王家栩，賈麗麗，李嘉欣，張密霞，王志敏，馬春麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）是一種具有雙結(jié)構(gòu)域的二肽基羧基酶，在機(jī)體血壓調(diào)節(jié)的過程中起著至關(guān)重要的生理作用[1]。它可以水解血管緊張素I，使之變成具有收縮血管功能的血管緊張素II，同時(shí)水解具有舒張血管作用的緩激肽和N-乙酰基-SDKP，造成機(jī)體血壓的升高[2]。因此，抑制ACE 的生物活性對防治高血壓具有十分重要的意義[3]。

來源于食源蛋白質(zhì)的ACE 抑制肽因原料豐富、安全性高的特點(diǎn)具有顯著優(yōu)勢[4]，不僅為開發(fā)新型ACE 抑制劑藥物提供了新思路，且可以作為功能性成分廣泛應(yīng)用于保健食品中，起到預(yù)防心腦血管疾病的作用。目前，已有報(bào)道從乳蛋白如牛乳酪蛋白[5]、羊乳酪蛋白[6]、乳清蛋白[7]；植物蛋白如玉米蛋白[8]、藜麥分離蛋白[9]、花生蛋白[10]；動物源蛋白如肌原纖維蛋白[11]、血紅蛋白[12]等中獲取了ACE 抑制肽，且取得良好效果。乳酸菌發(fā)酵是生產(chǎn)ACE 抑制肽的一種常見方法，在發(fā)酵過程中，微生物自身的蛋白酶系統(tǒng)能夠水解乳蛋白，產(chǎn)生具有ACE 抑制活性的肽，賦予發(fā)酵乳ACE 抑制活性[13]。日本Calpis 公司和芬蘭Evolu 公司推出了含有ACE 抑制肽（VPP和IPP）的發(fā)酵乳制品，并廣受消費(fèi)者好評[14-15]。因此，開發(fā)具有降血壓活性的發(fā)酵乳對于食品工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值和前景。

蛋白質(zhì)強(qiáng)化被證實(shí)可以提高發(fā)酵乳的ACE 抑制活性并改善其品質(zhì)[16]。一些研究結(jié)果顯示，經(jīng)過蛋白質(zhì)強(qiáng)化后的發(fā)酵乳組織更加緊密，乳清析出更少，同時(shí)彈性模量和黏性膜量顯著提高，形成了更強(qiáng)的凝膠網(wǎng)絡(luò)[17]。此外，發(fā)酵乳的風(fēng)味主要由乳酸和揮發(fā)性物質(zhì)在發(fā)酵過程中生成，因此蛋白質(zhì)的改變還會對發(fā)酵乳滋味產(chǎn)生影響[18]。Bierzuńska 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，添加聚合乳清蛋白的酸奶的保水性、內(nèi)聚性和黏性指數(shù)均明顯提高，香味更加濃郁。El-Fattah 等[20]使用乳清蛋白對牛奶進(jìn)行強(qiáng)化，制備了具有心腦血管保健功能的發(fā)酵乳。Iwaniak 等[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過β-酪蛋白強(qiáng)化后，高達(dá)干酪的肽譜發(fā)生變化，ACE 抑制活性顯著提高。酪蛋白酸鈉作為一種蛋白質(zhì)強(qiáng)化劑，具有良好的增稠性、乳化性和起泡性[22-23]，常被用于發(fā)酵乳中以起到增加黏度、提高硬度、減少乳清析出的作用[24]。在本研究中，使用酪蛋白酸鈉作為蛋白質(zhì)強(qiáng)化劑，以提高發(fā)酵乳的ACE 抑制活性、改善發(fā)酵乳的品質(zhì)。除此之外，本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)，分離來自生牛乳的Lb.plantarumM11 具有良好的耐酸、耐鹽、耐膽鹽以及蛋白水解能力，作為附屬發(fā)酵劑添加至發(fā)酵乳中也可以顯著提高發(fā)酵乳的ACE抑制活性。為此，本研究以獲得高產(chǎn)ACE 抑制肽發(fā)酵乳為目標(biāo)，使用響應(yīng)面法對高產(chǎn)ACE 抑制肽發(fā)酵乳的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究了Lb.plantarumM11 和酪蛋白酸鈉的添加對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味特性的影響，為生產(chǎn)富含ACE 抑制肽的功能性發(fā)酵乳提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂乳粉、酪蛋白酸鈉（CS）新西蘭恒天然有限公司；發(fā)酵劑YO-MIX 883（含有嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）丹麥Danisco 公司；Lb.plantarumM11 分離來自新鮮無抗牛乳并保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE（來自兔肺，酶活0.1 UN） 源葉生物科技（上海）有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

UV-1500C 紫外-可見分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；TA.XT plus 質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS 公司；SA-402B 型電子舌 日本INSENT 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵乳的制作工藝 12%的脫脂乳中加入8%白砂糖，充分混勻后分裝，于95 ℃條件下滅菌15 min 后冷卻至43 ℃。在超凈工作臺內(nèi)接入發(fā)酵劑發(fā)酵至凝乳，然后在4 ℃條件下后熟12 h 備用[25]。

1.2.2 發(fā)酵乳ACE 抑制活性的測定 取5 mL 發(fā)酵乳樣品，用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCl 溶液將樣品pH 調(diào)至3.5，在4 ℃條件下以8000 r/min 離心15 min，取上清液調(diào)節(jié)pH 至8.3，再離心20 min，收集上清液備用。參考Roy 等[26]所述的方法測定發(fā)酵乳的ACE 抑制活性。按表1 順序依次加入HCl 溶液（1 mol/L）、HHL（5 mmol/L）、樣品、ACE（0.1 U/mL）、HCl 溶液（1 mol/L）以及硼酸緩沖液。然后向每組中加入1.7 mL 乙酸乙酯，振蕩搖勻，于3000 r/min 離心10 min。離心結(jié)束后吸取上層乙酸乙酯置于120 ℃恒溫箱中烘干，待溫度降低到室溫之后加入3 倍體積的蒸餾水，混勻之后在228 nm下測定溶液的吸光值。

表1 ACE 抑制率的測定方法Table 1 Detection methods of ACE inhibition

ACE 抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A、B、C 分別為A 組、B 組和C 組在228 nm處的OD 值。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 參考1.2.1 中所述方法制備發(fā)酵乳。在接種量1×107CFU/mL、發(fā)酵溫度42 ℃的條件下，考察Lb.plantarumM11 和發(fā)酵劑YO-MIX 883 加入比例為0:1、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 和1:0時(shí)發(fā)酵乳的ACE 抑制活性；在Lb.plantarumM11和發(fā)酵劑YO-MIX 883 接種比例為2:1、發(fā)酵溫度42 ℃的條件下，考察菌株總接種量為0.5×107、1×107、1.5×107、2×107、2.5×107CFU/mL 時(shí)發(fā)酵乳的ACE 抑制活性；在Lb.plantarumM11 和發(fā)酵劑YO-MIX 883 接種比例為2:1、菌株總接種量為1×107CFU/mL 的條件下，考察發(fā)酵溫度為35、37、39、42、45 ℃時(shí)發(fā)酵乳的ACE 抑制活性；在Lb.plantarumM11 和發(fā)酵劑YO-MIX 883 接種比例為2:1、菌株總接種量為1×107CFU/mL、發(fā)酵溫度42 ℃的條件下，考察添加0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇酪蛋白酸鈉添加量、Lb.plantarumM11 和發(fā)酵劑YO-MIX883 的接種量以及發(fā)酵溫度作為考察因素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。以ACE 抑制率（%）作為響應(yīng)值，使用Design Expert V8.0.6 建立模型，以獲得生產(chǎn)高產(chǎn)ACE 抑制肽發(fā)酵乳的最佳工藝條件。具體試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels for response surface test

1.2.5Lb.plantarumM11 和酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味特性的影響

1.2.5.1 實(shí)驗(yàn)分組和處理 制備四組不同的發(fā)酵乳，以進(jìn)一步探究Lb.plantarumM11 和酪蛋白酸鈉的強(qiáng)化對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味特性的影響。各組發(fā)酵乳發(fā)酵劑YO-MIX 883、Lb.plantarumM11 的接種量以及酪蛋白酸鈉添加量見表3。

表3 各組發(fā)酵乳發(fā)酵劑YO-MIX 883、Lb.plantarum M11 的接種量以及酪蛋白酸鈉添加量Table 3 inoculation quantity of YO-MIX 883,Lactobacillus plantarum M11 and additional quantity of sodium caseinate in each group

1.2.5.2 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性的測定 使用TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀對發(fā)酵乳貯藏期的質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行測定。將裝有50 mL 發(fā)酵乳的發(fā)酵杯置于檢測臺中心，用A/BE-d35（盤徑35 mm）探頭測定發(fā)酵乳的硬度、稠度、粘聚性和粘性指數(shù)[27]。

1.2.5.3 電子舌對滋味的測定 使用電子舌測定發(fā)酵乳的滋味。電子舌配有5 根脂質(zhì)膜傳感器（AAE、CA0、CT0、C00、AE1）分別負(fù)責(zé)鮮味、咸味、酸味、苦味和澀味的測定。準(zhǔn)確稱量20 mL發(fā)酵乳樣品，加入三倍體積的去離子水進(jìn)行稀釋，然后置于電子舌樣品上的品嘗杯中進(jìn)行測定[28]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用IBM SPSS 25 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用GraphPad Prism 9 和Origin 2018 進(jìn)行繪圖；使用Design Expert V8.0.6 分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1Lb.plantarumM11 和發(fā)酵劑YO-MIX 883 接種比例對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響 如圖1 所示，隨著Lb.plantarumM11 與發(fā)酵劑YO-MIX 883的接種比例由0:1 上升至2:1，發(fā)酵乳的ACE 抑制活性呈現(xiàn)上升趨勢。但當(dāng)Lb.plantarumM11 與發(fā)酵劑YO-MIX 883 的接種比例繼續(xù)增大時(shí)，發(fā)酵乳的ACE 抑制活性降低，這可能是由于發(fā)酵劑含量過低，Lb.plantarumM11、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌之間無法形成良好的協(xié)同作用，蛋白水解度降低，ACE 抑制肽含量減少。相比單獨(dú)使用發(fā)酵劑YOMIX 883 進(jìn)行發(fā)酵（即Lb.plantarumM11 與發(fā)酵劑YO-MIX 883 接種比例為0:1 時(shí)），添加附屬發(fā)酵劑Lb.plantarumM11 的組別ACE 抑制活性都提高了，這是因?yàn)楦綄侔l(fā)酵劑菌株的添加能夠改變發(fā)酵乳的肽譜，促進(jìn)ACE 抑制肽釋放[29-30]。Moslehishad 等[31]研究證明，使用鼠李糖乳桿菌作為附屬發(fā)酵劑可以促進(jìn)發(fā)酵乳中生物活性肽的釋放，提高發(fā)酵乳的ACE抑制活性，這與本研究所獲結(jié)果相似。綜上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中Lb.plantarumM11 和YO-MIX 883 接種比例確定為2:1。

圖1 Lb.plantarum M11 與發(fā)酵劑YO-MIX 883 的接種比例對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.1 Effect of inoculation ratio of Lb.plantarum M11 and YO-MIX 883 on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.1.2 菌株接種量對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響 如圖2 所示，隨著接種量由0.5×107CFU/mL 升高到1.5×107CFU/mL，發(fā)酵乳的ACE 抑制活性逐漸增強(qiáng)（P<0.05）。當(dāng)接種量達(dá)到1.5×107CFU/mL 時(shí)，發(fā)酵乳具有最強(qiáng)的ACE 抑制活性，但當(dāng)接種量進(jìn)一步提高時(shí)，發(fā)酵乳的ACE 抑制活性反而下降。這可能是由于隨著接種量的上升，菌株在相同時(shí)間內(nèi)生長速度更快，產(chǎn)肽更多。但當(dāng)接種量過大時(shí)，菌體產(chǎn)酸過快，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)所需時(shí)間過短，從而抑制了ACE 抑制肽的產(chǎn)生[32]。綜上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中菌株接種量取值范圍為1×107～2×107CFU/mL。

圖2 菌株接種量對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.2 Effect of inoculation quantity on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.1.3 發(fā)酵溫度對ACE 抑制活性的影響 如圖3所示，發(fā)酵溫度的改變對發(fā)酵乳的ACE 抑制率有著明顯影響，即每組之間都呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。當(dāng)發(fā)酵溫度從35 ℃升高到39 ℃時(shí)，發(fā)酵乳的ACE抑制活性逐漸升高，在39 ℃達(dá)到最大值。但隨著溫度進(jìn)一步升高，發(fā)酵乳的ACE 抑制活性呈現(xiàn)下降趨勢。這是因?yàn)殡S著溫度的升高，菌株生長代謝速度變快，使蛋白水解度上升，產(chǎn)肽量升高；而當(dāng)溫度超過菌株最適生長溫度時(shí)，菌株的生長受到高溫環(huán)境影響，產(chǎn)肽降低[32]。綜上，較高或較低的溫度都會降低發(fā)酵乳的ACE 抑制活性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵溫度的取值范圍應(yīng)為37～42 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.1.4 酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響 如圖4 所示，當(dāng)酪蛋白酸鈉的含量從0%上升至2%時(shí)，發(fā)酵乳的ACE 抑制活性呈現(xiàn)上升趨勢。相比于不添加酪蛋白酸鈉的組別，酪蛋白酸鈉添加量為2%的發(fā)酵乳的ACE 抑制活性顯著增強(qiáng)（P<0.05）。當(dāng)酪蛋白酸鈉添加量繼續(xù)增加至2.5%時(shí)，其ACE抑制活性開始下降，但下降趨勢不顯著（P>0.05）。這一結(jié)果與Giacomettei 等[33]的研究結(jié)果一致，即發(fā)酵乳的ACE 抑制活性會隨著蛋白濃度的上升而增加，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度達(dá)到一定閾值后，ACE 抑制活性不會繼續(xù)上升，MALDI-TOF-MS 分析證實(shí)蛋白含量的增加在一定程度上可以提高肽的含量，從而起到提高ACE 抑制活性的作用。綜上，為了獲得ACE 抑制活性最強(qiáng)的發(fā)酵乳，酪蛋白酸鈉添加量應(yīng)該控制在1.5%～2.5%。

圖4 酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳ACE 抑制活性的影響Fig.4 Effect of sodium caseinate on ACE inhibitory activity of fermented milk

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇ACE 抑制率作為響應(yīng)值，酪蛋白酸鈉添加量（A）、接種量（B）以及發(fā)酵溫度（C）作為變量，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface test

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 對表4 結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，建立高產(chǎn)ACE 抑制肽發(fā)酵乳發(fā)酵工藝的回歸模型。最終獲得的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：Y=84.40+0.25A+0.68B+3.16C-0.83AB-0.27AC-0.030BC-4.12A2-1.65B2-6.38C2。

二次多項(xiàng)回歸模型的各因素方差分析結(jié)果見表5?；貧w模型P值為0.0003，表現(xiàn)為極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.9901，表現(xiàn)為不顯著，說明其他因素對該試驗(yàn)結(jié)果影響很小，回歸方程擬合效果較好，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案合理可靠，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。決定系數(shù)R2為0.9624，校正決定系數(shù)R2Adj為0.9141，兩者數(shù)值相近，說明該模型可以解釋絕大部份的響應(yīng)值變化，可以用于優(yōu)化高產(chǎn)ACE 抑制肽發(fā)酵乳的生產(chǎn)工藝。變異系數(shù)CV 為1.70%，遠(yuǎn)小于10%，表明該試驗(yàn)結(jié)果的可信度和精確度較好。二次多項(xiàng)回歸模型中的二次項(xiàng)C、A2、C2對模型影響極顯著，B2對模型影響顯著，各因素對發(fā)酵乳ACE 抑制率的影響從大到小依次為C（發(fā)酵溫度）>B（接種量）>A（酪蛋白酸鈉添加量）。

表5 二次多項(xiàng)回歸模型的各因素方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of various factors of the second multiple regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互分析 各因素交互作用的響應(yīng)面3D 圖見圖5。三因素之間的交互作用響應(yīng)面3D 圖都表現(xiàn)為開口向下的曲面，曲面最高點(diǎn)即為試驗(yàn)最終所求的最優(yōu)工藝條件。圖5a 為接種量和酪蛋白酸鈉添加量之間的交互作用結(jié)果，當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，隨著接種量和酪蛋白酸鈉添加量的增加，發(fā)酵乳ACE 抑制率先升高后降低，響應(yīng)面曲面連續(xù)，存在峰值。圖5b 為發(fā)酵溫度和酪蛋白酸鈉添加量之間的交互作用結(jié)果，兩個(gè)因素的交互作用存在明顯峰值，發(fā)酵乳的ACE 抑制率在曲面最高點(diǎn)達(dá)到最大值。圖5c 為發(fā)酵溫度和接種量之間的交互作用結(jié)果，發(fā)酵溫度對ACE 抑制率的影響明顯強(qiáng)于接種量，與表3中顯著性檢驗(yàn)結(jié)果相吻合，發(fā)酵乳的ACE 抑制率隨著發(fā)酵溫度的升高先上升后下降，在所選范圍內(nèi)存在峰值。

圖5 酪蛋白酸鈉添加量、菌株接種量以及發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳ACE 抑制率影響的響應(yīng)面3D 圖Fig.5 Response surface 3D plot of the effects of sodium caseinate addition,inoculation quantity and fermentation temperature on ACE inhibition rate of fermented milk

2.2.4 發(fā)酵乳ACE 抑制率最優(yōu)值的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)響應(yīng)面交互分析經(jīng)過預(yù)測，當(dāng)酪蛋白酸鈉添加量為2%，接種量為1.60×107CFU/mL，發(fā)酵溫度為40.12 ℃時(shí)，發(fā)酵乳具有最高的ACE 抑制率，在此條件下模型預(yù)測發(fā)酵乳ACE 抑制率可以達(dá)到84.87%。考慮到試驗(yàn)操作的可行性，修正發(fā)酵工藝為酪蛋白酸鈉添加量2%、接種量1.5×107CFU/mL，發(fā)酵溫度40 ℃。在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果，其ACE 抑制率穩(wěn)定在83.15%，與預(yù)測值較為接近，說明該模型可以準(zhǔn)確地預(yù)測酪蛋白酸鈉添加量、菌株接種量以及發(fā)酵溫度對發(fā)酵乳ACE 抑制率的影響效果。

2.3 Lb.plantarum M11 和酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)性質(zhì)和風(fēng)味特性的影響

2.3.1 發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性 發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性是評價(jià)發(fā)酵乳品質(zhì)的重要因素，主要包括硬度、稠度、粘聚性以及粘性指數(shù)四個(gè)方面。四組發(fā)酵乳在貯藏期間的質(zhì)構(gòu)特性測試結(jié)果見表6。

表6 發(fā)酵乳在貯藏期的質(zhì)構(gòu)特性Table 6 Texture characteristics of fermented milk during storage

硬度代表探頭在下壓過程中達(dá)到最大深度所需要的力。四組發(fā)酵乳中，883+M11 組具有最低的硬度值。添加酪蛋白酸鈉后發(fā)酵乳的硬度顯著增大（P<0.05），且883+M11-CS 組的硬度比883-CS 組更大（P<0.05）。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)濃度越高，發(fā)酵乳形成的凝膠強(qiáng)度越大，硬度提高。在貯藏期間，四組發(fā)酵乳的硬度都呈現(xiàn)上升趨勢，在第28 d 達(dá)到最大值。

稠度代表力與時(shí)間之間形成的峰面積，反映了發(fā)酵乳的流動能力[34]。883+M11-CS 組的稠度顯著高于其他三組（P<0.05），說明該組發(fā)酵乳內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)排列更為緊密，穩(wěn)定性更高[35]。883+M11 組和883-CS 組的稠度都顯著高于883 組（P<0.05），說明酪蛋白酸鈉和Lb.plantarumM11 都可以提高發(fā)酵乳的稠度。王鑫磊等[18]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，這可能是附屬發(fā)酵劑的添加生成了更多的胞外多糖，這些胞外多糖與蛋白質(zhì)基質(zhì)之間發(fā)生靜電相互作用，使發(fā)酵乳膠著性增加，稠度上升。在貯藏期間，883 組和883+M11 組的稠度都呈現(xiàn)下降趨勢，而添加酪蛋白酸鈉的883-CS 組和883+M11-CS 組稠度變化趨勢不明顯。

粘聚性代表樣品的內(nèi)部粘合力，為負(fù)向最大力。883+M11-CS 組的粘聚性顯著高于其他三組（P<0.05），883+M11 組與883 組之間的粘聚性差異不顯著（P>0.05），但883-CS 組與883 組之間呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），這說明酪蛋白酸鈉對發(fā)酵乳的粘聚性存在明顯的影響，這可能是在酸化過程中，酪蛋白顆粒附著在簇和鏈結(jié)構(gòu)上，從而形成由酪蛋白簇和鏈組成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[36]，使發(fā)酵乳內(nèi)部環(huán)境更完整緊密。發(fā)酵乳在貯藏期間的粘聚性指標(biāo)總體呈現(xiàn)上升趨勢，但這種趨勢在貯藏期第1～7 d 內(nèi)表現(xiàn)不顯著（P>0.05）。

粘性指數(shù)代表力與時(shí)間之間形成的負(fù)峰面積，即發(fā)酵乳對返還探頭的粘著力。883+M11-CS 組的粘性指數(shù)要顯著高于其他組（P<0.05），883+M11 組和883-CS 組的粘性指數(shù)都顯著高于883 組（P<0.05）。這說明酪蛋白酸鈉和Lb.plantarumM11 的添加都提高了發(fā)酵乳的凝膠特性，且二者具有協(xié)同作用。在貯藏期間，883 組和883-CS 組的粘度指數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，而883+M11 組和883+M11-CS 組的變化趨勢不明顯。

2.3.2 發(fā)酵乳滋味的測定 電子舌是一種通過模擬人體味覺系統(tǒng)對樣品滋味進(jìn)行測定的設(shè)備。與感官評價(jià)相比，電子舌獲得的信息更加客觀，且具有重復(fù)性[37]。由滋味雷達(dá)圖6 可知，四組發(fā)酵乳之間的酸味差異最為明顯，附屬發(fā)酵劑Lb.plantarumM11 會增加發(fā)酵乳的酸味，而添加酪蛋白酸鈉的883-CS 組和883+M11-CS 組酸味弱于883 組。此外Lb.plantarumM11 還可以增加發(fā)酵乳滋味的豐富性，這一結(jié)果與Lesme 等[38]研究結(jié)果一致，即附屬發(fā)酵劑的使用可以提高發(fā)酵乳滋味的豐富性。四組發(fā)酵乳之間的咸味、苦味、澀味、澀味回味、苦味回味以及鮮味差異均不明顯。滋味的主成分分析如圖7 所示，PC1 貢獻(xiàn)率為88.0%，PC2 貢獻(xiàn)率為9.4%，總貢獻(xiàn)率為97.4%，說明該分析可以解釋絕大部分的發(fā)酵乳滋味信息，PC1 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于PC2，說明樣品在X 軸方向距離越大，差異性越大。883 組和883+M11 組位于X 軸正半軸，與豐富性、鮮味、酸味和苦味呈正相關(guān)；而883-CS 組和883+M11-CS 組位于X 軸負(fù)半軸，與咸味、澀味、澀味回味和苦味回味呈正相關(guān)。此外，883+M11-CS 組與883 組在X 軸方向上距離較近，說明它們整體滋味相似。

圖6 發(fā)酵乳的滋味雷達(dá)圖Fig.6 Taste radar of fermented milk

圖7 滋味的主成分分析Fig.7 Principal component analysis of taste

3 結(jié)論

發(fā)酵乳制品是生物活性肽的重要來源，生產(chǎn)研發(fā)具有心腦血管保健功能的發(fā)酵乳制品具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和前景[39]。本研究通過對原料乳進(jìn)行酪蛋白強(qiáng)化，并使用Lb.plantarumM11 作為附屬發(fā)酵劑，提高了發(fā)酵乳的ACE 抑制活性。結(jié)果表明，酪蛋白酸鈉的使用和附屬發(fā)酵劑Lb.plantarumM11的添加都可以顯著提高發(fā)酵乳的ACE 抑制活性，當(dāng)酪蛋白酸鈉添加量為2%、接種量為1.5×107CFU/mL，發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，發(fā)酵乳具有最強(qiáng)的ACE 抑制活性，在此條件下其ACE 抑制率為83.15%。此外，酪蛋白酸鈉和Lb.plantarumM11 的添加可以改善發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性，增強(qiáng)發(fā)酵乳的硬度、稠度、粘聚性和粘度指數(shù)，能夠在對風(fēng)味無不良影響的基礎(chǔ)上，滿足消費(fèi)者對飲食健康的追求。但生物活性肽只有經(jīng)過腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)后才能發(fā)揮其生物活性，胃腸道消化可能會對肽段產(chǎn)生巨大影響，導(dǎo)致生物活性發(fā)生改變。因此未來還需要進(jìn)一步對發(fā)酵乳中的肽譜進(jìn)行分析，驗(yàn)證其在體內(nèi)的作用效果和降血壓機(jī)制，發(fā)掘其健康功效和應(yīng)用價(jià)值。