斑形態(tài)與透射電鏡結(jié)構(gòu)

以變形桿菌為宿主菌，經(jīng)3 次富集后分離的到1 株烈性噬菌體。選取的噬菌體經(jīng)3 次純化后，經(jīng)培養(yǎng)可在雙層瓊脂平板上形成清晰、透亮、大小均一的噬菌斑（圖2A、B），將其命名為Proteusphage PV66。將純化噬菌體液進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染后透射電鏡觀察，結(jié)果顯示，噬菌體由1 個棒狀的頭部和可伸縮尾部組成（圖2C、D）。頭部長（140±1）nm、寬（54±1）nm，尾部長為（36±1）nm，從形態(tài)上初步判斷噬菌體屬于短尾噬菌體，與C3形態(tài)的噬菌體較為接近[37-38]。

圖2 噬菌斑照片（A、B）和透射電鏡圖（C、D）Fig.2 Plaques (A and B) and TEM morphology (C and D) of phage PV66

2.4 噬菌體裂解譜

通過點斑實驗測定裂解譜，結(jié)果顯示該噬菌體可裂解10 株變形桿菌中的4 株，對實驗室分離的沙門噬菌、糞腸球菌、大腸桿菌和阪奇克羅諾桿菌未表現(xiàn)出裂解活性（表2）。表明噬菌體可裂解部分變形桿菌，其裂解效力將在后續(xù)實驗中進(jìn)一步研究。

表2 噬菌體PV66的裂解譜Table 2 Lytic spectrum of phage PV66

2.5 噬菌體的最佳MOI測定結(jié)果

從圖3可以看出，在6 組不同的MOI中，當(dāng)MOI為0.1時，噬菌體效價最高為3.18×1011PFU/mL，MOI為0.001、1和10時效價次之，MOI為0.01和100效價最低，表明噬菌體PV66最佳MOI為0.1。

圖3 噬菌體PV66最佳MOI測定結(jié)果Fig.3 MOI of phage PV66

2.6 噬菌體的一步生長曲線測定結(jié)果

如圖4所示，噬菌體的潛伏期為10 min，這段時間噬菌體量基本沒有增加；爆發(fā)期為100 min，在感染后0～80 min內(nèi)，噬菌體持續(xù)增長，在80 min后趨于平穩(wěn)，因此噬菌體感染期的時間約為80 min。裂解末期噬菌體效價為12.2×1010PFU/mL，感染初期宿主菌濃度為3.8×108CFU/mL，得到噬菌體PV66感染宿主菌的裂解量約為321 PFU/cell。

圖4 噬菌體PV66的一步生長曲線Fig.4 One-step growth curve of phage PV66

2.7 理化因素對噬菌體的影響

通過對噬菌體PV66溫度耐受的測定（圖5A），在60 min處理時間下，隨著溫度升高，噬菌體活性受到顯著影響，在溫度高于55 ℃，噬菌體效價開始急劇下降，在溫度高于75 ℃，噬菌體PV66失去活性。由圖5B可知，噬菌體在pH 3～12范圍內(nèi)，其效價均值在108以上，具有穩(wěn)定和良好的裂解活性。當(dāng)pH值為2和13時，完全失去感染宿主的能力。結(jié)果分析表明噬菌體作用的pH值范圍較廣，可具有良好的運用價值，但對高溫敏感，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時噬菌體活性受到明顯影響。

圖5 PV66的熱穩(wěn)定性（A）和酸堿穩(wěn)定性（B）測定結(jié)果Fig.5 Thermal (A) and pH (B) stability of phage PV66

由圖6可知，噬菌體在60 min內(nèi)被紫外照射后效價依然可達(dá)109PFU/mL，但對80%丙酮耐受性較低，對50%DMSO、75%乙醇與SM液耐受性較高。

圖6 PV 66對紫外線的敏感性（A）和有機試劑的耐受性（B）測定結(jié)果Fig.6 UV susceptibility (A) and organic solvent tolerance (B) of phage PV66

2.8 不同MOI的噬菌體對宿主菌的裂解效果

如圖7所示，在10 min內(nèi)，陽性對照曲線保持上升狀態(tài)，MOI為0.1的曲線在0～2 h內(nèi)呈上升狀態(tài)后穩(wěn)定不變，隨后呈下降趨勢，MOI為10、100、1 000的曲線與陰性對照曲線在1 h基本保持一致，由此可知，不同MOI的噬菌體可以很好地抑制宿主菌的生長，且MOI越高，抑菌效果越好。

圖7 不同MOI噬菌體對宿主菌的裂解效果Fig.7 Lytic effect of phages with different infection numbers on host bacteria

2.9 噬菌體全基因組測序分析

2.9.1 基因組特征

基于全基因組測序結(jié)果（表3），噬菌體PV66全序列長度為90 492 bp，基因組GC含量為38.28%。預(yù)測了143 個編碼序列（coding sequence，CDS），129 個CDS為假想蛋白，其中9 個CDS具有潛在功能，分別為DNA聚合酶、DNA連接酶、核酸相關(guān)酶及結(jié)構(gòu)蛋白，4 個tRNA。未發(fā)現(xiàn)毒力基因及細(xì)菌抗性基因，未預(yù)測出噬菌體的裂解酶蛋白與Holi系統(tǒng)，原因可能是數(shù)據(jù)庫中關(guān)于變形桿菌噬菌體功能基因的信息量不足。

表3 噬菌體PV66基因組特征Table 3 Genomic characteristics of phage PV66

2.9.2 噬菌體PV66基因編碼與同源蛋白比對分析

將噬菌體序列注釋后的結(jié)果在NCBI的NT數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對（表4），發(fā)現(xiàn)噬菌體與Cronobacterphage vB_CsaP_009和Proteusphage Privateer具有相似的蛋白，且均具有93%以上的核酸序列相似性。BLAST結(jié)果表明，與Cronobacterphage vB_CsaP_009相似的蛋白有111 種，與Proteusphage Privateer相似蛋白有17 種。vB_CsaP_009與Privateer均為C3形態(tài)噬菌體[39]，由比對結(jié)果可知，PV66與vB_CsaP_009具有較高相似性。

表4 噬菌體PV66 CDS的比對結(jié)果Table 4 Results of similarity alignment of CDS between phage PV66 and NT database

2.9.3 基因組比較分析

把噬菌體PV66的全基因組序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示PV66與Proteusphage Privateer、Cronobacterphage vB_CsaP_009的同源性較高分別為89.34%、95.20%，與其他噬菌體基因同源性較低，將兩條同源性較高的序列與PV66噬菌體系列進(jìn)行基因比較，發(fā)現(xiàn)PV66與Proteusphage Privateer和Cronobacterphage vB_CsaP_009基因間存在缺失與插入的差異，顯示PV66噬菌體可能為一個全新的噬菌體。

2.9.4 噬菌體的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過觀察噬菌體的電子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，噬菌體為罕見的C3形態(tài)的噬菌體，檢索相關(guān)噬菌體分類的記錄，包括NCBI Taxonomy和International Committee on Virus Taxonomy中提出的許多未分類的噬菌體和數(shù)個Kuraviru屬的記錄，參照已有研究[39-40]描述C3形態(tài)的噬菌體，選擇這些噬菌體的主要衣殼蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析。如圖8所示，發(fā)現(xiàn)PV66與奇異變形桿菌噬菌體podophage Privateer和克羅諾桿菌噬菌體vB_CsaP_009均有83%的相似性，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)PV66和vB_CsaP_009處于同一分支上，結(jié)合噬菌體的電鏡形態(tài)特征與噬菌體宿主菌可判斷PV66為C3形態(tài)、non-Kuravirus屬的噬菌體。

3 討論與結(jié)論

變形桿菌廣泛存在于自然界中，不僅危害犬、貓、狐貍、熊貓、牛等動物的健康，對人類的安全也有很大威脅[6]。關(guān)于變形桿菌引起的食品中毒的事件屢見報道[7]，因此對食品生產(chǎn)加工過程中細(xì)菌污染的防控也尤為重要。傳統(tǒng)的細(xì)菌污染多采用抗生素和消毒劑進(jìn)行控制，但由于抗生素的大量不合理使用，以及新種類抗生素的短缺，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性現(xiàn)象廣泛存在，細(xì)菌耐藥性增長的問題越來越嚴(yán)重[17]。多項研究發(fā)現(xiàn)，普通變形桿菌和奇異變形桿菌均對多種抗生素表現(xiàn)為耐藥[2,4,10-14]。

本研究從牦牛屠宰過程中分離純化的菌株純培養(yǎng)后進(jìn)行16S rRNA測序鑒定，通過在GenBank比對發(fā)現(xiàn)有10 株菌與普通變形桿菌同源性為98%～99%，通過耐藥表型的分析發(fā)現(xiàn)菌株對頭孢西丁、青霉素、氨芐西林、紅霉素、萬古霉素等9 種抗生素耐受，如果在牦牛屠宰過程中變形桿菌未及時清除，可能會對人類和其他動物造成潛在的危險。隨著抗生素監(jiān)管措施越來越嚴(yán)格[18]，促使人們不斷尋找新型安全的抗菌劑。噬菌體是一種特異性強且裂解性高的對細(xì)菌具有殺滅作用的病毒，對噬菌體的分離鑒定及生理特性的研究，對治療耐藥細(xì)菌感染具有重要的意義[19]。

本研究從四川某屠宰場采集的污水中分離到1 株烈性噬菌體，透射電鏡發(fā)現(xiàn)噬菌體為罕見的C3形態(tài)噬菌體[39-40]。最佳MOI為0.1，一步生長曲線表明噬菌體的潛伏期短，裂解量高，對溫度的耐受值最高為65 ℃，pH值耐受范圍2～13，對紫外線照射及有機試劑耐受性良好，且對細(xì)菌的裂解效果較好。這些性質(zhì)與之前報道的變形桿菌噬菌體特性[10,38]相差不大，表明噬菌體PV66具有很好的應(yīng)用價值。

基因組學(xué)是從分子水平了解噬菌體特性的有效方法之一?；蚪M的遺傳多樣性和相似性與噬菌體的裂解能力密切相關(guān)[41]。關(guān)于變形桿菌噬菌體的研究較少，尤其是C3形態(tài)的噬菌體，目前僅有一篇文獻(xiàn)報道了1 株奇異變形桿菌噬菌體與本研究噬菌體極其相似[39]，到目前為止，只有不到30 個變形桿菌噬菌體基因組被測序[26]，未來還應(yīng)對更廣泛的變形桿菌噬菌體進(jìn)行測序和研究。

本研究將提取到的序列選用prokka進(jìn)行注釋，注釋出143 個CDS，預(yù)測出14 個CDS具有假定的功能，另外的129 個CDS功能未知。注釋的蛋白為DNA連接酶、DNA聚合酶及核酸有關(guān)的酶和結(jié)構(gòu)蛋白衣殼蛋白，含有4 個tRNA。RNA酶可確保tRNA在宿主體內(nèi)保持穩(wěn)定和足夠的數(shù)量，以促進(jìn)噬菌體蛋白質(zhì)的快速產(chǎn)生，能夠幫助噬菌體更好地適應(yīng)不同的宿主菌或環(huán)境[42]。大部分CDS功能未知，主要是因為數(shù)據(jù)庫中關(guān)于變形桿菌噬菌體功能基因的信息量仍然不足，目前關(guān)于變形桿菌噬菌體功能基因的研究結(jié)果仍然很有限。因此，在噬菌體功能基因組學(xué)的研究中，未知基因功能的鑒定仍然是比較迫切的工作。

本研究以牦牛屠宰場分離到的變形桿菌為宿主菌，從污水中分離到1 株烈性噬菌體PV66，是鮮少被報道感染變形桿菌宿主的短尾噬菌體，并表現(xiàn)出典型的尾狀病毒感染特征，包括爆炸裂解行為，此種噬菌體宿主范圍相對較窄，可感染與變形桿菌最接近且具有遺傳親緣關(guān)系的克羅諾桿菌[39]。分析其生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)其具有潛伏期短、爆發(fā)量大、pH值作用范圍廣、溫度耐受性高等優(yōu)點?；蚪M分析預(yù)測了形態(tài)發(fā)生、裂解、DNA復(fù)制和重組以及生物合成等蛋白質(zhì)功能，未發(fā)現(xiàn)抗生素相關(guān)基因和毒力基因，因此，噬菌體PV66將具有較好的應(yīng)用于變形桿菌生物防治的潛力。