帖金鑫,張青松,李永生,廖付,吳繼忠,白冰,楊靖,李石頭

1.浙江中煙工業(yè)有限責任公司 寧波卷煙廠,浙江 寧波 315504;2.浙江中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心,浙江 杭州 310000;3.鄭州輕工業(yè)大學 煙草科學與工程學院,河南 鄭州 450001

0 引言

位于加拿大最南部的安大略省,自然條件良好,氣候溫和、晝夜溫差大,降雨量、日照、土質(zhì)均適于煙草生長[1],其優(yōu)越的生態(tài)條件使得產(chǎn)自該地的煙葉具有明亮度高、香氣優(yōu)雅、勁頭適宜、工業(yè)可用性高等優(yōu)點,也稱為加拿大煙葉。但加拿大煙葉的產(chǎn)量較小,不能很好地滿足部分國產(chǎn)品牌卷煙配方和生產(chǎn)的需要,因此尋找和開發(fā)相似的國產(chǎn)煙葉替代加拿大煙葉,成為解決該問題的關鍵[2]。研究[3-5]發(fā)現(xiàn),煙葉香氣風格和感官品質(zhì)與其化學成分的種類及含量密切相關,通過比較加拿大煙葉與國內(nèi)優(yōu)質(zhì)煙葉香氣成分的差異,有助于揭示加拿大煙葉香氣風格形成的內(nèi)在因素,為國產(chǎn)替代煙葉的確定提供理論依據(jù)。

代謝組學是一種識別和量化小分子代謝物的新型研究手段,它從整體角度出發(fā),運用現(xiàn)代檢測技術對食品、植物、生物樣品中盡可能多的代謝產(chǎn)物進行分析檢測[6-10],通過主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)等方法找出不同組別樣本的差異代謝物(差異成分),已在種類鑒別[11-14]、食品加工前后成分變化[15-16]、中藥產(chǎn)地溯源[17-18]、煙葉香型區(qū)分[19-20]等領域得到了廣泛應用。

云南KRK26煙葉為引進津巴布韋煙葉[21],其與加拿大煙葉同屬優(yōu)質(zhì)煙葉,但二者香氣風格存在差異。鑒于此,本文擬以加拿大煙葉和云南德宏KRK26煙葉為研究對象,借鑒代謝組學研究方法,采用二維氣質(zhì)聯(lián)用技術和多元統(tǒng)計分析方法,通過二者香氣成分的差異性分析,探討其風格特征的不同成因,以期為煙葉原料的開發(fā)、應用提供數(shù)據(jù)支撐與參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

主要材料:加拿大煙葉C3F MK、津引云南德宏KRK26煙葉C3F,浙江中煙工業(yè)有限責任公司。

主要儀器:8860-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫公司;SSM 1810型固態(tài)熱調(diào)制器,雪景電子科技(上海)有限公司。

主要試劑:二氯甲烷(色譜純),天津市凱通公司;正己烷(色譜純),山東禹王公司;異丙醚(色譜純),東京化成株式會社;異丙醇(色譜純),德國默克公司;無水硫酸鈉、無水乙醇(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司;2,6-二氯甲苯、硝基苯、反式-2-己烯酸(純度均大于99%),百靈威科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)標標準溶液配制準確稱取2,6-二氯甲苯、硝基苯和反式-2-己烯酸,分別用二氯甲烷定容,配制成質(zhì)量濃度分別為0.556 7 mg/mL、0.548 7 mg/mL和0.827 3 mg/mL的中性、堿性和酸性內(nèi)標標準溶液。

1.2.2 煙葉揮發(fā)性成分提取揮發(fā)性成分的提取方法參照文獻[22],并略有改進。不同批次的加拿大煙葉和云南KRK26煙葉各抽取5份,粉碎后過40目篩,共10份樣品。稱取30.0 g煙末于1000 mL圓底燒瓶中,加入400 mL去離子水,另一側(cè)燒瓶加入100 mL二氯甲烷,同時蒸餾萃取2.5 h后,萃取液先用質(zhì)量分數(shù)為5%鹽酸水溶液(30 mL×3)洗滌,然后用質(zhì)量分數(shù)為5%氫氧化鈉水溶液(30 mL×3)洗滌,得到中性萃取液;鹽酸水溶液合并后,加氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至12,用二氯甲烷(30 mL×3)萃取,合并有機相得到堿性萃取液;氫氧化鈉水溶液合并后,加鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2,用二氯甲烷(30 mL×3)萃取,合并有機相得到酸性萃取液。在中性、酸性、堿性萃取液中加入適量的無水Na2SO4,冷藏過夜后過濾,常壓濃縮至1 mL,進行GC-MS分析,每個樣品重復3次,定量結(jié)果取平均值。

1.2.3 分析條件1)色譜條件。中性和堿性組分:進樣量為1 μL,進樣口溫度為280 ℃,分流比為10∶1;第一維色譜柱為DB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二維色譜柱為DB-17 MS(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),載氣為氦氣,流量為1.2 mL/min;程序升溫起始溫度為100 ℃,保持2 min,以4 ℃/min的速率升溫到270 ℃,保持5 min。

酸性組分:進樣量為1 μL,進樣口溫度為280 ℃,分流比為10∶1;第一維色譜柱為DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),第二維色譜柱為DB-17 MS(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),載氣為氦氣,流量為1.2 mL/min ;程序升溫起始溫度為40 ℃,保持2 min,以6 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min。

調(diào)制柱為HV調(diào)制柱(1.2 m×0.25 mm),調(diào)制周期為5 s,解析時間為1 s;N2補償氣為0.15 MPa,同步GC升溫程序,調(diào)制器進口溫度比柱箱高30 ℃,調(diào)制器出口溫度比柱箱高120 ℃,冷阱保持-50 ℃。

2)質(zhì)譜條件。電子轟擊源(EI),電離能為70 eV;離子源溫度為230 ℃,MS傳輸線溫度為280 ℃,四極桿溫度為150 ℃;EM電壓為862 V;采集質(zhì)量范圍為41～350 amu,采集速度為23 Hz,溶劑延遲時間分別為中性和堿性組分時2.5 min,酸性時5 min。

3)譜圖處理。采用全二維數(shù)據(jù)處理工作站軟件Canvas載入數(shù)據(jù),自動繪制全二維TIC輪廓圖,并對圖中信噪比大于10的峰自動識別,標識出的每一個峰點即代表1種化合物,每個化合物由1對保留時間確定,X軸方向為第1維保留時間/min,Y軸方向為第2維保留時間/s,通過正構(gòu)烷烴進行保留指數(shù)計算。在Canvas軟件上,通過對每種化合物的質(zhì)譜圖進行NIST20標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對檢索、結(jié)合保留指數(shù)(Retention Index,RI)等信息,對化合物進行定性分析,同時根據(jù)峰面積,利用內(nèi)標校正得到各香氣成分的相對含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理采用Excel、SPSS19及多元統(tǒng)計軟件SIMCA14.1進行數(shù)據(jù)處理。

1.2.5 差異成分篩選采用多元統(tǒng)計分析方法,對兩組樣本首先進行PCA,以便初步了解各組樣本間的總體成分差異和組內(nèi)樣本間的變異度大小。根據(jù)OPLS-DA預測模型穩(wěn)定可靠性,利用多維統(tǒng)計變量重要性投影(Variable Importancein Project,VIP)值、獨立樣本T檢驗P值及差異倍數(shù)(FC值)篩選差異成分。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種煙葉揮發(fā)性成分分析

運用二維氣質(zhì)聯(lián)用技術分別對加拿大煙葉和云南KRK26煙葉中的中性、堿性和酸性成分進行分離鑒定,種類及含量見表1,其中中性成分按照來源分為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物、棕色化反應產(chǎn)物、苯丙氨酸類降解產(chǎn)物等,堿性成分主要為生物堿,酸性成分主要分為揮發(fā)性有機酸、半揮發(fā)性有機酸和酚類。由表1可知,加拿大煙葉和云南KRK26煙葉共鑒定出117種香氣成分,加拿大煙葉有114 種,云南KRK26煙葉有113 種,其中110 種為兩者共有。中性香氣成分有63種,其中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物均為21種,但含量差異較大,加拿大煙葉含量較高的分別是巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、(E)-β-大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、二氫大馬酮、香葉基丙酮、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮和3-氧代-α-紫羅蘭醇,云南KRK26煙葉含量較高的分別是巨豆三烯酮、金合歡基丙酮、(E)-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、二氫大馬酮、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮和3-氧代-α-紫羅蘭醇;茄酮作為典型的西柏烷類降解產(chǎn)物,在加拿大煙葉、云南KRK26煙葉中的含量分別為11.54 μg/g、16.57 μg/g;此外,二者的棕色化反應產(chǎn)物均為11種;苯丙氨酸類降解產(chǎn)物均為4種;余下主要為含倍半萜結(jié)構(gòu)的醇、醛、酮、萜烯等,共26種。兩種煙葉堿性香氣成分共18種,主要為吡啶和喹啉類化合物,其中加拿大煙葉16種,云南KRK26煙葉18種。酸性香氣成分共36種,包括揮發(fā)性有機酸、半揮發(fā)性有機酸和酚類,其中加拿大煙葉35種,云南KRK26煙葉34種。

2.2 兩種煙葉香氣差異成分分析

兩種煙葉樣本的PCA得分圖如圖1所示,其中每個點代表1個獨立樣品,C代表加拿大煙葉樣本,Y代表云南KRK26煙葉樣本。由圖1可知,2個主成分的累計貢獻率達到90.1%,2組樣品之間的分離趨勢明顯,表明加拿大煙葉和云南KRK26煙葉之間存在明顯差異。進一步采用具有監(jiān)督的模式識別方法OPLS-DA對數(shù)據(jù)進行處理,提取相關性較小變量的主要信息,除去不相關的差異以篩選差異變量,模型的可解釋變量R2(R2X=0.752、R2Y=1.000)及可預測度Q2(Q2=0.991)均較高,表明該模型的穩(wěn)定性和預測性較好,可較好反映兩種煙葉樣品之間的香氣差異成分。為驗證模型是否存在過擬合現(xiàn)象,對模型進行了200次響應排序,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,R2和Q2的截距分別為0.641和-0.498,說明模型有效,不存在過擬合現(xiàn)象。

基于OPLS-DA結(jié)果,根據(jù)獲得的多變量分析OPLS-DA模型的VIP值,以其表示對應香氣成分的組間差異在模型各組樣本分類判別中的影響強度,一般認為VIP≥1的物質(zhì)為差異顯著,可初步篩選出兩種煙葉間的差異成分。對云南KRK26煙葉和加拿大煙葉進行篩選,共得到的差異成分9類65種(P<0.001),結(jié)果見表2。由表2可知,整體上,云南KRK26煙葉和加拿大煙葉差異成分(65 種)占共有香氣成分(117種)的50.6%,說明兩種煙葉香氣成分差異顯著。其中差異成分較多的種類是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和有機酸,占比分別為13.7%和15.4%,其次為其他中性香氣成分(14.5%)和生物堿(5.1%),苯丙氨酸類降解產(chǎn)物有2種差異成分,西柏烷類降解產(chǎn)物和棕色化反應產(chǎn)物各有1種差異成分。

表1 兩種煙葉中揮發(fā)性香氣成分種類及含量Table 1 Types and content of volatile aroma components of two tobacco leaves μg/g

表1(續(xù))

圖1 兩種煙葉樣本的PCA得分圖Fig.1 PCA score plot for two types of tobacco leaves

圖2 兩種煙葉樣本OPLS-DA 200次交叉驗證圖Fig.2 Cross-validation plot of OPLS-DA with 200 permutation test for two types of tobacco leaves

為方便觀察代謝物變化規(guī)律,簡單、直觀地反映代謝物的變化情況,對差異顯著的代謝物進行歸一化處理,并繪制聚類熱圖(見圖3)。由圖3可知,兩種煙葉香氣成分含量整體上差異明顯。結(jié)合表1和表2可知,類胡蘿卜素降解產(chǎn)物是煙葉中重要的致香成分,其種類及含量與煙葉香氣風格的形成至關重要,16種VIP>1的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物,在云南KRK26煙葉中的含量均顯著高于加拿大煙葉,包括巨豆三烯酮、大馬酮、二氫大馬酮等,盡管差異倍數(shù)不大,但由于其含量較高,香氣閾值較低,可認為是兩種煙葉的關鍵差異成分。中性香氣成分中,新植二烯、螺巖蘭草酮和α-香附酮含量較高,且在加拿大煙葉中均高于或遠高于云南KRK26煙葉。此外,有機酸是兩種煙葉中化合物數(shù)量較多、含量較高且差異較大的一類物質(zhì)。根據(jù)結(jié)構(gòu)差異,煙葉中的脂肪酸又可分為揮發(fā)性有機酸和半揮發(fā)性有機酸,云南KRK26煙葉揮發(fā)性有機酸含量高于加拿大煙葉,而加拿大煙葉半揮發(fā)有機酸含量明顯高于云南KRK26煙葉,其可能與煙葉香氣風格的形成密切相關。

表2 兩種煙葉中差異成分分析結(jié)果Table 2 Analysis of differential components between two types of tobacco leaves

為比較兩種煙葉香氣成分定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)變化,將差異倍數(shù)進行處理(log2FC),變化排在前30的差異表達代謝成分如圖4所示。由圖4可知,加拿大煙葉含7種有機酸(壬酸、異丁酸、月桂酸、油酸、棕櫚油酸、3-甲基戊酸和肉豆蔻酸),2 種酚類(2-甲氧基-5-甲基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚),6種其他中性香氣成分(香葉醇、α-香附酮、氧化石竹烯、螺巖蘭草酮、乙酸乙酯和香葉基香葉醇)的含量顯著高于云南KRK26煙葉;而云南KRK26煙葉含4 種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物(β-二氫紫羅蘭酮、4-氧代異佛爾酮、香葉基丙酮和二氫-β-脫氫紫羅蘭酮),2種生物堿(4-苯基吡啶和喹啉甲醛),1 種酚類(苯酚),2 種脂肪酸(丁酸和異戊酸),1 種苯丙氨酸類降解產(chǎn)物(苯乙醇),5 種其他中性香氣成分(1-戊烯-3-酮、6-甲基-5-乙基-3-庚烯-2-酮、異戊烯醛、γ-辛內(nèi)酯和6-甲基-2-庚酮)的相對含量顯高于加拿大煙葉。

圖3 差異成分聚類熱圖Fig.3 Heat map for differential components

圖4 兩種煙葉中含量差異最大的30 種化合物Fig.4 Thirty most significantly differential components between two types of tobacco leaves

2.3 兩種煙葉風格差異分析

從煙氣特征來看,加拿大煙葉香氣細膩、透發(fā)、圓潤感好,香氣量尚足,煙氣濃度中等、柔和,吸味甜、勁頭足、余味舒適;云南KRK26煙葉香氣豐滿清雅,自然醇和,煙草本香凸顯,刺激性稍大,吸味津甜,細膩圓潤。兩種煙葉感官品質(zhì)及香氣風格相似的同時也存在差異,這與其香氣成分種類及含量有關。分析結(jié)果表明:加拿大煙葉與云南KRK26煙葉的堿性香氣成分差異不大,而酸性香氣成分和中性香氣成分差異明顯。加拿大煙葉半揮發(fā)性中長鏈脂肪酸含量明顯高于云南KRK26煙葉,半揮發(fā)性有機酸可柔和煙氣,提升煙氣圓潤感和透發(fā)性,是煙葉形成濃香型風格的重要影響因素。云南KRK26煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和西柏烷類降解產(chǎn)物含量占比均較高,其中巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、茄酮等成分對增加煙氣的清甜感及凸顯煙草本香具有重要作用,而加拿大煙葉中萜烯、萜酮含量較高,類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量雖低于云南KRK26煙葉,但仍處于較高的水平,這使得加拿大煙葉形成了獨特的“濃中透清”煙氣風格。

王曉輝[23]以煙葉中β-紫羅蘭酮、β-二氫大馬酮和巨豆三烯酮總量的聚類分析結(jié)果為分組依據(jù),建立了化學分組方法用來指導葉組配方,發(fā)現(xiàn)配方模塊的香氣特性及煙氣特性與類胡蘿卜素標志性轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量呈明顯的相關性,類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量高的煙葉,香氣特性較好,即煙香豐富、香氣量足,而類胡蘿卜素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量中等的煙葉,煙氣特性較好,即煙氣細膩、煙香明快、刺激性小。從本文研究結(jié)果可知,云南KRK26煙葉中巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-二氫大馬酮、β-紫羅蘭酮等香氣成分總量高,香氣豐滿、香氣量充足,但酸性成分含量相對較低,使得煙氣刺激性稍大,煙氣略顯粗糙,柔順性有待提升,配伍性稍差,可作為主料煙使用,以彰顯卷煙香氣風格;加拿大煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量適中,半揮發(fā)性有機酸含量較高,使得其煙氣盡管香氣量一般,但舒適性、柔順性較好,在葉組配方中使用時,自身的香氣風格不易顯露,在提升香氣格調(diào)的同時,又能有效降低煙氣刺激性,使煙氣柔和細膩,改善煙氣特性。

3 結(jié)論

本文通過主成分分析、正交偏最小二乘判別分析等方法對加拿大煙葉和云南KRK26煙葉香氣成分進行了對比分析,篩選得到差異成分65種,占共有香氣成分的50.6%。加拿大煙葉中有22 種成分含量較高,主要為半揮發(fā)性有機酸類和倍半萜類;云南KRK26煙葉中有43種成分含量較高,主要為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物,如巨豆三烯酮、大馬酮、二氫大馬酮等。類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和半揮發(fā)性有機酸含量的差異與兩種煙葉香氣風格密切相關,因此,在加拿大煙葉替代篩選時,可將化學成分作為判定指標,重點關注類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量中等、半揮發(fā)性有機酸含量較高的煙葉,并在葉組配方中將其作為調(diào)味煙葉使用,可與濃香型或清香型主料煙進行較好的配伍,提升煙草制品品質(zhì)。