周穎,成昕,寧軍,沈習習,王瑋*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院/國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京),江蘇 南京 210095;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,北京 100020;溫氏食品集團股份有限公司,廣東 云浮 527400)

鎮(zhèn)靜劑類藥物有時會被部分養(yǎng)殖戶濫用或非法用于動物高密度養(yǎng)殖、長途運輸?shù)?以促生長或緩解運輸應(yīng)激[1-2]。然而,該類藥物易殘留蓄積于動物體內(nèi),通過食物鏈進入人體后,會對人體產(chǎn)生一系列毒副作用,如頭暈嗜睡、呼吸抑制以及影響人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)等[3-5]。因此,美國、歐盟、國際食品法典委員會(CAC)等國家和組織均對鎮(zhèn)靜劑的檢出和最高殘留限量(maximum residue limits,MRL)做出了相關(guān)規(guī)定[6]。2020年,《中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號》[7]中關(guān)于食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單中也明確禁止使用安眠酮;《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量:GB 31650—2019》規(guī)定阿扎哌隆在豬肉中的MRL為60 μg·kg-1;氯丙嗪和地西泮僅允許使用治療劑量,但在動物源性食品中不得檢出[8]。我國現(xiàn)行有效的動物源性食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測標準相對較少,缺少對巴比妥類、吩噻嗪類及苯二氮卓類等多藥物同時檢出的方法,且樣品前處理也較為繁瑣、耗時。因此,建立準確高效且可同時檢測畜肉中多種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的方法就顯得尤為迫切和重要。

畜肉基質(zhì)較為復(fù)雜,篩選合適的樣品前處理方法有助于提高檢測靈敏度,減少基質(zhì)干擾。目前,動物性食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測的前處理方法主要有液-液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)[9]、固相萃取(solid-phase extraction,SPE)[10]、固相微萃取(solid phase micro extraction,SPME)[11]、QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)[12]等,前3種前處理方法雖可有效分離藥殘組分,但操作繁瑣耗時,定量檢測精確度低。QuEChERS方法具有操作簡單、快速高效、溶劑消耗量少及回收率高等優(yōu)點,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域[13-14]。已有的鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[15]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)[18-19]、氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)[20]等,其中LC-MS/MS和GC-MS/MS因其靈敏度高并可同時檢測多種化合物,已逐漸成為檢測多藥物殘留的主要方法[21]。與LC-MS/MS法相比,GC-MS/MS法因具有更好的抗干擾能力,分析結(jié)果準確可靠,適用于痕量物質(zhì)的檢測,且儀器成本低,操作簡單易于普及[22]。已有研究建立的GC-MS/MS法主要聚焦于檢測血漿和尿液基質(zhì)中的鎮(zhèn)靜劑類藥物[23-24],較少用于檢測動物性食品。因此,本研究基于QuEChERS前處理方法,構(gòu)建一種可同時檢測畜肉中16種鎮(zhèn)靜劑類藥物的GC-MS/MS法,旨在為我國動物性食品中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的高通量快速檢測以及食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持和保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉、牛肉、羊肉購于江蘇省南京市農(nóng)貿(mào)市場;陰性畜肉樣品由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉及肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(南京)提供。

標準品溶液:巴比妥、苯巴比妥、安眠酮、地西泮、氯丙嗪、氯氮卓、咪達唑侖、三氟拉嗪鹽酸鹽、阿扎哌隆、硝西泮、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪鹽酸鹽、氯硝西泮、氯氮平、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖(質(zhì)量濃度均為100 μg·mL-1)均購于天津阿爾塔科技有限公司。

試劑:乙腈、甲醇、氨水、乙酸乙酯、異丙醇(均為色譜純)購于上海安譜實驗科技股份有限公司;無水硫酸鈉(分析純)購于西隴化工股份有限公司;氯化鈉(分析純)購于廣東光華科技股份有限公司;檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7,分析純)購于上海源葉生物科技有限公司;檸檬酸二鈉倍半水合物(C6H6Na2O7·1.5H2O,分析純)購于德國CNW科技公司;十八烷基鍵合硅膠(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)購于德國CNW科技公司,粒徑均為40 μm;試驗用水均為一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000 Evo三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、TR-Pesticide Ⅱ毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),購于美國Thermo Fisher Scientific公司;arium?advance EDI純水儀、D-16C高速冷凍離心機、SECURA313-1CN電子天平購于德國Sartorious公司;Vortex Genius漩渦混勻器購于德國IKA公司;N-EVAP型氮吹儀購于美國Organomation公司;PTFE針頭過濾器(孔徑0.22 μm)購于南通邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制1)混合標準中間溶液(5 μg·mL-1):分別精確移取16種鎮(zhèn)靜劑標準品各0.5 mL于10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯稀釋定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1的混合標準中間溶液,-20 ℃避光保存,有效期30 d。

2)混合標準工作溶液(0.5 μg·mL-1):精確移取標準中間溶液0.1 mL于1 mL容量瓶中,用乙酸乙酯稀釋定容至1 mL,配制成質(zhì)量濃度為0.5 μg·mL-1的標準工作溶液,-20 ℃避光保存,有效期7 d。

3)純?nèi)軇┗旌蠘藴是€工作溶液:精確量取0.5 μg·mL-1的混合標準工作液適量,乙酸乙酯稀釋,分別配制質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1的系列混合標準工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

4)基質(zhì)匹配混合標準工作溶液:精確量取0.5 μg·mL-1的混合標準工作液適量,分別添加至經(jīng)提取、凈化步驟處理的7份空白試料復(fù)溶液中,配制質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng·mL-1的系列基質(zhì)匹配混合標準工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理1)提取:準確稱取5.00 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL提取劑,再加入一定量緩沖鹽包,振蕩渦旋2 min,4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min。

2)凈化:轉(zhuǎn)移上清液于裝有一定量吸附劑的50 mL離心管中,渦旋混勻1 min,4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min;再次轉(zhuǎn)移上清液于新的50 mL離心管中,在35～40 ℃下氮吹近干,加入1 mL乙酸乙酯復(fù)溶,振蕩渦旋1 min;取復(fù)溶液,經(jīng)0.22 μm PTFE針頭過濾器過濾后供GC-MS/MS測定使用。

1.3.3 樣品前處理條件優(yōu)化1)提取劑的優(yōu)化:均質(zhì)樣品中添加20 μg·kg-1混合標準溶液,按照1.3.2節(jié)方法進行樣品前處理,選用如下5種提取劑分別提取并分析不同提取劑的回收率:乙腈、1%氨水乙腈、乙酸乙酯、乙酸乙酯-異丙醇(5∶1,體積比)、甲醇。

2)緩沖鹽包的優(yōu)化:使用最佳提取試劑,按照1.3.2節(jié)方法進行樣品前處理,分析4種緩沖鹽包的萃取效果,4種緩沖鹽包為:緩沖鹽包A(2 g Na2SO4+1 g NaCl)、緩沖鹽包B(1 g C6H5Na3O7+0.5 g C6H6Na2O7·1.5H2O+2 g Na2SO4)、緩沖鹽包C(1 g C6H5Na3O7+0.5 g C6H6Na2O7·1.5H2O+2 g Na2SO4+1 g NaCl)、緩沖鹽包D(1 g C6H5Na3O7+0.5 g C6H6Na2O7·1.5H2O+4 g Na2SO4+1 g NaCl)。

3)吸附劑用量的優(yōu)化:在最佳提取條件下,按照1.3.2節(jié)方法進行樣品前處理,對PSA、C18及Na2SO4的用量進行優(yōu)化。選取5種吸附劑組合,分別為吸附劑組合A(2 g Na2SO4+0.2 g PSA+0.2 g C18)、吸附劑組合B(2 g Na2SO4+0.15 g PSA+0.1 g C18)、吸附劑組合C(2 g Na2SO4+0.1 g PSA+0.15 g C18)、吸附劑組合D(2 g Na2SO4+0.1 g PSA+0.05 g C18)、吸附劑組合E(2 g Na2SO4+0.1 g PSA),分析不同吸附劑用量的凈化效果。

1.3.4 GC-MS/MS檢測條件優(yōu)化1)氣相色譜條件優(yōu)化。色譜柱:TR-Pesticide Ⅱ毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣:高純氦氣(99.999%);恒流模式流速:1.0 mL·min-1;進樣方式:不分流進樣;進樣量:1 μL;進樣口溫度:300 ℃。將5 μg·mL-1的混合標準溶液注入儀器進樣口端,選取3種升溫程序方案:①初始溫度70 ℃,以50 ℃·min-1升溫至250 ℃,保持1 min,再以5 ℃·min-1升溫至300 ℃,保持5 min;②初始溫度70 ℃,以35 ℃·min-1升至200 ℃,再以5 ℃·min-1升至300 ℃,保持5 min;③初始溫度70 ℃,以50 ℃·min-1升至200 ℃,再以10 ℃·min-1升至300 ℃,保持5 min。通過分析16種藥物的分離效果,確定最佳升溫程序。

2)質(zhì)譜條件優(yōu)化。離子源:電子轟擊離子源(EI);電離能量:70 eV;離子源溫度:300 ℃;離子傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲時間:4 min;掃描離子范圍:40～550m/z;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitor,MRM)。在上述條件下,本試驗通過儀器AutoMRM功能模塊進行母離子、子離子及碰撞能量的優(yōu)化。

1.4 方法學驗證

1.4.1 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)ME是指樣品中其他成分對目標化合物質(zhì)量濃度的影響,即基質(zhì)對分析方法準確性的干擾[25]。以基質(zhì)匹配標準曲線斜率(k1)與純?nèi)軇藴是€斜率(k2)相對比值評價基質(zhì)效應(yīng),即ME=(k1/k2-1)×100%[26]。當|ME|在0%～25%時,說明基質(zhì)對待測物具有弱基質(zhì)效應(yīng),即基質(zhì)效應(yīng)不顯著;當|ME|在25%～50%時,說明基質(zhì)對待測物具有中等強度的基質(zhì)效應(yīng);當|ME|大于50%時,則說明基質(zhì)對待測物具有較強基質(zhì)效應(yīng),基質(zhì)效應(yīng)較顯著[27]。

1.4.2 線性范圍、檢出限及定量限的確定基于已建立的GC-MS/MS法,分別以陰性豬肉、牛肉、羊肉為基質(zhì),配制7個不同梯度質(zhì)量濃度(1～200 ng·mL-1)的混合基質(zhì)匹配標準工作溶液。以定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(Y),對應(yīng)溶液質(zhì)量濃度(ng·mL-1)為橫坐標(X),繪制標準曲線,求得回歸方程,計算平方相關(guān)系數(shù)(R2)。分別在陰性畜肉樣品中添加1 ng·mL-1混合標準溶液進行測定,以信噪比(S/N)=3計算各化合物的檢出限(limit of detection,LOD),以S/N=10計算各化合物的定量限(limit of quantitation,LOQ)[28]。

1.4.3 準確度和精密度試驗依據(jù)《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測:GB/T 27404—2008》,在陰性畜肉中分別添加3個水平(LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ)的混合標準品溶液,進行加標回收試驗,每個水平平行測6次,進行3次批間重復(fù)。計算平均回收率、批內(nèi)相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)和批間RSD。

1.4.4 方法的實際應(yīng)用選用市售生鮮肉20份,其中豬肉10份,牛肉、羊肉各5份。參照1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)分別對樣品進行前處理和上機測定,以驗證該方法的實際應(yīng)用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

2.1.1 提取試劑的優(yōu)化由圖1可知:乙腈在豬肉、牛肉和羊肉3種基質(zhì)中均具有最佳提取效果,其回收率在60%～120%的目標化合物數(shù)量最多。因此,本試驗選用乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 緩沖鹽包的優(yōu)化由圖2可知:緩沖鹽包C在3種基質(zhì)中均呈現(xiàn)最佳的萃取效果,其回收率在60%～120%的目標化合物數(shù)量最多。因此,本試驗選用緩沖鹽包C(1 g C6H5Na3O7+0.5 g C6H6Na2O7·1.5H2O+2 g Na2SO4+1 g NaCl)作為緩沖鹽包。

圖2 不同緩沖鹽包對16種鎮(zhèn)靜劑藥物回收率的影響Fig.2 Effect of different buffered salt packs on the recovery of 16 sedative drugs

2.1.3 吸附劑用量的優(yōu)化由圖3可知:吸附劑組合E在3種畜肉基質(zhì)中均具有最佳凈化效果,其所有目標化合物的回收率均為60%～120%。因此,本試驗選用吸附劑組合E(2 g Na2SO4+0.1 g PSA)作為凈化吸附劑。

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1 氣相色譜條件的確定由圖4可知:當升溫程序為方案①時,16種鎮(zhèn)靜劑藥物分離效果好,響應(yīng)高,無雜峰,可實現(xiàn)定性分析。

2.2.2 質(zhì)譜條件的確定本試驗在1.3.3節(jié)優(yōu)化的色譜條件下,將5 μg·mL-1的混合標準溶液以單針進樣方式注入GC-MS/MS中進行全掃描,選擇強度高的碎片離子作為母離子,再對母離子進行選擇反應(yīng)監(jiān)測模式掃描,選擇2個強度高且穩(wěn)定的碎片離子作為子離子,然后通過子離子優(yōu)化碰撞能量,最終確定16種鎮(zhèn)靜劑藥物的質(zhì)譜參數(shù)(表1)。按照上述條件,獲得16種鎮(zhèn)靜劑類藥物混合標準溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖,如圖5所示。

表1 16種鎮(zhèn)靜劑藥物的保留時間、定性離子對、定量離子對及碰撞能量Table 1 Retention time,qualitative ion pair,quantitative ion pair and collision energy of 16 sedative drugs

圖5 16種鎮(zhèn)靜劑藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)色譜圖Fig.5 Multiple reaction monitor chromatograms of 16 sedative drugs

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價

由表2可知:巴比妥、苯巴比妥、安眠酮、地西泮以及硝西泮在3種畜肉基質(zhì)中均呈現(xiàn)出基質(zhì)增強效應(yīng),而其他物質(zhì)則表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。其中,硝西泮在豬肉、牛肉、羊肉3種基質(zhì)中的|ME|分別為6.89%、3.46%、6.98%,說明其基質(zhì)效應(yīng)不顯著。此外,本試驗雖通過優(yōu)化前處理方法降低了基質(zhì)干擾,但苯巴比妥、安眠酮、氯丙嗪、氯硝西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖在3種畜肉基質(zhì)中仍表現(xiàn)為較強的基質(zhì)效應(yīng)(|ME|>50%),其中安眠酮的|ME|在牛肉和羊肉基質(zhì)中均高于160%。因此,為校正基質(zhì)效應(yīng)和提高結(jié)果準確性,本試驗最終采用基質(zhì)匹配標準曲線法。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

由表2可知:16種鎮(zhèn)靜劑藥物在1～200 ng·mL-1范圍內(nèi)線性范圍良好(R2≥0.992 8),檢出限為0.01～0.30 μg·kg-1,定量限為0.10～1.00 μg·kg-1。

2.5 方法的準確度和精密度

由表3可知:16種鎮(zhèn)靜劑藥物的回收率為64.83%～112.04%,批內(nèi)RSD為1.45%～8.96%,批間RSD為4.84%～14.88%,均符合方法學要求。

2.6 方法實際應(yīng)用評價

為驗證本方法的實際應(yīng)用效果,分別在批發(fā)市場和屠宰場隨機選取20份畜肉作為供試材料,采用本試驗建立的方法進行檢測。由表4可知:在1份豬肉和牛肉中均檢出巴比妥(1.58、0.77 μg·kg-1),1份羊肉中檢出阿扎哌隆(0.34 μg·kg-1),1份豬肉中檢出地西泮(未超過本方法LOQ:0.1 μg·kg-1);其他供試材料均未檢出16種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留。

表4 市售生鮮畜肉中鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of sedative drug residues for municipal sold fresh livestock meats μg·kg-1

3 討論

近年來,食品安全問題日益成為人們關(guān)注的焦點和熱點,其中動物性食品中獸藥殘留問題尤為顯著。鎮(zhèn)靜劑類藥物為禁用獸藥,但在動物養(yǎng)殖過程中違禁使用該類藥物的現(xiàn)象仍屢見不鮮。因此,亟需建立動物性食品中痕量鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留檢測方法。本研究基于GC-MS/MS法檢測了16種鎮(zhèn)靜劑藥物殘留,所有目標化合物無需衍生化就可實現(xiàn)較好的分離度和重現(xiàn)性,并采用QuEChERS法對樣品進行前處理,通過優(yōu)化提取劑、緩沖鹽包及吸附劑使用量,顯著降低了畜肉中蛋白質(zhì)、色素、脂肪等基質(zhì)干擾,有助于提高目標化合物的回收率。此外,與現(xiàn)有樣品前處理方法相比[29-30],本方法省略了正己烷除脂和過柱步驟,大大簡化并加快了樣品前處理過程,提高了檢測效率并降低了成本。

本試驗對市售生鮮畜肉檢測結(jié)果顯示,待測樣中檢出巴比妥、地西泮及阿扎哌隆等違禁獸藥,此類藥物嚴禁在動物飼料和飲用水中使用,且不得在動物源性食品中檢出[1]。究其原因可能是養(yǎng)殖戶受利益驅(qū)動,在養(yǎng)殖及運輸環(huán)節(jié)非法使用鎮(zhèn)靜劑類藥物,導致該類藥物在畜肉中殘留超標[31]。

本試驗構(gòu)建了一種QuEChERS結(jié)合GC-MS/MS高通量檢測畜肉中16種鎮(zhèn)靜劑藥物殘留的方法,16種鎮(zhèn)靜劑類藥物的檢出限為0.01～0.30 μg·kg-1,定量限為0.10～1.00 μg·kg-1,均低于其他文獻報道[32-33]。在0.10～10.00 μg·kg-1的加標水平下,16種藥物的平均回收率為64.83%～112.04%,批內(nèi)RSD為1.45%～8.96%,批間RSD為4.84%～14.88%。該方法的回收率和精密度均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測:GB/T 27404—2008》對回收率和精密度的要求[34]。該方法可實現(xiàn)市售畜肉中多種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留的高通量快速檢測,對于我國動物性食品國際貿(mào)易及保障消費者健康與安全具有重要意義。