金鑫 朱志

摘 ?要：采用QuEChERS技術(shù)提取畜肉中的伊維菌素（ivermectin，IVM），經(jīng)堿性氧化鋁固相萃取柱凈化后氮吹濃縮，以乙腈和2.5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，經(jīng)Kinetex C18色譜柱洗脫分離，采用電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式進行分析，建立超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜肉中IVM含量的分析方法。結(jié)果表明：在1.0～500.0 μg/kg添加量范圍內(nèi)，IVM質(zhì)譜響應(yīng)強度與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 7;檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg;加標回收率為94.7%～97.4%，相對標準偏差為1.0%～3.2%。該法前處理簡單、準確度高、精密度好，可為畜牧養(yǎng)殖和畜肉質(zhì)量安全監(jiān)控提供檢測方法。

關(guān)鍵詞：伊維菌素;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;QuEChERS;畜肉;殘留量測定

Abstract： This paper reports on the development of an analytical method for the determination of ivermectin residues in livestock meat using ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. Ivermectin from samples was extracted by the QuEChERS method， purified by solid phase extraction on an alkaline alumina column and concentrated by nitrogen blowing. Using a mobile phase consisting of acetonitrile and 2.5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution， the chromatographic separation was performed on a Kinetex C18 column. The analyte was detected by multiple reaction monitoring （MRM） with an electrospray ionization source in the positive ion mode. The results showed that the concentration of ivermectin in the range from 1.0 to 500.0 μg/kg showed a good linear relationship with mass spectral response values， with a correlation coefficient （r） of 0.9997. The limit of detection and limit of quantitation were 0.3 and 1.0 μg/kg， respectively. The recoveries for spiked samples were in the range from 94.8% to 97.4%， with relative standard deviations （RSDs） of 1.3% to 3.2%. The method had the advantages of simple pretreatment， high accuracy and good recovery， and it could be useful in animal husbandry and livestock meat quality and safety supervision.

Keywords： ivermectin; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; QuEChERS; livestock meat; residue determination

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190802-174

中圖分類號：TS251.7 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A ? ? ? ? ? ? ?文章編號：

伊維菌素（ivermectin，IVM），又名22，23-二氫阿巴美丁或依維菌素[1-2]，化學式為C48H74O14，是由鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物[3-5]，對體內(nèi)外寄生蟲，特別是線蟲和節(jié)肢動物具有良好的驅(qū)殺功效，是一種高效、廣譜、低毒抗生素類抗寄生蟲藥物[6-8]，廣泛用于治療家畜的胃腸線蟲病、牛皮蠅蛆、紋皮蠅蛆、羊鼻蠅蛆和豬、羊疥螨病[9-11]。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定IVM在牛腎臟組織中的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）為30 μg/kg;歐盟（EU）No418/2014號法規(guī)規(guī)定IVM在動物源性食品中的MRL為30～100 μg/kg;日本“食品中殘留農(nóng)業(yè)化學品肯定列表制度”規(guī)定IVM在牛、豬、馬、羊等畜肉中的MRL為10～100 μg/kg[6-7，9]。但IVM會通過動物飼料中添加、動物寄生蟲預防和治療等途徑導致家畜體內(nèi)IVM殘留，經(jīng)食物鏈進入人體，若長期誤食含有IVM殘留的家畜肉，將導致人體神經(jīng)系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)紊亂[12-14]，甚至威脅人類健康。因此，研究畜肉中IVM殘留量檢測方法對于指導IVM的安全及合理使用具有重要意義。

目前，IVM殘留量的測定方法有酶聯(lián)免疫吸附法[15-16]、液相色譜法[17-19]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-22]，其中酶聯(lián)免疫吸附法儀器簡單易攜、靈敏度高，但易出現(xiàn)假陽性，液相色譜-熒光法樣品前處理繁瑣，需衍生化，且靈敏度不高[23-24]，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有高靈敏度、高選擇性、抗干擾能力強等優(yōu)點，已成為藥物殘留分析研究中不可或缺的技術(shù)[25-26]。QuEChERS（quick， easy， cheap， effective， rugged， safe）是一種樣品快速前處理技術(shù)[27-29]，具有回收率高、精確度高、操作簡便等優(yōu)勢[30]。本研究采用QuEChERS技術(shù)提取牛肉、豬肉、馬肉、山羊肉和綿羊肉中的IVM，經(jīng)堿性氧化鋁固相萃取柱凈化后氮吹濃縮，以乙腈和2.5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，經(jīng)Kinetex C18色譜柱洗脫分離，采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）正離子模式進行分析，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定畜肉中IVM含量的分析方法，提供準確度高、靈敏度好的檢測技術(shù)，為畜牧養(yǎng)殖和畜肉質(zhì)量安全提供保障。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 材料與試劑

IVM標準物質(zhì)（純度均大于99%） ? 美國AccuStandard公司;甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙酸銨（均為色譜純） ? 美國Tedia公司;其余試劑均為分析純 ? 天津市科密歐化學試劑有限公司;牛肉、豬肉、馬肉、山羊肉、綿羊肉（各6 份） ? 烏蘭察布四子王旗農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 ? 儀器與設(shè)備

UPLC Xevo TQ MS超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 ? 美國Waters公司;S10高速勻漿機 ? 寧波新芝生物科技股份有限公司;CPA324S電子天平、Sartorius arium confort Ⅱ超純水器 ? 德國Sartorius公司;5810R高速冷凍離心機 ? 德國Eppendorf公司;WH-12水浴氮吹儀 ? 杭州佑寧儀器有限公司;堿性氧化鋁固相萃取柱（規(guī)格500 mg/6 mL） ? 天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.3 ? 方法

1.3.1 ? 樣品前處理

取新鮮或解凍的畜肉組織，剪碎，10 000 r/min勻漿1 min;準確稱取5.0 g勻漿后的畜肉，置于50 mL離心管中，依次加入20 mL純乙腈、5 g無水硫酸鎂、2 g氯化鈉和150 mg乙二胺-N-丙基硅烷（ethylenediamine-N-propyl silane，PSA），8 000 r/min勻漿10 min后，10 000 r/min離心5 min;上清液經(jīng)堿性氧化鋁柱凈化，收集流出液;用5 mL乙腈淋洗小柱，合并流出液，45 ℃氮吹近干，用乙腈定容至1 mL，0.22 μm微孔有機濾膜過濾，供UPLC-MS/MS測定。

1.3.2 ? 溶液配制

標準儲備液：準確稱取IVM標準品10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準儲備液。

1.3.3 ? 液相色譜條件

色譜柱為Kinetex C18（150 mm×2.1 mm，1.7 ?m）;流動相A為乙腈，流動相B為2.5 mmol/L乙酸銨水溶液;流速0.2 mL/min;進樣量10.0 μL;柱溫35 ℃。梯度洗脫程序：0～2.0 min，10%流動相A;2.0～4.0 min，10%～90%流動相A;4.0～5.0 min，90%流動相A;5.0～7.0 min，90%～10%流動相A;7.0～10.0 min，10%流動相A。

1.3.4 ? 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI，采用正離子掃描模式;采集模式：MRM;離子源溫度200 ℃;脫溶劑氣溫度600 ℃;毛細管電壓2.2 kV;碰撞氣：氬氣（純度>99.99%）;霧化氣：氮氣（純度>99.99%），流速3 mL/min;駐留時間0.05 s;定性離子對：890.3/305.1（m/z）;定量離子對：890.3/567.4（m/z）;錐孔電壓50 V;碰撞能量35 eV。

1.4 ? 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復6 次，結(jié)果表示為平均值，采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? QuEChERS提取溶劑和凈化柱的選擇

根據(jù)IVM的理化性質(zhì)，結(jié)合QuEChERS方法，分析甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷6 種溶劑以及混合型陽離子柱（MCX）、混合型陰離子柱（MAX）、中性氧化鋁柱（AluN）、酸性氧化鋁柱（AluA）和堿性氧化鋁柱（AluB）5 種固相萃取柱對畜肉中IVM的提取和凈化效果。結(jié)果表明：乙腈、丙酮和乙酸乙酯對畜肉中IVM均具有較好的提取效果，提取回收率為85.7%～98.6%，但甲醇和乙酸乙酯提取液雜質(zhì)峰較多，后續(xù)固相萃取凈化效果不理想，這可能是由于畜肉中高含量的脂肪和蛋白質(zhì)對IVM吸附所致;乙腈提取液雜質(zhì)峰較少，后續(xù)固相萃取凈化完全，這可能是由于乙腈極性較大，對畜肉中蛋白質(zhì)沉淀效果好，提取回收率為98.6%;堿性氧化鋁柱對IVM的凈化效果最好，加標回收率最高，達99.3%。因此選擇乙腈作為提取溶劑，選擇堿性氧化鋁作為凈化柱。

2.2 ? UPLC色譜柱的選擇

在相同流動相條件下，以色譜柱的IVM色譜響應(yīng)值、分離度和重復性為指標，分析安捷倫Eclipse XDB C18、迪馬Endeavorsil C18、沃特世BEH C18、飛諾美Kinetex C18等不同商品化UPLC柱對畜肉中IVM的分離效果。

由表1可知：采用Kinetex C18色譜柱不僅可以有效分離IVM，而且目標峰響應(yīng)值高、重復性好;采用相同粒徑（1.7 ?m）和內(nèi)徑（2.1 mm）的Kinetex C18色譜柱時，短柱（50、100 mm）分析時間較短，但個別復雜基質(zhì)樣品中目標物的峰形較差，而150 mm柱分析時間適中、重復性好，可有效提高復雜基質(zhì)樣品中共提取基質(zhì)成分與IVM的分離效果，有效提高IVM的測定準確度和重復性。故分析柱選擇Kinetex C18（150 mm×2.1 mm，1.7 ?m）色譜柱。

2.3 ? 流動相的選擇

以Kinetex C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.7 ?m）為分析柱，分析甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇/乙腈-不同濃度（1.5～3.0 mmol/L）乙酸銨溶液等流動相對畜肉中IVM的分離效果及質(zhì)譜響應(yīng)情況。由圖1可知：有機相選用乙腈比選用甲醇具有更良好的峰形和響應(yīng)值;水相選用乙酸銨水溶液比純水、0.1%甲酸水溶液更容易使IVM形成帶正電荷的分子離子峰[M+NH4]+，且質(zhì)譜響應(yīng)值良好，尤其是采用2.5 mmol/L乙酸銨水溶液時，IVM的分離效果良好，保留時間適中，且色譜峰峰形尖銳、對稱。故選擇乙腈-2.5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相。

2.4 ? 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以在線流動注射方式將質(zhì)量濃度1.0 μg/mL IVM標準溶液注入ESI離子源中，分別在ESI+和ESI-模式下進行質(zhì)譜分析（母離子掃描）。結(jié)果表明：在ESI+模式下可產(chǎn)生帶正電荷的分子離子峰[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+和[M+H+H2O]+，其中[M+NH4]+分子離子峰響應(yīng)值高、抗干擾，故選擇[M+NH4]+作為母離子（m/z 890.3）（一級質(zhì)譜分析）;對母離子[M+NH4]+進行子離子掃描，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，獲得相對強度較大的碎片離子m/z 305.1、m/z 307.1和m/z 567.4，其中m/z 305.1結(jié)構(gòu)式可能為C14H25O7，m/z 567.4結(jié)構(gòu)式可能為C34H47O7（二級質(zhì)譜分析）。結(jié)果表明，選擇ESI+模式，母離子為m/z 890.3，定性子離子為m/z 305.1;定量子離子為m/z 567.4。

2.5 ? 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）

為提高本研究所建立的UPLC-MS/MS法測定畜肉中IVM的特異性，降低樣品基質(zhì)對IVM測定的干擾，采用標準添加法，用IVM在畜肉和純乙腈2 種不同基質(zhì)中的響應(yīng)值比值（ME=A/B×100%，其中A為畜肉中IVM的響應(yīng)值，B為純乙腈中IVM的響應(yīng)值）來評估ME。若90%110%時，表明存在基質(zhì)減弱或基質(zhì)增強效應(yīng)。

由表2可知，采用本研究所建UPLC-MS/MS法測定IVM的ME為93.4%～104.6%，即不存在基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 ? 線性范圍、檢出限與定量限

用不含目標物的空白基質(zhì)依次配制IVM質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、50.0、250.0、500.0 ng/mL的標準溶液，按本研究所建立的UPLC-MS/MS法測定，以IVM質(zhì)譜響應(yīng)強度（y）為縱坐標，以IVM質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，在1.0～500.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，IVM質(zhì)譜響應(yīng)強度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=3.24×105x+2.25×103（r=0.999 7）。在不含目標物的空白畜肉基質(zhì)中添加低添加量的IVM標準物質(zhì)，采用國際純粹與應(yīng)用化學聯(lián)合會規(guī)定的檢出限和定量限測定方法，平行測定20 次，以信噪比（RS/N）=3為檢出限，RS/N=10為定量限。結(jié)果表明，檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

2.7 ? 加標回收率和精密度

在不含目標物的空白牛肉、豬肉、馬肉、山羊肉、綿羊肉中分別加入IVM標準物質(zhì)，每種畜肉中IVM添加量分別為1.0、250.0、500.0 μg/kg，按本研究所建立的UPLC-MS/MS法測定加標回收率和精密度（n=6）。

由表3可知，在1.0～500.0 μg/kg添加量范圍內(nèi)，IVM的平均加標回收率為94.7%～97.4%，RSD為1.0%～3.2%。

2.8 ? 實際樣品測定與分析

針對隨機選購的30 份畜肉，按本研究所建立的UPLC-MS/MS法測定畜肉中IVM含量。由圖3可知，30 份被檢畜肉中，2 份畜肉檢出IVM殘留（其余28 份樣品檢測結(jié)果為陰性），檢出量分別為5.8、13.7 μg/kg，說明目前所售畜肉中存在IVM殘留風險。鑒于IVM在禽畜體內(nèi)吸收、分布、轉(zhuǎn)化和消除均需要一段時間，為避免畜肉中IVM殘留量超標，必須嚴格執(zhí)行休藥期。

2.9 ? 與現(xiàn)有方法的比較

以使用儀器、分析對象、檢出限、回收率和精密度為評估指標，將本研究所建立的UPLC-MS/MS法與現(xiàn)有國家標準及文獻報道中的測定方法進行比較。由表4可知，不同方法適用于不同基質(zhì)樣品，本研究所建立的UPLC-MS/MS法在回收率、RSD、檢出限等方面均符合方法學要求，且該方法準確度高、精密度好。

3 ? 結(jié) ?論

采用QuEChERS技術(shù)提取畜肉中的IVM，經(jīng)堿性氧化鋁固相萃取柱凈化，Kinetex C18色譜柱洗脫分離，建立UPLC-MS/MS法測定畜肉中IVM殘留量的分析方法。該方法樣品前處理簡單、準確度高、精密度好，可為畜牧養(yǎng)殖和畜肉質(zhì)量安全監(jiān)控提供檢測方法。

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