許瓊耀，王 娟，廖 寧，劉冠聞，李穎慧，尚欣哲，蓋逸萱，王聰聰，師俊玲

（西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西西安 710072）

大量結(jié)果表明，乳酸菌與人和動物的健康息息相關(guān)[1]。很多乳酸菌已經(jīng)被批準用于食品加工。我國規(guī)定的《可用于食品的菌種名單》中（如表1 所示）有雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）7 種、乳桿菌屬（Lactobacillus）8 種、鏈球菌屬（Streptococcus）1 種、乳酪桿菌屬（Lacticaseibacillus）3 種、粘液乳酪桿菌屬（Limosilactobacillus）2 種、乳植桿菌屬（Lactiplantibacillus）1 種、聯(lián)合乳桿菌屬（Ligilactobacillus）1 種、廣布乳桿菌屬（Latilactobacillus）2 種、乳球菌屬（Lactococcus）3 種、丙酸桿菌屬（Propionibacterium）1 種、丙酸菌屬（Acidipropionibacterium）1 種、明串珠菌屬（Leuconostoc）1 種、片球菌屬（Pediococcus）2 種、魏茨曼氏菌屬（Weizmannia）1 種、動物球菌屬（Mammaliicoccus）1 種、葡萄球菌屬（Staphylococcus）2 種、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）1 種。食品加工中常用乳酸菌有乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）[2]。

表1 可用于食品的菌種名單Table 1 List of bacteria that can be used in food

大量研究證明，攝入活性乳酸菌具有改善腸道微生態(tài)、提高食物利用率、緩解便秘、降低膽固醇水平、提高機體免疫力等多種功效[3]（如圖1 所示）。除了產(chǎn)生乳酸、乙酸等抗菌活性物質(zhì)抑制和殺死過度繁殖的有害菌外，乳酸菌還能定殖在腸黏膜上，通過與致病菌競爭腸道上的黏附位點和營養(yǎng)物而抑制致病菌感染，調(diào)節(jié)腸道菌群[4-5]，并且通過產(chǎn)生多種酶類促進機體的營養(yǎng)消化和吸收[6]。市場上的乳酸菌產(chǎn)品也越來越多地得到消費者的認可。

圖1 乳酸菌對人體的益生作用Fig.1 Probiotic effects of lactic acid bacteria on human

然而，受菌種厭氧和熱敏感性的影響，很多乳酸菌產(chǎn)品在經(jīng)歷加熱和暴露于氧氣等加工條件時，活性下降，導(dǎo)致產(chǎn)品中活菌數(shù)不足，進入體內(nèi)后由于胃酸和小腸中膽汁的存在導(dǎo)致乳酸菌活性更低，嚴重影響產(chǎn)品功效。雖然人們已經(jīng)在提高乳酸菌加工活性和體內(nèi)活性方面進行了大量研究，并開發(fā)了一些新技術(shù)，但每種方法各有利弊和局限性，需要擇優(yōu)使用。然而，這些研究結(jié)果并未得到系統(tǒng)的總結(jié)和對比。為此，本文總結(jié)和對比了現(xiàn)有技術(shù)對乳酸菌耐熱性、耐氧性、腸道存活性等的影響和作用效果，以期為相關(guān)研究和已有技術(shù)的選擇與應(yīng)用提供參考。

1 提高乳酸菌耐熱性的策略與技術(shù)

溫度是影響乳酸菌活性的重要因素之一。大多數(shù)乳酸菌的最適生長溫度為37～43 ℃[7]。溫度過高會抑制菌體生長和活性，甚至導(dǎo)致菌體死亡。為了避免這種不利影響，絕大多數(shù)市售活性乳酸菌產(chǎn)品均經(jīng)冷凍干燥而成。雖然效果良好，但時間長、能耗高、成本大。相比之下，噴霧干燥法則有干燥速度高、時間短、過程簡單、適于連續(xù)生產(chǎn)、節(jié)能高效等優(yōu)點[8]，但是存在菌體不耐高溫和氧脅迫，菌體死亡率高等問題。加熱對乳酸菌活性的影響在兩個方面：一是導(dǎo)致菌體死亡；二是導(dǎo)致細胞失水，活性降低。提高菌體的耐熱性，可使乳酸菌產(chǎn)品的生產(chǎn)和儲藏擺脫低溫處理的限制，為產(chǎn)品生產(chǎn)和貯藏提供了極大便利。

1.1 干燥時加入保護劑

雖然一些嗜酸乳桿菌能夠在高達45 ℃的溫度下生長，但是超過45～50 ℃的加熱處理并不利于細胞的存活[9]。添加保護劑和縮短加熱時間能夠有效減少乳酸菌經(jīng)噴霧干燥的活性損失[10]。表2 總結(jié)了目前已報道的乳酸菌噴霧干燥用保護劑，主要有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸及其鹽類等三大類。其中，多糖被認為是性能最佳的凍干保護劑，能夠通過取代水形成氫鍵，或者使細胞形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)的方式減小細胞的冷凍損傷[11]；蛋白質(zhì)類則通過作用于細胞膜而發(fā)揮凍干保護劑的作用[12]；氨基酸及其鹽類是通過讓細胞提前適應(yīng)高滲透環(huán)境來減小凍干過程失水形成的高滲透壓損失；磷酸鹽緩沖溶液還可以通過穩(wěn)定pH 來保護細胞免受凍干損傷[13]。這些保護劑能夠通過不同的作用機制減少乳酸菌在干燥過程中的活性損失，在一定程度上提高終產(chǎn)品中菌體存活率。

表2 乳酸菌噴霧干燥過程中常用的保護劑Table 2 Protective agents commonly used in the spray drying process of lactic acid bacteria

1.2 微膠囊包埋

為了提高乳酸菌在噴霧干燥過程中的活性，已經(jīng)開發(fā)了多項處理技術(shù)，其中以微膠囊包埋技術(shù)的效果較佳，但其作用效果與所用包埋劑有關(guān)。例如，單獨用甜乳清來包埋雙歧桿菌BB-12，可使噴霧干燥后產(chǎn)品在60 ℃高溫處理5 min 后仍然含有8.31 lg CFU/g的活性乳酸菌，而未包埋處理的產(chǎn)品在相同條件下處理后，活菌數(shù)僅有7.55 lg CFU/g；在甜乳清中混入菊粉用于菌體包埋，能夠進一步減少雙歧桿菌噴霧干燥和后期熱處理過程中的活性損失，使得產(chǎn)品的活菌數(shù)與游離菌體相比分別增加了0.49 和0.97 lg CFU/g[17]。Souza 等[18]用麥芽糊精和葡萄糖包埋鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳植桿菌等三種益生菌，再經(jīng)噴霧干燥后，產(chǎn)品中活細胞數(shù)量減少了2 個對數(shù)單位，但活菌數(shù)依然高于益生菌食品相關(guān)規(guī)定（106CFU/g）。對比上述結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)用甜乳清或其與菊粉混合物為包埋劑，比用麥芽糊精和葡萄糖作包埋劑對乳酸菌在噴霧干燥過程中的保護作用更佳，并以用甜乳清和菊粉混合使用時的效果最佳。

1.3 菌體預(yù)處理

脅迫環(huán)境能誘導(dǎo)微生物中多種脅迫相關(guān)基因的表達，提高菌體的環(huán)境適應(yīng)能力[19]。如圖2 所示，高溫脅迫會誘導(dǎo)乳酸菌產(chǎn)生熱應(yīng)激[20]，通過產(chǎn)生短暫表達的熱休克蛋白抵御外界環(huán)境的不利影響，或者通過改變細胞組成和結(jié)構(gòu)，增強菌體對高溫環(huán)境的適應(yīng)能力[21]。這些蛋白有分子伴侶GroEL、DnaK、小熱休克蛋白和 Clp ATP 酶（一種降解受損蛋白質(zhì)的酶）等。它們能夠幫助細胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)的重新折疊，維持細胞的正常活性[22]（如圖2 所示）。然而，過高的溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和聚集，改變細胞中RNA 等生物大分子的穩(wěn)定性和膜的流動性，導(dǎo)致細胞死亡[23]。

圖2 乳酸菌的熱應(yīng)激反應(yīng)Fig.2 Heat stress response of lactic acid bacteria

根據(jù)相關(guān)報道，乳酸菌產(chǎn)生的熱激蛋白主要有DnaK、DnaJ、HrcA、GroES、GroEL、Hsp84、Hsp85、Hsp100、C1p、HtrA 和FtsH 等[24]。其中，通過熱誘導(dǎo)使乳酸菌產(chǎn)生DnaK、DnaJ、HrcA 等熱激蛋白已經(jīng)被用于提高乳酸菌對高溫環(huán)境的抵抗能力，從而提高產(chǎn)品中活菌數(shù)[25]。Paéz 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，干燥前熱處理（52 ℃,15 min）可以顯著提高L.caseiNad 和L.plantarum8329 在干燥過程和儲存期的存活率。

研究表明，干燥前使用熱適應(yīng)處理能夠顯著提高乳酸菌的加工耐熱性，降低乳酸菌的加工致死率，且其效果與預(yù)處理方法有關(guān)（表3）。例如，Shin 等[27]發(fā)現(xiàn)，在干燥前，先將屎腸球菌HL7 在52 ℃下處理15 min，可以降低細胞膜中不飽和脂肪酸的比率，使得噴霧干燥后，菌體的存活率提高了103～105 倍；Sonia等[28]研究發(fā)現(xiàn)，將嗜酸乳桿菌NCFM 在53 ℃下保持20 min 后，可使菌體在65 ℃下存活率從0.003%提高到0.5%，提高了約166 倍；Zhang 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，用0.5 mmol/L的H2O2在37 ℃下預(yù)處理2 h 再進行噴霧干燥處理，可將鼠李糖乳桿菌1301 的存活率從3.7 logCFU/g 增加到7.8 logCFU/g，提高了約150 倍；Chen 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，將馬乳酒樣乳桿菌M1 在37 ℃下處理1 h 后再進行噴霧干燥加工，可使菌體的存活率從0.004%提高到0.21%，提高了52.5 倍。單從存活率的提高倍數(shù)來看，以Sonia 等[28]提出的在53 ℃下保持20 min 的提高幅度最大（166 倍）。然而，需要說明的是，不同研究中所用菌種本身的耐熱性，加工時的溫度、時間，以及提高幅度的計算方法等都會影響對比結(jié)果。而且，每種處理條件可能還會有菌種適用性的問題。因此，不能簡單地確定出究竟是哪種處理方法的效果最好。在實際應(yīng)用過程中，需要綜合考慮菌種特性，加工溫度和時間等多種因素進行對比實驗后再進行確定。

表3 熱適應(yīng)處理對乳酸菌存活率的影響Table 3 Effects of thermal adaptation treatment on the survival rate of lactic acid bacteria

1.4 靜電紡絲加工

靜電紡絲是使用電場扭曲，將溶液從注射器中壓出，產(chǎn)生長而薄的聚合物（如圖3 所示）。整個裝置主要由高壓電源、噴絲頭（例如移液器吸頭）和接地收集板（通常是金屬篩或板）組成。使用時，利用高壓源將一定極性的電荷注入聚合物溶液或熔體中，然后將其加速到相反極性的收集器中[31]。電荷間強相互排斥力能夠克服聚合物液體的表面張力，從而利于成絲[32]。通過靜電紡絲幾乎可以將所有能夠成膜的聚合物制備成纖維[33]。

圖3 靜電紡絲裝置及紡絲纖維載菌示意圖[30]Fig.3 Schematic diagram of electrostatic spinning device and spinning fiber carrying bacteria[30]

將干燥或活性微生物，以及活性成分混合到聚乙烯醇或其與其他材料（例如海藻酸鹽）的混合液中，就可以使其嵌入聚合物纖維中，對菌體和活性成分起到一種包封作用。近年來，靜電紡絲已經(jīng)被用于魚油、茶多酚和葉酸等一些生物活性物質(zhì)的包封，制成納米纖維。所得產(chǎn)品具有生物相容性好、生物可降解性、比表面積大、孔隙率高、產(chǎn)品穩(wěn)定性好，適用于包埋熱敏性物質(zhì)等優(yōu)點[31]。

近年來，人們也開始嘗試將靜電紡絲技術(shù)用于乳酸菌加工。Amparo 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，以濃縮乳清和普魯蘭多糖為基質(zhì)，通過靜電紡絲技術(shù)制備成的動物雙歧桿菌乳亞種Bb12 制劑能夠在20 ℃以下存活40 d，而且菌體的存活率是對照組的2 倍，有效地提高了菌體在貯藏過程中耐熱性或者熱穩(wěn)定性。同時，顯微觀察顯示，菌體在這種體系中被絲狀物所包封。Feng 等[35]用聚乙烯醇/低聚果糖靜電紡絲技術(shù)對植物乳桿菌進行了包封，發(fā)現(xiàn)未包封的菌體在70 ℃水浴處理30 min 后完全失活，而包封的產(chǎn)品在這種條件下的活菌數(shù)只降低了0.04～2.71 CFU/mL，有效地提高了菌體的耐熱性。這些結(jié)果說明，靜電紡絲能夠顯著提升乳酸菌貯藏和加工過程中的熱穩(wěn)定性。此外，可溶性膳食纖維也被用于制備嗜酸乳桿菌的靜電紡絲。

此外，乳清、普魯蘭多糖、聚乙烯醇/低聚果糖、可溶性膳食纖維等物質(zhì)均可以形成良好的靜電紡絲產(chǎn)品。一些新型的材料，如農(nóng)業(yè)廢棄物的納米纖維[36]、多層PLGA-普魯蘭-PLGA[30]也被用于益生菌的包封或者靜電紡絲處理。

2 提高乳酸菌氧氣耐受性的策略與技術(shù)

部分嚴格厭氧型乳酸菌，如雙歧桿菌在氧氣存在時會在細菌胞內(nèi)形成O2-·、·OH 等自由基或H2O2等強氧化性產(chǎn)物[37]，但菌體本身缺少有效的活性氧清除機制，從而導(dǎo)致DNA 和蛋白質(zhì)等分子的氧化損傷，甚至導(dǎo)致細胞死亡[38]。為此，提高乳酸菌的耐氧性能是十分必要的。然而，與菌體耐熱性能提高策略研究相比，有關(guān)乳酸菌耐氧性能提高技術(shù)的研究較少。目前已報道的方法主要有以下幾種。

2.1 使用含羥基化合物

在理論上，含羥基化合物上的羥基能夠與乳清蛋白上的極性基團發(fā)生相互作用，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，減少菌體細胞在冷凍干燥過程中由冰晶形成導(dǎo)致的細胞膜破裂和氧化應(yīng)激而損傷細胞的程度[39]。Chen等[40]發(fā)現(xiàn)，在含有乳清蛋白的菌懸液中加入二糖和甘油等含羥基化合物能使微囊化乳酸菌的細胞存活率提高到62.1%，使得干燥產(chǎn)品中保加利亞乳桿菌的活細胞數(shù)達到約8.6 lg CFU/g，表現(xiàn)出很好的保護效果。這里使用的二糖和甘油都屬于含羥基化合物。這一結(jié)果說明，這些物質(zhì)與乳清蛋白間的相互作用的確能夠在一定程度上緩解凍干過程對乳酸菌的損傷。雖然其內(nèi)在機理并不明晰，但是這些顯著的作用效果為高活性乳酸菌制劑的生產(chǎn)技術(shù)改良提供了實踐依據(jù)。

2.2 使用氧氣清除劑或厭氧霧化介質(zhì)

在噴霧干燥法制備乳酸菌產(chǎn)品的過程中，使用氧氣清除劑或厭氧霧化介質(zhì)可以在霧化和干燥過程中創(chuàng)造低氧環(huán)境，從而緩解氧氣對乳酸菌的損傷作用。Ghandi 等[41]通過研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus.lactissubsp.cremoris）ASCC930119的菌懸液中加入抗壞血酸等除氧劑和/或厭氧霧化介質(zhì)（如氮氣），以及改變噴霧條件等策略，可以將噴霧干燥過程中的細菌存活率由25.49%提高到48.97%，提高了23.48%。另外，噴霧干燥過程中的霧化階段是導(dǎo)致乳酸菌死亡的主要環(huán)節(jié)，這一階段的菌體死亡率可高達93%。因此，改善噴霧階段的條件如使用氧氣清除劑可以顯著提高乳酸菌產(chǎn)品的細菌存活率，從而改善產(chǎn)品的質(zhì)量。

2.3 使用特定培養(yǎng)基

Zhang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，使用不含蛋白胨的MRS培養(yǎng)基可以增強鼠李糖乳桿菌hsryfm 1301 的氧化應(yīng)激耐受性，使噴霧干燥后的菌體存活率從30%提高至75%，所得干菌粉在模擬胃腸液中的存活良好。但是，在無胰蛋白胨MRS 中補充苯丙氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、纈氨酸、組氨酸或色氨酸后，鼠李糖乳桿菌的氧化應(yīng)激耐受性急劇下降。由此說明，減少氨基酸的攝入是提高鼠李糖乳桿菌氧化應(yīng)激耐受性的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，在遇到熱應(yīng)激或氧化應(yīng)激時，乳酸菌可以通過下調(diào)氨基酸或ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸代謝和肽酶相關(guān)基因，降低細胞內(nèi)氨基酸濃度，從而提高菌體的熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激耐受性。這些研究結(jié)果說明，下調(diào)體內(nèi)氨基酸代謝和轉(zhuǎn)運是適應(yīng)熱和氧沖擊的自我適應(yīng)機制；培養(yǎng)基中過高的氨基酸會抑制這種作用，不利于菌體對熱和氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)。這也說明在提高菌體環(huán)境適應(yīng)性的研究中，應(yīng)該考慮和清楚菌體的適應(yīng)性代謝特點和內(nèi)在機制，才能開發(fā)出有針對性的有效措施。

3 乳酸菌的胃腸道耐受性提高技術(shù)

通常認為，胃部的高酸性和腸道中膽汁酸是威脅乳酸菌活性的重要因素，并以胃酸的損傷作用最為嚴重。因此，人們圍繞著如何提高乳酸菌的酸耐受性進行了大量研究，其中以微膠囊包埋法最為多見，并開發(fā)了一些新技術(shù)。下文將重點介紹近年來開發(fā)的撞擊氣溶膠法、乳滴法、靜電噴霧法。

3.1 撞擊氣溶膠法

撞擊氣溶膠法的操作過程如圖4 所示。用這種方法以海藻酸鈉包埋的乳酸菌，具有連續(xù)生產(chǎn)、產(chǎn)量高、產(chǎn)品粒徑小等特點[42]，生產(chǎn)直徑小于40 μm 的微珠[43]。Sohail 等[42]將這種方法用于制備嗜酸乳桿菌NCFM 和鼠李糖乳桿菌GG 的海藻酸鈉微珠，所得產(chǎn)品的粒徑為10～40 μm，其中的乳酸菌在酸和膽汁中的存活率提高了1.11 倍；而且，該方法對嗜酸乳桿菌NCFM 酸和膽汁耐受性的提升作用強于鼠李糖乳桿菌GG；同時乳酸菌產(chǎn)品的感官特性也有顯著提升。

圖4 撞擊氣溶膠技術(shù)示意圖Fig.4 Schematic diagram of impact aerosol technology

此外，用撞擊氣溶膠法封裝的乳酸菌存在酸化問題，即菌體在發(fā)酵過程中會代謝產(chǎn)生各種有機酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基中水解后的小分子物質(zhì)進一步降解，從而提高了該階段廢水的可生化性[44]。這可能是因為培養(yǎng)基中的糖分會通過聚合物涂層材料擴散至微膠囊內(nèi)的乳酸菌，進一步被代謝成有機酸[43]。在高酸和膽鹽條件下，用撞擊氣溶膠法制備的多孔狀乳酸菌海藻酸鈉大微膠囊（直徑約2 mm）和小微膠囊（10～40 μm）的作用效果相近[43]。因此，粒徑大小不是影響用這種方法所得產(chǎn)品中乳酸菌活性的主要因素，從而為加工工藝的變通和控制提供了便利。

3.2 乳滴法

乳滴是通過將一種液體分散到另一種不混溶的液體中形成的[45]。乳滴法用于菌體加工的原理是，基于不連續(xù)相和連續(xù)相之間的相互作用，在分散的液體中加入益生菌細胞使其封裝[46]。操作時，先將細胞分散在少量的水基聚合物懸浮液（分散相）中，隨后將其添加到大量的油/有機相（連續(xù)相）中，借助表面活性劑對混合物進行機械均質(zhì)化后形成油包水乳液。在這種方法中，當水溶性生物聚合物不溶時，就會在油相中形成凝膠珠，通過過濾或離心可得[47-48]。

在制藥和食品工業(yè)領(lǐng)域，乳滴技術(shù)可以被用于提高目標化合物的溶解度、生理活性和穩(wěn)定性[49]；常用包封材料有，阿拉伯膠、刺槐豆膠、海藻酸鹽、κ-角叉菜膠、醋酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素鈉、殼聚糖、麥芽糖糊精、乳清蛋白、鷹嘴豆蛋白、明膠、改性淀粉和脫脂奶粉（SMP）凝乳酶等[50]。

將乳滴法用于包封乳酸菌時，考慮到細菌細胞的親水特性，可用親水性膠體包封菌體[51]。在這種情況下，水膠體材料會在固化劑的作用下形成封裝劑。即，將含有微生物細胞和非離子化固化劑的水膠體溶液加入油包水乳液（W/O）的油連續(xù)相中，所用固化劑可將分散相液滴與連續(xù)相分離[52]；pH 變化導(dǎo)致固化劑電離，形成能夠從乳液連續(xù)相中分離的顆粒[53]。如果分散相是水相，則稱為油包水（W/O）乳劑，而相反的乳劑稱為水包油（O/W）乳劑或反相[54]。

Shu 等[55]以黃原膠和瓜爾豆膠為水相，以葵花籽油為脂相包封植物乳桿菌，顯著提高了菌體在酸奶中的存活率，表現(xiàn)為耐酸性提高。Huerta-Vera 等[56]用MRS 肉湯、葡萄油和乳清蛋白濃縮物三種以W1/O/W2形式包封鼠李糖乳桿菌LC705，所得產(chǎn)品是能夠在蔗糖高滲溶液中保持較高的存活率（>8 lg CFU/mL）。Wang 等[51]則用海藻酸鈉（W1）、大豆油（O）和纖維素溶液（W2）包封嗜酸乳桿菌AS 1.2686，顯著提高了菌體的14 d內(nèi)存活率，并在模擬胃腸道條件下保持84%的存活率；而游離菌體的活性則在相同條件下則會快速下降，30 min 內(nèi)由8 lg CFU/mL降至2 lg CFU/mL，至120 min 時完全死亡，尤其是在酸性條件（pH1.5）的對比效果更為明顯。此外，用海藻酸鹽和碳酸鈣分別作為包封劑和固化劑包封雙歧桿菌BB-12，提高了所得產(chǎn)品中菌體在模擬胃液和模擬腸液中存活率（未包封的雙歧桿菌在同樣條件下的死亡數(shù)量是包封菌的7.05 倍），以及25 ℃下60 d 時活菌數(shù)（7.88 lg CFU/mL）[57]；用果膠、菊粉和米糠的混合物通過乳滴法包封嗜酸乳桿菌LA-5，包封率達到90%，所得產(chǎn)品在模擬胃腸液中菌體存活率和25 ℃下儲存120 d 時存活率均得到顯著提高（分別提高了3.18 倍和2.38 倍）。同時發(fā)現(xiàn)，使用混合材料可以增加產(chǎn)品的粒徑[58]。但是，使用海藻酸鹽和乳清蛋白分離物的混合物包封嗜酸乳桿菌PTCC 1643，所得產(chǎn)品粒徑更?。?3～180 μm），適用于食品加工，并且將菌體在模擬胃腸液中的存活率提高了2.66 倍[59]。由此可見，通過使用乳滴法，可以用食品材料包封乳酸菌，提高菌體在模擬胃腸液中的存活率。

3.3 靜電噴霧法

靜電噴霧是一種液體霧化的方法，也稱為電流體動力霧化。其原理是，施加到毛細管中液滴上的電場能夠使液滴的界面變形，電荷在液滴內(nèi)部產(chǎn)生靜電力，該靜電力與液滴的表面張力競爭，形成泰勒錐；通過在毛細管上使用高壓產(chǎn)生的靜電力克服液滴的表面張力，將納米級的較小帶電液滴從初級液滴中噴射出來[60]。由于電荷的庫侖排斥力，液滴分散良好，在飛向收集器的過程中不會聚結(jié)，并以單錐形噴射模式最為理想。總體來講，靜電噴霧具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性好、方便快捷、經(jīng)濟高效、條件溫和、適應(yīng)性強等優(yōu)點[61]。靜電噴霧用設(shè)備如圖5 所示。

圖5 靜電噴霧裝置原理圖Fig.5 Schematic diagram of electrostatic spray device

Chaline 等[62]通過靜電噴霧技術(shù)，以海藻酸鈉或海藻酸鈉-檸檬酸果膠基質(zhì)為封裝劑，制備了植物乳植桿菌BL011 微膠囊；所得產(chǎn)品中植物乳植桿菌BL011在口服遞送和冷藏條件下的存活率均顯著高于游離菌體，在25 ℃下保持活力超過6 個月，在天然橙汁和模擬胃液和腸液中孵育120 min 時的菌體存活率也有顯著提高（從4.5 lg CFU/mL 提升到9 lg CFU/mL），使在不用冷鏈運輸?shù)氖称坊蝻嬃现屑尤胫参锶橹矖U菌成為可能。

綜上所述，已經(jīng)開發(fā)了一些能夠有效提高乳酸菌胃腸耐受性的新技術(shù)。然而，值得一提的是，這些研究結(jié)果多為體外評價結(jié)果，未見體內(nèi)應(yīng)用效果的實用價值評價。這一點還需要深入研究。此外，不同研究所用菌種和評價指標并不相同，難以進行直接對比。

3.4 植物多酚盔甲法

植物多酚是一類來源于植物的天然大分子化合物，結(jié)構(gòu)中含有兩個以上酚羥基和芳香環(huán)[63]，具有很好的抗氧化活性，主要用于食品行業(yè)，防止食物氧化，提高食品品質(zhì)[64-65]。最近研究發(fā)現(xiàn)，這些多酚類物質(zhì)能夠在菌體表面形成一層多孔狀納米盔甲（圖6），有效提高菌體的生物活性[66]，以及與抗生素之間通過多重作用，吸附益生菌周圍的抗生素，提高益生菌的抗生素耐受性[67]。值得一提的是，多酚類物質(zhì)這種保護作用能夠在益生菌分裂并突破這層保護殼后繼續(xù)發(fā)揮作用，可使凍干后盔甲化益生菌能夠在適當條件下快速復(fù)蘇。

圖6 乳酸菌的多酚納米盔甲Fig.6 Polyphenol nano armor of lactic acid bacteria

Luo 等[68]通過單寧酸和三價鐵離子的配位作用，在大腸桿菌Nissel 1917 表面形成一個多酚涂層，通過鄰苯三酚和兒茶酚等粘附性基團促使菌體在組織表面的有效定殖，使得菌體在小鼠腸道定殖量增加了近40 倍。將這種技術(shù)應(yīng)用于制備乳酸菌腸溶膠囊，使得即使在持續(xù)使用抗生素的情況下，乳酸菌仍能成功定殖于腹瀉大鼠的腸道，而且腸道定殖率也提高了45 倍；同時，這種多酚涂層還能發(fā)揮抗炎、抗氧化的協(xié)同作用效應(yīng)[69]，表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。如前所述，使用多酚類物質(zhì)還能有效提高乳酸菌在加工過程中的氧氣耐受力，提高產(chǎn)品中活菌數(shù)[70]。綜上，通過在菌體表面加載多酚涂層，不僅能夠提高乳酸菌在腸道中的定殖能力，還能發(fā)揮多酚本身功能的協(xié)同作用，并能通過抗氧化作用提高菌體對氧氣的耐受性。這種技術(shù)在制備乳酸菌腸溶膠囊和提高產(chǎn)品中活菌數(shù)方面表現(xiàn)出很好的應(yīng)用潛力，并在功能食品和藥品設(shè)計方面有著很好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論與展望

隨著人們對乳酸菌益生功效認識的不斷提升，乳酸菌產(chǎn)品的市場需求量不斷增大。為了進一步提高產(chǎn)品中活菌數(shù)，保護劑、微膠囊、預(yù)處理、靜電紡絲等方法已經(jīng)被開發(fā)出來以提高菌體的熱加工耐熱性；通過使用含羥基化合物、氧氣清除劑或厭氧霧化介質(zhì)，以及減少培養(yǎng)基中氨基酸含量，提高了乳酸菌加工過程的氧氣耐受性。上述方法有效地提高了乳酸菌在加工過程中的存活率，產(chǎn)品中活菌數(shù)，以及菌體在產(chǎn)品貯存過程中的存活率。但是，大多數(shù)研究結(jié)果是基于體外評價效果而得，尚需通過體內(nèi)實驗進一步驗證。

近年來，撞擊氣溶膠法、乳滴法、靜電噴霧法、植物多酚盔甲法等一些新技術(shù)在提高乳酸菌的胃腸環(huán)境耐受性和腸道定殖數(shù)量等方面表現(xiàn)出很好的應(yīng)用潛力。由于不同研究用菌種、處理環(huán)境、結(jié)果計算方式等方面的差異性，并不能準確地判斷出哪種方法最優(yōu)；同理，某篇文章中所得最優(yōu)方法也不一定適用于其它菌種和實驗中沒有考慮到的條件。實際應(yīng)用中仍需補充實驗進行對比選擇，而不宜不加判別地直接采用。近年來的研究結(jié)果和新技術(shù)有效地拓展了未來的研究思路和研究方向。相信隨著研究的不斷深入、舊技術(shù)的不斷改進，乳酸菌的加工耐熱性、貯藏穩(wěn)定性、胃腸中的活性都會不斷地提升和改進，從而促進高質(zhì)量、高活性乳酸菌制劑的加工與生產(chǎn)。