裴紅運,文 潔,山鳳蓮

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院,山東 濟(jì)寧 272000;2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,山東 濟(jì)寧 272000)

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一種慢性感染性疾病,也是世界范圍內(nèi)引起死亡的主要疾病之一,在過去200年里,總共約有10億人死于TB[1]。而且MTB對環(huán)境抵抗力強(qiáng),易產(chǎn)生耐藥性,在人類宿主中存活有高度適應(yīng)性[2],為人類健康事業(yè)發(fā)展帶來巨大挑戰(zhàn)。

淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,已有相關(guān)研究通過分析淋巴細(xì)胞各亞群的數(shù)量和功能來評估TB患者的免疫狀況及免疫平衡。米潔等[3]報道大部分TB患者淋巴細(xì)胞亞群中CD4+T細(xì)胞與健康對照組有顯著性差異,這或為導(dǎo)致TB患者免疫功能低下和免疫紊亂的原因之一。程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death protein-1,PD-1)是一種免疫檢查點分子,主要表達(dá)在活化的CD4+T、CD8+T細(xì)胞上,與其配體細(xì)胞程序性死亡-配體(Programmed cell death ligand ,PD-L)1或PD-L2結(jié)合后在免疫應(yīng)答中主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[4]。目前相關(guān)研究表明,MTB抗原可以顯著激活PD-1/PD-L1途徑,以驅(qū)動淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng),從而對機(jī)體的免疫耐受起調(diào)節(jié)作用。本文就近年來國內(nèi)外PD-1在TB患者淋巴細(xì)胞上表達(dá)的變化及PD-1對MTB感染的影響的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期對TB有進(jìn)一步的認(rèn)識。

1 PD-1在T淋巴細(xì)胞上的研究

人體對MTB感染的免疫反應(yīng)主要包括細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和遲發(fā)性過敏,二者均由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)[5]。PD-1與PD-L1/L2通過受體分子胞漿尾部的免疫受體酪氨酸抑制基序激發(fā)抑制信號,從而引起T細(xì)胞的生長代謝以及功能特性改變,最終導(dǎo)致免疫抑制[6]。

1.1PD-1在MTB感染患者T細(xì)胞上的表達(dá) 目前的研究多認(rèn)為PD-1在TB患者T淋巴細(xì)胞上高表達(dá),有研究表明相比于潛伏性結(jié)核感染患者及健康個體,PD-1在TB患者尤其是活動性結(jié)核感染(Active-tuberculosis,ATB)患者外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞上顯著高表達(dá)[7-8],其中Day等[8]發(fā)現(xiàn)MTB特異性CD4+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)高于CD8+T細(xì)胞。此外,為了研究是否只有人類感染MTB后PD-1在T淋巴細(xì)胞有差異,也有團(tuán)隊通過應(yīng)用MTB抗原等建立了一個T細(xì)胞功能障礙的小鼠模型,并根據(jù)不同方案不同抗原進(jìn)行實驗,他們最終得出的實驗結(jié)果為持續(xù)抗原刺激組CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)顯著高于抗原瞬時組和初治組,且CD4+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)增加的比例較CD8+T細(xì)胞明顯,這也從不同物種層面上為上述PD-1在TB患者T淋巴細(xì)胞的表達(dá)研究做了補(bǔ)充[9]。

T淋巴細(xì)胞有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)CD4+CD25+Foxp3+、應(yīng)答性T細(xì)胞(responder T cell,Tresp)CD4+CD25-和效應(yīng)性T細(xì)胞(effector T cell,Teff)CD4+CD25+Foxp3-等不同的T細(xì)胞亞群(Foxp3+是Tregs的特異轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)Treg的功能,被認(rèn)為是Treg的標(biāo)志分子),因此PD-1在不同T細(xì)胞亞群上的表達(dá)也引起人們的興趣。如Shen等[10]對ATB患者CD4+T細(xì)胞亞群進(jìn)行相關(guān)研究,通過他們的研究結(jié)果可知在ATB患者中PD-1在這3個T細(xì)胞亞群上的表達(dá)水平均明顯高于正常人,并且在有效的抗結(jié)核治療后Tresp和Teff細(xì)胞亞群上PD-1的表達(dá)水平較治療前顯著降低,這也更充分的證明PD-1在MTB感染患者T淋巴細(xì)胞上高表達(dá)。

然而,最近的一項研究發(fā)現(xiàn)ATB患者外周血中CD4+CD25+CD127LOW/Treg上PD-1和PD-L1水平均低于正常人,而Treg細(xì)胞在TB患者外周血中的比例高于健康對照組[11](CD127分子是新發(fā)現(xiàn)的Treg特異性標(biāo)記分子,比Foxp3更容易檢測,且CD127低表達(dá)與Foxp3表達(dá)高度相關(guān)[12]。因此,CD4+CD25+CD127Low/Treg能更好地表征Treg群體在免疫抑制和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[13])。我們得知Treg是一種在免疫反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)面調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞,可抑制功能性CD4+/CD8+T細(xì)胞的活化和增殖,而PD-1和PD-L1可共同傳遞抑制信號抑制抗結(jié)核免疫反應(yīng),PD-1/PD-L1的表達(dá)下調(diào)降低了Treg的激活閾值,從而會促進(jìn)ATB患者外周血中CD4+CD25+CD127Low/Tregs的增殖[14]。PD-1在Treg上表達(dá)結(jié)果的不同表明PD-1在Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持中具有特殊作用,PD-1/PD-L1途徑負(fù)調(diào)控Treg增殖和功能。此外,Treg細(xì)胞在MTB感染中可能也發(fā)揮多重作用,并不單純的抑制免疫。因此我們推測當(dāng)受到MTB刺激后,Treg上PD-1/PD-L1負(fù)共刺激因子表達(dá)下調(diào),促進(jìn)其增殖并對功能性T細(xì)胞產(chǎn)生抑制,為防止免疫過度,PD-1上調(diào)抑制Treg繼續(xù)擴(kuò)增。另一方面,PD-1在Treg上表達(dá)不同可能由于其與MTB特異性T細(xì)胞、非MTB特異性T細(xì)胞分布有關(guān)。此外,不同的Treg細(xì)胞亞群上的PD-1表達(dá)可能也不同。總之,PD-1在Treg上的確切表達(dá)還仍需進(jìn)一步研究。

1.2PD-1在TB不同來源標(biāo)本中T細(xì)胞上的表達(dá) 上述研究團(tuán)隊檢測的淋巴細(xì)胞標(biāo)本基本都是取自實驗對象的外周血,而MTB感染還可能會導(dǎo)致胸腔積液、結(jié)核性胸膜炎等情況。因此,對于其他標(biāo)本來源的淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)也需要進(jìn)一步探索。在TB患者肺部感染中,支氣管肺泡灌洗液也是常用的研究樣本,可與外周血進(jìn)行比較從而更動態(tài)全面的評估研究結(jié)果,Day等[8]發(fā)現(xiàn)針對同一結(jié)核潛伏感染患者支氣管肺泡灌洗液樣本中CD4+T和CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)顯著高于外周血樣本。除此之外,PD-1在結(jié)核性胸膜炎患者胸腔積液單核細(xì)胞中CD4+T和CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)高于其外周血單核細(xì)胞,也高于健康對照組的外周血單核細(xì)胞[15-16]。這些結(jié)果可能是因為人類感染MTB期間PD-1在感染部位高度表達(dá)引起。

2 阻斷PD-1對TB患者T淋巴細(xì)胞的影響

目前的研究發(fā)現(xiàn)PD-1在慢性感染、各種惡性腫瘤中起限制病原體及腫瘤特異性T細(xì)胞的功能[17-18],并且通過阻斷PD-1受體或其配體可以增強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量和功能,進(jìn)而控制腫瘤的進(jìn)一步惡化,目前已有多種PD-1靶向藥物被批準(zhǔn)用于治療各種惡性腫瘤。對于TB等感染性疾病來說,通過阻斷PD-1/PD-L1途徑來增強(qiáng)T細(xì)胞功能或許也是一種重要的治療方法。

2.1阻斷PD-1可恢復(fù)T細(xì)胞的免疫功能 目前多數(shù)研究認(rèn)為MTB特異性CD4+T、CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(Tumour Necrosis Factor alpha,TNF-α)是控制MTB感染的基礎(chǔ),阻斷PD-1受體可提高IFN-γ+T細(xì)胞的比例且顯著提高了ATB患者M(jìn)TB特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ,這也證明PD-1受體對T細(xì)胞的效應(yīng)功能起負(fù)調(diào)節(jié)作用[16]。此外,阻斷PD-1受體不僅能增加單個細(xì)胞因子的產(chǎn)生,還增加多功能T細(xì)胞雙重細(xì)胞因子產(chǎn)生(如IFN-γ+TNF-α、IL-2+IFN-γ+等)的頻率[19],這可能與MTB感染的恢復(fù)密切相關(guān)。在不同物種之間,阻斷PD-1后影響的T淋巴細(xì)胞及其功能并不完全相同。在恒河猴模型中,阻斷PD-1受體并沒有增加MTB特異性CD4+T細(xì)胞而是增加了CD8+T細(xì)胞的數(shù)量或功能[20]。而在人類TB中阻斷PD-1/PD-L1途徑則可以部分恢復(fù)MTB特異性CD4+T細(xì)胞的功能(包括分泌白細(xì)胞介素-2、TNF-α、IFN-γ和其體外細(xì)胞增殖),也可顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的增殖[21]。這其中具體的原因我們尚不得知,需要進(jìn)一步研究。

此外,機(jī)體識別MTB感染細(xì)胞后免疫細(xì)胞會分泌IFN-γ,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活,從而增加巨噬細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒敏感性。而CD8+T細(xì)胞不僅能產(chǎn)生IFN-γ,還能殺死感染的巨噬細(xì)胞,即阻斷PD-1受體可以增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性進(jìn)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的死亡易感性增加。正如Shen等[7]研究中描述的阻斷PD-1受體后,巨噬細(xì)胞的吞噬功能和細(xì)胞內(nèi)殺傷活性明顯增強(qiáng)。其他相關(guān)研究報道也得出體外阻斷PD-1受體可增加CD4+T細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,并誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[8,15]。

2.2阻斷PD-1可對MTB感染產(chǎn)生負(fù)面作用 雖然阻斷PD-1/PD-L1途徑可以導(dǎo)致產(chǎn)生IFN-γ及TNF-α的細(xì)胞增加和CD8+T細(xì)胞脫顆粒并激活巨噬細(xì)胞從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用,然而阻斷PD-1受體對于MTB感染可能也會導(dǎo)致相反的作用。Kauffman等[20]在MTB感染的恒河猴模型上阻斷PD-1受體后發(fā)現(xiàn)炎癥較前進(jìn)展,并且肺肉芽腫中細(xì)菌負(fù)荷增加。在小鼠模型中PD-1基因敲除的小鼠有更高的炎癥水平及細(xì)菌負(fù)荷[22],它們的MTB抗原特異性T細(xì)胞增殖較野生型小鼠顯著降低,對TB的易感性增加[23]。這些動物模型中的研究結(jié)果可能與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α和Treg細(xì)胞有關(guān)。然而,在PD-1敲除小鼠模型中,PD-1的缺乏并不會導(dǎo)致所有的分枝桿菌感染加劇,比如有報道顯示卡介苗在PD-1敲除小鼠中更容易被清除[24]。此外,除了上述在動物模型中的研究,在接受PD-1/PD-L1阻斷治療的癌癥患者中,也經(jīng)常有TB重新激活的報道[25]。以上這些提示PD-1途徑在MTB感染中具有多方面作用,還需要我們更加深入的探索。

3 PD-1在B淋巴細(xì)胞上的表達(dá)

B淋巴細(xì)胞能在抗原刺激下分化為漿細(xì)胞,漿細(xì)胞合成和分泌抗體從而主要參與機(jī)體的體液免疫。過去的研究中主要認(rèn)為宿主對胞內(nèi)病原體的防御是由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的,而對胞外病原體的反應(yīng)是由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體介導(dǎo)[26-27]。然而,近年的研究表明B細(xì)胞除產(chǎn)生抗體外,還是活性抗原提呈細(xì)胞,并可以通過影響其他免疫細(xì)胞的功能來促進(jìn)宿主對病原體的防御[28]。

大部分研究揭示了PD-1及其配體在TB患者T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的表達(dá)均明顯上調(diào)[10,16,21],并且Singh等[29]發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者B細(xì)胞上PD-1及其配體的表達(dá)低于CD14+單核細(xì)胞。胥萍[30]研究得出肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞及B細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)顯著高于健康對照組,并且認(rèn)為PD-L1在B淋巴細(xì)胞上高表達(dá)能增加與T細(xì)胞表面PD-1受體的相互作用,共同調(diào)節(jié)負(fù)性免疫信號,進(jìn)一步抑制T細(xì)胞的免疫功能。目前關(guān)于PD-1信號通路在TB中單獨B淋巴細(xì)胞上的研究仍較少,且對于其具體作用機(jī)制等還不明確,尚需進(jìn)一步深入研究。

4 PD-1在自然殺傷細(xì)胞上的表達(dá)

自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK細(xì)胞)是一類無需預(yù)先致敏就能對腫瘤及感染細(xì)胞起到非特異性殺傷作用的淋巴細(xì)胞,且其活性通過激活受體和抑制受體之間的平衡調(diào)節(jié)?；贑D56受體的差異表達(dá),NK細(xì)胞主要有兩種細(xì)胞亞群,其中CD56dim NK細(xì)胞占大多數(shù),主要介導(dǎo)先天免疫調(diào)節(jié)和抗體依賴性靶細(xì)胞裂解,而CD56bright NK細(xì)胞在產(chǎn)生細(xì)胞因子方面更有效[31]。在T細(xì)胞活化等適應(yīng)性免疫之前,病原體識別受體識別先天性免疫是抵御病原體的主要防御手段[32],而NK細(xì)胞可以聯(lián)系先天性免疫和適應(yīng)性免疫介導(dǎo)的反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)等。此外,NK細(xì)胞還通過釋放穿孔素和顆粒溶素等細(xì)胞毒分子、間接傳遞適應(yīng)性免疫信號等多種機(jī)制幫助宿主抵抗病原體感染[33]。

目前TB患者NK細(xì)胞上PD-1的表達(dá)研究仍較少,具體機(jī)制尚不明確。Hassan等[34]發(fā)現(xiàn)PD-1并不抑制NK細(xì)胞的殺傷活性,而是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、介導(dǎo)其效應(yīng)功能等機(jī)制調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。Alvarez等[35]研究發(fā)現(xiàn)MTB感染患者NK細(xì)胞上PD-1的表達(dá)顯著高于健康人,并且胸腔積液中NK細(xì)胞的PD-1/PD-L1水平明顯高于外周血,即在活動性病變部位表達(dá)水平較高。此外,細(xì)胞因子如Th2、Th17會降低胸水NK細(xì)胞的PD-1水平,而IFN-γ則增加PD-1的表達(dá)?？偟膩碚f,MTB刺激會上調(diào)NK細(xì)胞上的PD-1水平,通過一系列反應(yīng)最終抑制NK細(xì)胞抵御病原體的效應(yīng)功能;而阻斷PD-1受體會增加NK細(xì)胞的數(shù)量,以調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。

5 小結(jié)

通過之前的研究發(fā)現(xiàn),在TB等慢性感染病中,長時間的抗原暴露可能會誘導(dǎo)T細(xì)胞的終末分化趨向功能性“衰竭”,從而抑制宿主的免疫功能,而阻斷免疫檢查點抑制受體則可以恢復(fù)宿主免疫調(diào)節(jié)。近年來研究比較多的免疫檢查點有PD-1、淋巴細(xì)胞激活基因-3、T細(xì)胞免疫球蛋白-3、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4,皆為抑制性受體,能發(fā)揮介導(dǎo)調(diào)控免疫作用。其中關(guān)于PD-1途徑在TB中的作用研究逐年增多,但PD-1在TB淋巴細(xì)胞上具體的表達(dá)及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究,尤其是B細(xì)胞、NK細(xì)胞。此外,PD-1/PD-L1還表達(dá)于巨噬細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞、樹突細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞中,因此PD-1/PD-L1在這些細(xì)胞的表達(dá)及作用或許也是一個新的研究方向。通過研究PD-1在TB淋巴細(xì)胞上的表達(dá)及意義,可以為抗結(jié)核治療提供新的思路,進(jìn)而對TB產(chǎn)生更深入的認(rèn)識,有助于促進(jìn)人類衛(wèi)生健康事業(yè)發(fā)展。