張義森,程碩,周娟娟,賈會領(lǐng),王軍,陳雪,吳麗芳

1.安徽醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230032;2.中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 離子束生物工程與綠色農(nóng)業(yè)研究中心,安徽 合肥 230031

0 引言

納米鉑顆粒(Platinum Nanoparticles,PtNPs)具有催化活性高、抗氧化活性強(qiáng)、性能穩(wěn)定等理化特性,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣闊,已被用于抗菌、治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病、檢測生物標(biāo)志物等方面,也被批準(zhǔn)作為添加劑應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域[1-3]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliver)又名思仲、思仙等,為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木,是我國獨有的藥材之一,也是世界寶貴的藥源植物資源[14]。杜仲不同部位的提取物具有抗氧化、抗衰老、降血壓、降血糖等藥理作用[15-16],其中杜仲葉含有豐富的木脂素、環(huán)烯醚萜、綠原酸、黃酮類、苯丙素、多糖、多酚等化學(xué)成分,可作為Pt4+的優(yōu)良還原劑和穩(wěn)定劑[17]。目前,已有報道利用杜仲各部位提取物合成Au、Ag等納米粒子[18-20],但鮮見合成PtNPs的報道,也未見有關(guān)綠色合成的PtNPs在皮膚美白方面的研究?；诖?本研究擬利用杜仲葉提取物作為還原劑和穩(wěn)定劑,采用一步法簡單且高效地綠色合成PtNPs,通過單因素試驗分析反應(yīng)條件對PtNPs顏色和濃度的影響,并研究PtNPs對酪氨酸酶活性的抑制作用,以期為PtNPs應(yīng)用于美白類護(hù)膚品提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

主要材料與試劑:杜仲葉提取物,陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司;氯鉑酸(分析純),BBI生命科學(xué)有限公司;人惡性黑色素瘤細(xì)胞系(A375),美國模式培養(yǎng)物研究所(ATCC);高糖DMEM培養(yǎng)基,上海源培生物科技股份有限公司;血清,上海雙洳生物科技有限公司;青鏈霉素混合液,北京索萊寶生物科技有限公司;CCK8試劑盒(MA0218-5),大連美侖生物技術(shù)有限公司;蘑菇酪氨酸酶(酶活為25 000 U),美國Sigma-Aldrich公司;左旋多巴(分析純),阿拉丁生化科技股份有限公司。其他試劑均為分析純。

主要儀器:SCIENTZ-12 N/D型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;ScanDrop型紫外分光光度計,德國耶拿分析儀器股份公司;JEM2100F型透射電子顯微鏡(TEM),日本電子株式會社(JEOL)公司;IS5型傅里葉變換紅外光譜儀,賽默飛世爾科技公司;Smartlab型X射線衍射儀,日本理學(xué)株式會社公司;PL-9602型酶標(biāo)儀,北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲葉提取物溶液制備準(zhǔn)確稱取5 g杜仲葉提取物溶解于超純水并定容至100 mL,將混合溶液斡旋至充分溶解,超聲15 min后,在4000 r/min條件下離心10 min,取上清液,過0.45 μm微孔濾膜,即得杜仲葉提取物溶液,置于冰箱(-20 ℃)中儲存。根據(jù)實驗需要,將杜仲葉提取物溶液按不同質(zhì)量濃度(2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL、10.0 mg/mL和12.5 mg/mL)稀釋,備用。

1.2.2 氯鉑酸水溶液制備準(zhǔn)確稱取1 g氯鉑酸溶解于超純水并定容至48.8 mL,制備濃度為50 mmol/L的氯鉑酸水母液。根據(jù)實驗需要,將氯鉑酸水母液稀釋成不同濃度(0.5 mmol/L、1.5 mmol/L、2.5 mmol/L、3.5 mmol/L和5.0 mmol/L)氯鉑酸水溶液,備用。

1.2.3PtNPs制備將4 mL杜仲葉提取物溶液與1 mL氯鉑酸水溶液混合,用超純水定容至20 mL,加熱攪拌至溶液變?yōu)樽厣蚝谏?停止反應(yīng)并冷卻至室溫;將反應(yīng)液置于12 000 r/min條件下離心20 min, 除去上清液,將沉淀用超純水超聲分散10 min后,再次離心15 min,重復(fù)3次。將所得沉淀一部分用超純水溶解,儲存于離心管中,置于冰箱(4 ℃)中儲存,用于測定酪氨酸酶活性;一部分經(jīng)真空冷凍干燥得PtNPs粉末,用于性能表征。

1.2.4PtNPs溶液濃度測定將50 μL PtNPs溶液加入5 mL HNO3中,過夜進(jìn)行硝化反應(yīng)后,將硝化液蒸干,并用5 mL超純水重新溶解,再將溶液通過0.45 μm微孔濾膜過濾,采用電感耦合法測定Pt元素濃度,從而計算PtNPs溶液濃度。

1.2.5 單因素試驗1)反應(yīng)時間的影響:在反應(yīng)溫度為90 ℃,氯鉑酸濃度為2.5 mmol/L,杜仲葉提取物質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的條件下,考查不同反應(yīng)時間(30 min、45 min、60 min、75 min和90 min)對PtNPs顏色及濃度的影響。

2)反應(yīng)溫度的影響:在反應(yīng)時間為60 min,其他反應(yīng)條件同步驟1)的情況下,考查不同反應(yīng)溫度(50 ℃、70 ℃和90 ℃)對PtNPs顏色及濃度的影響。

3)氯鉑酸濃度的影響:在其他反應(yīng)條件同步驟1)的情況下,考查不同氯鉑酸濃度(0.5 mmol/L、1.5 mmol/L、2.5 mmol/L、3.5 mmol/L和5.0 mmol/L)對PtNPs顏色及濃度的影響。

4)杜仲葉提取物質(zhì)量濃度的影響:在其他反應(yīng)條件同步驟1)的情況下,考查不同杜仲葉提取物質(zhì)量濃度(2.5 mg/mL、5.0 mg/mL、7.5 mg/mL、10.0 mg/mL和12.5 mg/mL)對PtNPs 顏色及濃度的影響。

1.2.6PtNPs溶液濃度、表面形貌與結(jié)構(gòu)表征1)紫外吸收光譜(UV-vis)測定。PtNPs溶液的濃度與其吸光度呈正相關(guān),因此使用紫外分光光度計測定PtNPs溶液在200～729 nm處的吸光度,初步確定是否合成了PtNPs及合成PtNPs的適宜條件,并選擇適宜條件下合成的PtNPs進(jìn)行后續(xù)實驗。

2)表面形貌表征。將5 μL均勻分散的PtNPs溶液滴加于覆炭銅網(wǎng)上,室溫干燥后,固定在TEM采樣臺上,加速電壓為200 kV。

3)X射線衍射光譜(XRD)分析。在λ為0.154 06 nm、電流為20 mA、電壓為45 kV和2θ范圍為10°～90°的條件下,以4°/min的掃描速率測試PtNPs樣品。

4)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析。采用KBr壓片法測定PtNPs樣品的FTIR譜圖,掃描次數(shù)為16次,分辨率為4 cm-1,檢測波數(shù)范圍為400～4000 cm-1。

1.2.7 酪氨酸酶活性測定1)蘑菇酪氨酸酶活性測定。酪氨酸酶是黑色素產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)酶,蘑菇酪氨酸酶常用于體外檢測美白試劑對酪氨酸酶活性的影響。分別取不同質(zhì)量濃度的PtNPs溶液100 μL,加入50 μL蘑菇酪氨酸酶溶液(100 U/mL)后混合均勻,于37 ℃避光條件下水浴10 min,再加入200 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的左旋多巴,在37 ℃避光條件下水浴30 min,測定反應(yīng)溶液在475 nm處的吸光度。蘑菇酪氨酸酶活性計算公式為:

蘑菇酪氨酸酶活性=(T-T0)/(C-C0)×100%

其中,T、T0、C和C0分別表示PtNPs與酶反應(yīng)組、PtNPs組、酶反應(yīng)組和空白對照組的吸光度。

2)細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活力測定。使用高糖DMEM培養(yǎng)基(添加體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS和體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素-鏈霉素混合溶液)培養(yǎng)A375細(xì)胞,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2的加濕培養(yǎng)箱中,細(xì)胞1∶3傳代至對數(shù)生長期,利用胰酶進(jìn)行消化計數(shù)以進(jìn)行后續(xù)實驗。使用CCK8試劑盒檢測PtNPs對A375細(xì)胞活力的影響。將A375細(xì)胞(2.0×103細(xì)胞/孔)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孵育24 h后,用不同濃度的PtNPs溶液處理;再孵育24 h后,加入100 μL培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK-8試劑),繼續(xù)孵育4 h;用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力計算公式為:

細(xì)胞活力=A1×A0× 100%

其中,A1和A0分別表示處理細(xì)胞和未處理細(xì)胞的吸光度。

3)酪氨酸酶活性和黑色素含量測定。采用文獻(xiàn)[21]中的方法測定A375細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶的活性,將A375細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿(35×10 mm)中,貼壁培養(yǎng)24 h后,用不同濃度的PtNPs溶液處理細(xì)胞并孵育24 h,用PBS溶液洗滌細(xì)胞2次,加入裂解緩沖液(含有PMSF的體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100)。在-20 ℃條件下冷凍A375細(xì)胞30 min,4 ℃條件下解凍并收集細(xì)胞。離心并收集上清液,用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將上清液與200 μL左旋多巴溶液(4 mg/mL)混勻,37 ℃水浴3 h,用紫外分光光度計在490 nm處測定吸光度。酪氨酸酶活性計算公式為:

酪氨酸酶活性=R1/R0×100%

其中,R1和R0分別表示處理細(xì)胞和未處理細(xì)胞的吸光度。

將A375細(xì)胞在不同濃度的PtNPs溶液中孵育24 h后,在培養(yǎng)皿中加入500 μL PBS緩沖液并暴露在UVB燈(80 mJ/cm2)下,繼續(xù)孵育24 h,用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次后加入RIPA裂解液,離心并收集上清液,進(jìn)行蛋白定量。將上清液與150 μL NaOH溶液(1 mol/L,含體積分?jǐn)?shù)10%的DMSO)混勻,在60 ℃水浴中反應(yīng)30 min。用紫外分光光度計在450 nm處測定反應(yīng)溶液的吸光度,黑色素含量計算公式為:

黑色素含量=T1/T0×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 不同反應(yīng)條件對合成PtNPs的影響

圖1為不同反應(yīng)條件對PtNPs溶液顏色及吸光度的影響。由圖1a)可知,隨著反應(yīng)時間的延長,PtNPs溶液顏色由淡棕色變?yōu)樽厣蚝谏?且紫外吸收峰均出現(xiàn)在230 nm左右,表明反應(yīng)生成了PtNPs;且PtNPs溶液的吸光度先增大后減小,表明PtNPs溶液的濃度先升高后降低。這主要是因為反應(yīng)開始時,Pt4+逐漸被還原,但隨著反應(yīng)時間的延長,生成的PtNPs逐漸聚集繼而產(chǎn)生沉淀。因此,選擇反應(yīng)時間為60 min較適宜。

由圖1b)可知,隨著反應(yīng)溫度的升高,PtNPs溶液顏色逐漸加深,當(dāng)反應(yīng)溫度為90 ℃時,在230 nm附近出現(xiàn)了明顯的紫外吸收峰,表明此時PtNPs溶液的濃度較高。因此,選擇反應(yīng)溫度為90 ℃較適宜。

由圖1c)可知,隨著氯鉑酸濃度的升高,PtNPs溶液的顏色逐漸由棕色變?yōu)楹谏?吸光度先增大后減小,表明PtNPs溶液的濃度先升高后降低。當(dāng)氯鉑酸濃度為3.5 mmol/L時,PtNPs溶液濃度最高。因此,選擇氯鉑酸濃度為3.5 mmol/L較適宜。

由圖1d)可知,隨著杜仲葉提取物質(zhì)量濃度的升高,PtNPs溶液的吸光度先增大后減小,表明PtNPs溶液的濃度先升高后降低。當(dāng)杜仲葉提取物質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時,PtNPs溶液的濃度最高。因此,選擇杜仲葉提取物質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL較適宜。

2.2 表面形貌與結(jié)構(gòu)表征分析

2.2.1TEM分析圖2為PtNPs的TEM圖和粒徑分布圖。由圖2可知,PtNPs的粒徑較小且分布均勻,粒徑平均尺寸為(2.27±0.65) nm。

2.2.2XRD分析圖3為PtNPs的XRD譜圖。由圖3可知,所制備的PtNPs為晶體形式。與粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)圖譜(JCPDS #04-0802)相比,PtNPs樣品在(111)、(200)、(220)和(311)晶體平面上都出現(xiàn)了明顯的衍射峰,且未出現(xiàn)雜峰,表明形成了高純度的面心立方結(jié)構(gòu)[9]。

圖2 PtNPs的TEM圖和粒徑分布圖Fig.2 TEM and and particle size distribution of PtNPs

圖3 PtNPs的XRD譜圖Fig.3 XRD pattern of PtNPs

圖4 杜仲葉提取物和PtNPs的FTIR圖譜Fig.4 FTIR spectrum of Eucommia ulmoides Oliver leaf extract and PtNPs

2.3 PtNPs對蘑菇酪氨酸酶活性的影響

圖5為杜仲葉提取物、PtNPs和曲酸對蘑菇酪氨酸酶活性的影響。由圖5a)可知,PtNPs對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用明顯優(yōu)于杜仲葉提取物,當(dāng)PtNPs的質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL時,蘑菇酪氨酸酶活性降低至35.70%,IC50為(6.98±0.76) μg/mL。

圖5 杜仲葉提取物、PtNPs和曲酸對蘑菇酪氨酸酶活性的影響Fig.5 Effects of Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts, PtNPs and Kojic acid on mushroom tyrosinase activity

由圖5b)可知,與標(biāo)準(zhǔn)美白劑曲酸(IC50為(77.89±4.84) μg/mL)相比,PtNPs對蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用更強(qiáng)。

2.4 PtNPs對A375細(xì)胞活力的影響

圖6為PtNPs和杜仲葉提取物對A375細(xì)胞活力的影響,其中*表示P<0.05,下同。由圖6可知,當(dāng)PtNPs的質(zhì)量濃度為0～5.0 μg/mL時,A375細(xì)胞的生長并未受到明顯影響;當(dāng)PtNPs的質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL時,A375細(xì)胞的生長受到輕微的抑制。由圖6b)可知,杜仲葉提取物質(zhì)量濃度為0～100.0 μg/mL時,對A375細(xì)胞生長的影響不明顯。因此,在實驗選取質(zhì)量濃度范圍內(nèi),PtNPs和杜仲葉提取物對A375細(xì)胞生長的沒有明顯的影響。

2.5 PtNPs的抗酪氨酸酶活性分析

酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶,其細(xì)胞內(nèi)活性直接影響黑色素的合成[22-23]。圖7為PtNPs的抗酪氨酸酶活性,其中NC表示空白對照組,** 表示P<0.01,*** 表示P<0.001。由圖7a)可知,PtNPs可顯著抑制A375細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸酶活性。當(dāng)PtNPs的質(zhì)量濃度分別為0.1 μg/mL、1.0 μg/mL和5.0 μg/mL時,酪氨酸酶活性分別降低至70.62%、61.18%和44.96%,而杜仲葉提取物對A375細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性無明顯抑制作用。由圖7b)可知,當(dāng)A375細(xì)胞暴露于UVB下時,A375細(xì)胞內(nèi)的黑色素含量明顯增加。用PtNPs處理A375細(xì)胞后,黑色素含量明顯降低,表明PtNPs可抑制A375細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成,這進(jìn)一步證明了PtNPs具有抗酪氨酸酶活性。

圖6 PtNPs和杜仲葉提取物對A375細(xì)胞活力的影響Fig.6 Effects of PtNPs and Eucommia ulmoidesOliver leaf extract on A375 cell viability

目前,已有相關(guān)文獻(xiàn)[24-25]報道了AgNPs對酪氨酸酶的抑制作用,但鮮見關(guān)于PtNPs對酪氨酸酶活性的研究。AgNPs是商業(yè)化程度最高的納米粒子之一,廣泛應(yīng)用于家居用品、紡織品、化妝品等領(lǐng)域。然而,有研究[26]表明,AgNPs具有較高的細(xì)胞毒性。本研究合成的PtNPs細(xì)胞毒性較小,可顯著抑制體外和A375細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素的合成,有望達(dá)到皮膚美白的效果。

圖7 PtNPs的抗酪氨酸酶活性Fig.7 Anti-tyrosinase activity of PtNPs

3 結(jié)論

本文以杜仲葉提取物為還原劑和穩(wěn)定劑,采用一步法綠色合成了PtNPs,通過單因素試驗分析了反應(yīng)條件對PtNPs顏色和濃度的影響,并研究其對酪氨酸酶活性的影響。結(jié)果表明,在一定范圍內(nèi)改變反應(yīng)條件可調(diào)控PtNPs的顏色和質(zhì)量濃度,PtNPs的適宜制備條件為反應(yīng)時間60 min、反應(yīng)溫度90 ℃、氯鉑酸濃度3.5 mmol/L、杜仲葉提取物質(zhì)量濃度10.0 mg/mL;PtNPs粒徑的平均尺寸為(2.27±0.65) nm,具有面心立方結(jié)構(gòu),分布較均勻;PtNPs對體外酪氨酸酶活性有較強(qiáng)的抑制作用,IC50為(6.98±0.76) μg/mL,與標(biāo)準(zhǔn)美白劑曲酸相比,其對酪氨酸酶活性的抑制作用更強(qiáng),且明顯降低了A375細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸酶活性和UVB誘導(dǎo)的黑色素含量,即PtNPs可通過抑制酪氨酸酶活性來降低黑色素合成,達(dá)到皮膚美白的效果。

利用杜仲葉提取物綠色合成PtNPs可有效解決化學(xué)法使用有毒試劑及物理法成本高昂的問題,該方法簡單、高效、環(huán)保,制備的PtNPs適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,可為PtNPs應(yīng)用于美白類護(hù)膚品的開發(fā)提供理論參考。