馬 強(qiáng),于珊珊,孟 杰,馬 躍,張華新

(唐山市協(xié)和醫(yī)院,河北 唐山 063000)

近年來研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌具有趨骨性,大約有65%～80%的晚期患者都會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移,而發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者都會(huì)承受不同程度的骨癌痛折磨,這是晚期患者早出現(xiàn)、最痛苦的癥狀之一,嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量,因此有效控制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展以及有效鎮(zhèn)痛是當(dāng)今腫瘤學(xué)研究的重要課題[1]。天然殺傷(Natural killer,NK)細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞,在固有性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用,此外有研究表明其具有自發(fā)溶解腫瘤細(xì)胞的能力,不需致敏就可直接殺傷敏感的腫瘤細(xì)胞,是抗腫瘤的第一道防線,同時(shí)在降低癌癥復(fù)發(fā)和第二種癌癥風(fēng)險(xiǎn)上又具有舉足輕重的作用,因此有效調(diào)控NK細(xì)胞活性可成為治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌的發(fā)生與生物鐘系統(tǒng)紊亂有關(guān),而前動(dòng)力蛋白2(Prokineticin2,PK2)是一種分泌型的小分子蛋白,近年來研究發(fā)現(xiàn)其是節(jié)律控制中樞視交叉上核一種重要的節(jié)律輸出信號(hào)分子,在生物晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[4-5]。目前臨床治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的方法很多,但效果多數(shù)不理想,因此尋找新的靶點(diǎn)已成為當(dāng)今世界治療癌癥、控制癌痛的關(guān)鍵和熱點(diǎn)之一[6]。中醫(yī)學(xué)中的穴位刺激法作為中醫(yī)藥非常具有代表性的治療方法之一,具有安全、簡(jiǎn)便、并發(fā)癥小與應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。此外,近年來研究表明,其在控制癌痛方面效果也較顯著,止痛作用較快且效果可靠,還不會(huì)產(chǎn)生依賴性、成癮性及戒斷性,因此被廣泛應(yīng)用于臨床[7]。近年來有研究表明,環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)與包括乳腺癌在內(nèi)多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及新生血管生成和抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮了必不可少的作用,故COX-2抑制劑應(yīng)運(yùn)而生,且臨床應(yīng)用取得了較為理想的效果[8]。因此,本研究就穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠鎮(zhèn)痛、NK細(xì)胞活性及PK2蛋白的作用機(jī)制進(jìn)行研究探討,為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選取北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的60只SPF級(jí)SD雌性大鼠[合格證書為:SCXK(京)2021-0008],平均體質(zhì)量200～250 g,大鼠單籠喂養(yǎng),室溫生長(zhǎng),模仿12 h晝夜交替,在常溫下進(jìn)行無(wú)菌自由進(jìn)食、飲水2周,按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

乳腺癌細(xì)胞(型號(hào):YT800239,北京伊塔有限公司);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(型號(hào):HANS-200,南京濟(jì)生有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號(hào):CX-60,日本OLYMPUS公司);塞來昔布(貨號(hào):YT0490,北京伊塔有限公司);VonFrey針刺痛覺測(cè)試套件(貨號(hào):Aesthesio,深圳瑞沃德有限公司);大鼠平衡測(cè)痛儀(型號(hào):ZL-024,安徽耀坤有限公司);熱痛刺激儀(型號(hào):BME-410C,天津伯爾尼有限公司);雙能線骨密度儀(型號(hào):EXA-3000,上海聚慕有限公司);蘇木素染液(貨號(hào):E-IR-R120,武漢伊萊瑞特有限公司);伊紅染液(貨號(hào):J-SG1100-500,上海研謹(jǐn)有限公司);RIPA裂解液(貨號(hào):SY4680,北京伊塔有限公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào):E112-01,南京諾唯贊有限公司);SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(貨號(hào):KGP113,凱基有限公司);NKp30抗體(貨號(hào):81349-RP01,北京義翹神州有限公司);NKp44抗體(貨號(hào):ATA33975,武漢益普有限公司);NKp46抗體(貨號(hào):310305-T36,北京義翹神州有限公司);PK2抗體(貨號(hào):YB115Bo01,上海鈺博技有限公司);GAPDH抗體(貨號(hào):FNab03343,武漢菲恩有限公司);ECL檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):CDLG-4911,武漢純度有限公司);免疫組化試劑盒(貨號(hào):YDDEF001,上海羽哚有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模 隨機(jī)選取50只大鼠,禁食12 h后,腹腔注射3%戊巴比妥納麻醉大鼠,然后暴露出左側(cè)脛骨內(nèi)側(cè)面,用一次性椎體成形術(shù)開路器鉆孔后,取制備好的10 μL,2×105個(gè)/mL的乳腺癌細(xì)胞懸液緩慢注入骨髓腔內(nèi), 注射完畢靜置3 min后,針孔用骨蠟密封, 將肌肉及皮膚縫合好并消毒,術(shù)后連續(xù)4 d給予大鼠注射10 mg/kg的T胺卡納霉素預(yù)防感染。當(dāng)大鼠出現(xiàn)的體質(zhì)量下降、毛色灰暗、精神萎靡與患肢運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀,則可視為造模成功。造模過程中大鼠死亡3只,其余均建模成功。

1.3.2 分組與干預(yù) 隨機(jī)選取建模成功的大鼠40只,隨機(jī)數(shù)字表將其分為模型(B)組、穴位刺激(C)組、COX-2抑制劑(D)組和穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑(E)組,每組10只,取剩余10只健康大鼠作為正常(A)組。對(duì)C組大鼠給予穴位刺激治療[9],首先固定好大鼠頭部和尾部,然后用韓氏穴位神經(jīng)刺激儀取背部雙側(cè)L3～5夾脊穴進(jìn)行單針治療,刺激參數(shù)為音頻脈沖調(diào)制波、800 Hz和0.6 μA,每次刺激20 min;對(duì)D組給予灌胃25 mg/kg的塞來昔布;對(duì)E組給予穴位刺激聯(lián)合塞來昔布治療。3組均1次/d,治療30 d,A組、B組同期給予灌胃同體積生理鹽水。

1.3.3 大鼠疼痛檢測(cè) 用Von Frey纖維刺激左足的50%縮足閾值(50% Paw withdrawal threshold,50%PWT),以評(píng)價(jià)機(jī)械痛覺超敏,用大鼠平衡測(cè)痛儀測(cè)定雙側(cè)后肢負(fù)重差值表示機(jī)械痛覺過敏,用熱痛刺激儀測(cè)定的熱縮足反射潛伏期(Thermal withdrawal latency,TWL),以評(píng)價(jià)熱痛覺過敏,均測(cè)量3次取平均值并記錄。

1.3.4 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)完成后,腹腔注射1%利多卡因麻醉處死大鼠,剝?nèi)テつw和肌肉組織,保留完整的脛骨和骨轉(zhuǎn)移腫瘤,雙能線骨密度儀檢測(cè)骨密度(Bone mineral density,BMD)和骨礦物質(zhì)含量(Bone mineral content,BMC)后,4%多聚甲醛溶液固定24 h,常規(guī)石蠟包埋、切片,放入冰箱密封保存。

1.3.5 大鼠病理組織HE染色 取各組大鼠脛骨組織,二甲苯及梯度乙醇脫蠟后,用蘇木素-伊紅染液行HE染色,完成后,進(jìn)行梯度乙醇及二甲苯脫水、透明和中性樹膠封片處理,用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.3.6 免疫印跡法檢測(cè)大鼠脛骨組織中NK細(xì)胞活化性受體蛋白 取各組脛骨組織清洗、剪碎,用RIPA裂解液在冰上充分裂解10 min,離心后取上清液用BCA法測(cè)定蛋白濃度,首先按照試劑盒說明書配置好工作液,然后取等濃度的上清液加入等體積的加樣緩沖液,沸水浴3 min,冷卻后用電泳儀進(jìn)行電泳,電泳完成后,半干法進(jìn)行軟膜,轉(zhuǎn)膜條件為80 V 120 min,轉(zhuǎn)膜1.5 h,洗滌后置于封閉液中37℃封閉2 h,加入稀釋的NKp30、NKp44及NKp46的一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次,加入稀釋的辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000),37 ℃孵育2 h;PBS洗滌3次,用ECL熒光試劑盒測(cè)定結(jié)果,計(jì)算與GAPDH比值求得NKp30、NKp44及NKp46蛋白的相對(duì)表達(dá)含量。

1.3.7 免疫組化檢測(cè)大鼠脛骨組織中PK2蛋白表達(dá) 取各組腎組織,用二甲苯進(jìn)行脫蠟,乙醇進(jìn)行梯度水化后,進(jìn)行組織抗原修復(fù)及H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶,10%的山羊血封閉2 h,加入稀釋的PK2一抗(1∶100),4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次,加入生物素標(biāo)記的二抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素,37 ℃孵育30 min,PBS洗滌3次,DAB顯色試劑盒顯色10 min,脫水、透明和中性樹膠封片后顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠疼痛比較

與A組比較,B組50%PWT、TWL顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),雙側(cè)后肢負(fù)重差值顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組、D組與E組50%PWT、TWL明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),雙側(cè)后肢負(fù)重差值顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);E組比D組變化明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠疼痛指標(biāo)比較

2.2 各組HE染色比較

A組大鼠骨組織形態(tài)完整,骨小梁排列整齊,骨皮質(zhì)連續(xù),無(wú)壞死區(qū)域,骨髓腔內(nèi)充滿深染的血細(xì)胞,B組骨組織形態(tài)遭到破壞,骨皮質(zhì)出現(xiàn)連續(xù)性中斷,并可見大量腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn),瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,且排列紊亂,細(xì)胞核大,異型性明顯,與B組比較,C組、D組及E組病理形態(tài)明顯改善。見圖1。

圖1 各組大鼠脛骨HE染色(200×)

2.3 各組大鼠BMD、BMC比較

與A組比較,B組BMD、BMC顯著降低(P<0.05);與B組比較,C組、D組與E組BMD、BMC顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);E組比D組升高顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠BMD、BMC比較

2.4 各組大鼠NK細(xì)胞活化相關(guān)指標(biāo)結(jié)果

與A組比較,B組大鼠脛骨組織中NKp30、NKp44及NKp46蛋白表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠脛骨組織中NKp30、NKp44及NKp46蛋白表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且D組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);E組比D組升高顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠脛骨組織中NKp30、NKp44及NKp46蛋白表達(dá)

2.5 各組大鼠脛骨組織PK2蛋白表達(dá)結(jié)果

與A組比較,B組大鼠脛骨組織中PK2蛋白表達(dá)顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組、D組及E組大鼠脛骨組織中PK2蛋白表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);E組比D組升高顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05)。見表4、圖3。

圖3 各組大鼠脛骨組織PK2蛋白免疫組化圖(200×)

表4 各組大鼠脛骨組織PK2蛋白表達(dá)

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重影響女性生命安全的世界性公共健康問題,而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的重要原因,其中骨轉(zhuǎn)移是晚期乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位,占70%,骨轉(zhuǎn)移可以導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨折、骨痛等一系列骨相關(guān)事件,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,甚至可能導(dǎo)致患者死亡[10]。因此,探究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)是目前臨床治療亟待解決的重大課題。所以,本研究就穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠鎮(zhèn)痛、NK細(xì)胞活性及PK2蛋白的作用機(jī)制進(jìn)行研究探討,以期為臨床治療提供新的思路及治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn),穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠具有顯著療效,可顯著改善乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型大鼠骨組織形態(tài),提高BMD、BMC,并起到顯著鎮(zhèn)痛作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),針灸穴位治療具有良好的鎮(zhèn)痛作用,且協(xié)調(diào)胃腸平滑肌功能、改善機(jī)體免疫和抗機(jī)體氧化應(yīng)激等,且穴位刺激在我國(guó)得到了幾千年的應(yīng)用,隨著近幾十年的發(fā)展,更是受到了國(guó)內(nèi)外專家的認(rèn)同及肯定,其價(jià)格不高,對(duì)身體無(wú)害,具有良好的鎮(zhèn)痛作用[11]。塞來昔布是COX-2抑制劑的一種,是新一代的非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥,有研究表明對(duì)輕、中度癌痛安全有效,并能改善1/3患者生活質(zhì)量、1/2患者體能狀況及2/3患者活動(dòng)障礙,此外在抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡方面具有重要作用[12]。有研究表明,針刺可通過興奮外周傳入纖維,調(diào)節(jié)下行抑制通路、痛覺調(diào)制負(fù)反饋通路、皮層丘腦環(huán)路以及通過締結(jié)組織聯(lián)軸效應(yīng)改變病變部位細(xì)胞的以鈣離子為主通道參與鎮(zhèn)痛[13]。而對(duì)于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠,針刺L3～5夾脊穴可通過督脈、膀胱經(jīng)、脊神經(jīng)和交感神經(jīng)的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)作用發(fā)揮效應(yīng),從而疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)節(jié)氣血以治痛,又與心、腦和髓關(guān)系密切,影響神氣而治痛,穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑則可能是通過外治及內(nèi)治相結(jié)合疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀和調(diào)和氣血,同時(shí)增加COX-2抑制劑的有效利用率,從而有效促進(jìn)血液循環(huán)及誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長(zhǎng)入、促進(jìn)內(nèi)源性阿片肽物質(zhì)等神經(jīng)肽類物質(zhì)的釋放,進(jìn)而抑制神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮、減少致痛物質(zhì)釋放,最終達(dá)到有效鎮(zhèn)痛的目的。蔡楊乾等研究表明[14],電針對(duì)乳腺癌細(xì)胞致骨癌痛大鼠具有顯著的鎮(zhèn)痛作用,同時(shí)還可顯著改善NK細(xì)胞活性,這與本研究結(jié)果類似。

本研究表明,與B組比較,C組、D組、E組大鼠脛骨組織中NKp30、NKp44及NKp46蛋白表達(dá)顯著升高,且D組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,E組比D組升高顯著,這說明穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑可顯著改善NK細(xì)胞活性。NK細(xì)胞是固有免疫的執(zhí)行者,主要是通過其表面活化性與抑制性受體的協(xié)同調(diào)控發(fā)揮作用,近年來研究表明,其在人體內(nèi)對(duì)腫瘤起著非常重要的免疫作用,不經(jīng)活化就可借助細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用殺傷腫瘤細(xì)胞,發(fā)揮特異性抗腫瘤作用,同時(shí)也被視為免疫監(jiān)視網(wǎng)絡(luò)的一部分,尤其在腫瘤監(jiān)視中具有重要地位,故當(dāng)其活性降低時(shí)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫監(jiān)視功能受損,從而致使癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸,進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。自然細(xì)胞毒性受體是NK細(xì)胞特有的活化性受體,其在NK細(xì)胞活化及殺傷作用中發(fā)揮著重要作用,而NKp30、NKp44與NKp46是NCRs的重要成員,可有效反映NK細(xì)胞活性[16]。對(duì)于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠,穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑可能是通過加強(qiáng)血液和淋巴循環(huán)以及離子的運(yùn)轉(zhuǎn),來促進(jìn)局部代謝及受體相應(yīng)銜接蛋白表達(dá),從而促進(jìn)NKp30、NKp44及NKp46等活化受體的表達(dá)和促使機(jī)體新陳代謝加速等,進(jìn)而促使NK細(xì)胞活化,發(fā)揮其免疫監(jiān)視作用,最終起到對(duì)腫瘤細(xì)胞快速殺傷和溶解的作用。張知云研究發(fā)現(xiàn)[17],NK細(xì)胞活性在乳腺癌小鼠中顯著降低,給予電針治療后,NK細(xì)胞活性顯著改善,這與本研究結(jié)果類似。

本研究發(fā)現(xiàn),與B組比較,C組、D組和E組大鼠脛骨組織中PK2蛋白表達(dá)顯著升高,且D組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,E組比D組升高顯著,這說明穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑可顯著促進(jìn)PK2蛋白表達(dá)。生物鐘系統(tǒng)作為機(jī)體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分,其幾乎維持著所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞代謝的穩(wěn)定性,同時(shí)維持著生物體晝夜節(jié)律的正常運(yùn)轉(zhuǎn),保障著各種生物的健康和繁衍,故一旦失調(diào)就會(huì)導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生,乳腺癌同樣的發(fā)生、發(fā)展就與此密切相關(guān)[18]。而PK2不僅在炎癥細(xì)胞的增殖、分化和遷移中起到重要作用,其基因的轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生還對(duì)生物節(jié)律紊亂地起調(diào)控作用,有研究表明敲除小鼠PK2 基因,動(dòng)物行為和多種生理活動(dòng)的晝夜節(jié)律會(huì)被打亂,故可推測(cè)促進(jìn)其表達(dá)將成為治療乳腺癌的有效靶點(diǎn)[19]。而對(duì)于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠,穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑可能是通過抑制微血管形成來調(diào)整內(nèi)分泌系統(tǒng),并調(diào)控相關(guān)分子轉(zhuǎn)導(dǎo),從而調(diào)整細(xì)胞功能,促進(jìn)PK2表達(dá),進(jìn)而達(dá)到調(diào)控生物鐘系統(tǒng)的目的,最終有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。李勝吾等研究發(fā)現(xiàn)[20],PK2在乳腺癌小鼠中呈低表達(dá),給予電針干預(yù)后PK2表達(dá)顯著升高,這與本研究結(jié)果類似。

綜上所述,穴位刺激聯(lián)合COX-2抑制劑對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠具有顯著的鎮(zhèn)痛作用,并可顯著改善NK細(xì)胞活性,促進(jìn)PK2蛋白表達(dá)。