黃蓉蓉 瞿珊珊 郭鴻 陳蘇衡 楊傳奇 張俊妹 李玉蘭

摘要：目的 探討不同時間高濃度氧對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞線粒體能量代謝的影響。方法 將大鼠RLE-6TN細(xì)胞分為對照組（21% O2常規(guī)培養(yǎng)4 h）、高氧1、2、3、4 h組（95% O2分別培養(yǎng)1、2、3、4 h）。采用熒光素酶化學(xué)發(fā)光法檢測各組細(xì)胞的三磷酸腺苷（ATP）含量，采用微量法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合體V活性，熒光探針JC-1檢測細(xì)胞線粒體膜電位，實(shí)時熒光定量PCR法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合體 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的核心亞基NADH脫氫酶亞基1（ND1）、細(xì)胞色素b（Cytb）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（COXI）、ATP酶6（ATPase6）mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組比較，高氧1、2、3、4 h組細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體核心亞基ND1（q=24.800，P＜0.001；q=13.650，P＜0.001；q=9.869，P＜0.001；q=20.700，P＜0.001）、COXI（q=16.750，P＜0.001；q=10.120，P＜0.001；q=8.476，P＜0.001；q=14.060，P＜0.001）及ATPase6 mRNA（q=22.770，P＜0.001；q=15.540，P＜0.001；q=12.870，P＜0.001；q=18.160，P＜0.001）表達(dá)水平均顯著降低；且高氧1、4 h組細(xì)胞ATPase活性受到抑制（q=9.435，P＜0.001；q=11.230，P＜0.001），ATP含量降低（q=5.615，P=0.007；q=5.029，P=0.005）；而高氧2、3 h組細(xì)胞ATPase活性（q=0.156，P=0.914；q=3.197，P=0.116）及ATP含量（q=0.859，P=0.557；q=1.273，P=0.652）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組細(xì)胞線粒體膜電位之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.303，P=0.869）。結(jié)論 短時間高氧會抑制呼吸鏈復(fù)合體核心亞基表達(dá)并降低ATPase活性，導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞能量代謝障礙。

關(guān)鍵詞：高氧；線粒體；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞；能量代謝

中圖分類號： R614.2+7? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）01-0009-07

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15096

Excess Oxygen Supply for Different Time Periods Affect Energy Metabolism in Rat Alveolar Epithelial Type Ⅱ Cells

HUANG Rongrong1，QU Shanshan1，GUO Hong1，CHEN Suheng1，YANG Chuanqi1，ZHANG Junmei1，LI Yulan2

1The First School of Clinical Medical，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

2Department of Anesthesiology，the First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Corresponding author：LI Yulan Tel：13519625065，E-mail：jasm@sina.com

ABSTRACT：Objective To observe the effect of excess oxygen supply for different time periods on the mitochondrial energy metabolism in alveolar epithelial type Ⅱ cells.Methods Rat RLE-6TN cells were assigned into a control group （21% O2 for 4 h） and excess oxygen supply groups （95% O2 for 1，2，3，and 4 h，res-pectively）.The content of adenosine triphosphate （ATP），the activity of mitochondrial respiratory chain complex V，and the mitochondrial membrane potential were determined by luciferase assay，micro-assay，and fluorescent probe JC-1，respectively.Real-time fluorescence quantitative PCR was employed to determine the mRNA levels of NADH dehydrogenase subunit 1 （ND1），cytochrome b （Cytb），cytochrome C oxidase subunit I （COXI），and adenosine triphosphatase 6 （ATPase6） in the core subunits of mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，and Ⅴ，respectively.Results Compared with the control group，excess oxygen supply for 1，2，3，and 4 h down-regulated the mRNA levels of ND1 （q=24.800，P<0.001；q=13.650，P<0.001；q=9.869，P<0.001；q=20.700，P<0.001），COXI （q=16.750，P<0.001；q=10.120，P<0.001；q=8.476，P<0.001；q=14.060，P<0.001），and ATPase6 （q=22.770，P<0.001；q=15.540，P<0.001；q=12.870，P<0.001；q=18.160，P<0.001）.Moreover，excess oxygen supply for 1 h and 4 h decreased the ATPase activity （q=9.435，P<0.001；q=11.230，P<0.001） and ATP content （q=5.615，P=0.007；q=5.029，P=0.005）.The excess oxygen supply for 2 h and 3 h did not cause significant changes in ATPase activity （q=0.156，P=0.914；q=3.197，P=0.116） and ATP content （q=0.859，P=0.557；q=1.273，P=0.652）.There was no significant difference in mitochondrial membrane potential among the groups （F=0.303，P=0.869）.Conclusion Short-term excess oxygen supply down-regulates the expression of the core subunits of mitochondrial respiratory chain complexes and reduces the activity of ATPase，leading to the energy metabolism disorder of alveolar epithelial type Ⅱ cells.

Key words：excess oxygen supply；mitochondria；alveolar epithelial type Ⅱ cell；energy metabolism

Acta Acad Med Sin，2023，45（1）：9-15

在全身麻醉過程中，患者高氧血癥的發(fā)生率可達(dá)83%［1］。相關(guān)研究表明，長時間暴露于超生理水平氧分壓下會導(dǎo)致肺組織的氧化應(yīng)激損傷［2-4］。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（alveolar epithelial type Ⅱ cell，AEC Ⅱ）是高氧介導(dǎo)肺損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)［5］，同時也是AEC Ⅰ的祖細(xì)胞［6］，在肺發(fā)育和損傷修復(fù)過程中具有重要作用［7］。線粒體是細(xì)胞能量代謝的核心，AEC Ⅱ能量代謝異?？赡苡绊懫浜铣?、修復(fù)功能，參與肺組織損傷的病理過程。有研究發(fā)現(xiàn)高氧4 h后小鼠肺泡上皮細(xì)胞呼吸鏈復(fù)合體酶活性及氧化磷酸化水平降低，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成減少［8］；高氧6 h后肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)紊亂［9］。但Farrow等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在95%的高氧條件下，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體基質(zhì)內(nèi)活性氧在15 min內(nèi)顯著增加，30 min時達(dá)到最大［10］，可見線粒體對高氧非常敏感，而高氧4 h內(nèi)是否影響AEC Ⅱ 的能量代謝尚不清楚。因此，本研究體外培養(yǎng)大鼠AEC Ⅱ 建立高氧細(xì)胞模型，檢測4 h內(nèi)不同時間點(diǎn)細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合體和能量代謝變化趨勢，探究高氧肺損傷的形成機(jī)制。

材料和方法

材料 細(xì)胞株RLE-6TN購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，為永生化大鼠AEC Ⅱ。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素、0.25%胰酶均購自上海逍鵬生物科技有限公司；MolPure Cell/Tissue Total RNA試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；實(shí)時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒（JC-1）、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；ATP檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組 RLE-6TN細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶80%～90%時，用胰酶消化并傳代，一般2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后采用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為對照組（21% O2常規(guī)培養(yǎng)4 h）、高氧1、2、3、4 h組（95% O2分別培養(yǎng)1、2、3、4 h）。

ATP含量檢測 收集各組細(xì)胞加入200 μl ATP裂解液，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 g離心5 min取上清液；黑色96孔板中加入100 μl ATP檢測液，靜止3～5 min后每孔加20 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，采用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品中ATP的濃度，最后計(jì)算ATP濃度與BCA法檢測樣品蛋白濃度的比值，以μmol/mg表示。

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測 收集各組細(xì)胞以800 r/min（r=6 cm）的速率離心3 min，棄掉上清液，隨后采用微量法按照線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性檢測試劑盒說明書測定各組細(xì)胞ATP酶（ATP synthase，ATPase）的活性，同時測定各組細(xì)胞的蛋白濃度，以消除由于樣本中蛋白量的差異而造成的誤差。最后根據(jù)試劑盒說明書公式計(jì)算ATPase的濃度，以U/mg prot表示。

MMP檢測 收集各組細(xì)胞加入1 ml培養(yǎng)液和1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；吸除上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入2 ml培養(yǎng)液，在倒置熒光顯微鏡下觀察。MMP較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；MMP較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，以單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光。采用Image J分析平均熒光強(qiáng)度，計(jì)算紅色平均熒光強(qiáng)度/綠色平均熒光強(qiáng)度的比值來反應(yīng)MMP變化。

qRT-PCR檢測 收集各組細(xì)胞，采用MolPure Cell/Tissue Total RNA試劑盒提取總RNA并測定濃度，HiScript Ⅱ Q RT SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR測定。以GAPDH作為內(nèi)參，擴(kuò)增基因?yàn)镹ADH脫氫酶亞基1（NADH dehydrogenase subunit 1，ND1）、細(xì)胞色素b（cytochrome b，Cytb）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ，COXI）、ATPase6。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s和60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。qRT-PCR引物序列見表1。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)? 果

細(xì)胞內(nèi)ATP含量 對照組，高氧1、2、3、4 h組細(xì)胞ATP含量分別為（0.44±0.02）、（0.37±0.01）、（0.45±0.03）、（0.46±0.03）、（0.38±0.01）μmol/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.170，P=0.001）。與對照組比較，高氧1、4 h組細(xì)胞ATP含量明顯降低（q=5.615，P=0.007；q=5.029，P=0.005），而2、3 h組細(xì)胞ATP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.859，P=0.557；q=1.273，P=0.652）；與高氧1 h組比較，高氧2、3 h組細(xì)胞ATP含量明顯升高（q=6.474，P=0.005；q=6.888，P=0.005），而4 h組細(xì)胞ATP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.586，P=0.687）；與高氧4 h組比較，高氧2、3 h組細(xì)胞ATP含量明顯升高（q=5.888， P=0.005；q=6.302，P=0.006）。

線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ活性 對照組，高氧1、2、3、4 h組細(xì)胞ATPase活性分別為（148.10±7.36）、（109.40±10.57）、（148.70±4.16）、（135.00±8.32）、（102.00±1.32）U/mg prot，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.240，P＜0.001）。與對照組比較，高氧1、4 h組細(xì)胞ATPase活性明顯降低（q=9.435，P＜0.001；q=11.230，P＜0.001），而2、3 h組細(xì)胞ATPase活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.156，P=0.914；q=3.197，P=0.116）；與高氧1 h組比較，高氧2、3 h組細(xì)胞ATP含量明顯升高（q=11.230，P＜0.001；q=9.591，P=0.001），而高氧4 h組細(xì)胞ATP含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=1.793，P=0.234）；與高氧4 h組比較，高氧2、3 h組細(xì)胞ATPase活性明顯升高（q=11.380，P＜0.001；q=8.032，P＜0.001）。

熒光探針檢測MMP變化 熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，對照組及高氧1、2、3、4 h組細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度比值分別為4.320±0.641、4.149±1.023、4.371±0.599、4.585±0.397、4.649±0.260，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.303，P=0.869）（圖1）。

ND1、Cytb、COXI和ATPase6的mRNA表達(dá) 對照組及高氧1、2、3、4 h組細(xì)胞ND1（F=93.650，P＜0.001）、COXI（F=41.080，P＜0.001）和ATPase6 mRNA（F=73.420，P＜0.001）表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Cytb mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.280，P=0.058）。與對照組比較，高氧1、2、3、4 h組細(xì)胞ND1（q=24.800，P＜0.001；q=13.65，P＜0.001；q=9.869，P＜0.001；q=20.700，P＜0.001）、COXI（q=16.750，P＜0.001；q=10.120，P＜0.001；q=8.476，P＜0.001；q=14.060，P＜0.001）及ATPase6 mRNA（q=22.770，P＜0.001；q=15.540，P＜0.001；q=12.870，P＜0.001；q=18.160，P＜0.001）表達(dá)水平明顯降低；與高氧1 h組比較，高氧2、3 h組細(xì)胞ND1（q=11.160，P＜0.001；q=14.940，P＜0.001）、COXI（q=6.625，P=0.002；q=8.273，P=0.001）和ATPase6 mRNA（q=7.225，P=0.001；q=9.897，P＜0.001）表達(dá)水平明顯升高，高氧4 h組ND1（q=4.107，P=0.016）、ATPase6 mRNA（q=4.612，P=0.009）表達(dá)水平明顯升高，而COXI mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.688，P=0.087）；與高氧4 h組比較，高氧2、3 h組細(xì)胞ND1（q=7.052，P＜0.001；q=10.830，P＜0.001）、COXI（q=3.938，P=0.019；q=5.585，P=0.007）及高氧3 h組ATPase6 mRNA（q=5.285，P=0.010）表達(dá)水平明顯增高，而高氧2 h組ATPase6 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.613，P=0.094）（圖2）。

討? 論

長時間高氧暴露會導(dǎo)致多器官損傷，尤其是肺損傷［11］。高氧性肺損傷的機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全清楚。Garcia等［8］研究表明，高氧4 h會引起線粒體動力學(xué)、能量代謝等功能紊亂，但是4 h以內(nèi)高氧是否會影響線粒體功能尚不清楚。本研究基于外科常規(guī)手術(shù)時間［12-14］、既往研究［15-16］及預(yù)實(shí)驗(yàn)制備了高氧RLE-6TN細(xì)胞模型，探究4 h內(nèi)的高氧暴露對AEC Ⅱ能量代謝的影響，結(jié)果顯示高氧1 h AEC Ⅱ線粒體呼吸鏈復(fù)合體核心亞基ND1、COXI、ATPase6 mRNA表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞總ATP合成急劇減少，ATPase活性降低；高氧持續(xù)2～3 h線粒體功能和酶活性代償性增高；高氧4 h細(xì)胞ATP含量又進(jìn)一步下降，能量合成障礙，表明短時間高氧可抑制AEC Ⅱ的能量代謝，參與高氧肺損傷的發(fā)生。

線粒體呼吸鏈?zhǔn)羌?xì)胞合成ATP的主要結(jié)構(gòu)，ATP合成體系由2個電子載體（輔酶Q和Cytc）及位于線粒體內(nèi)膜上的復(fù)合體Ⅰ～Ⅴ組成，其中復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ具有質(zhì)子泵功能，傳遞電子的同時驅(qū)動質(zhì)子從線粒體基質(zhì)跨過內(nèi)膜進(jìn)入膜間隙，同時形成MMP。質(zhì)子通過線粒體復(fù)合體Ⅴ（ATPase）時驅(qū)動二磷酸腺苷與Pi結(jié)合并釋放ATP。由線粒體DNA編碼的13條多肽中包括線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ上的核心亞基ND1、Cytb、COXI和ATPase6［17-18］，是組成線粒體呼吸鏈復(fù)合體的主要成分，在電子傳遞及線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)過程中起著重要作用，一旦受損可破壞呼吸鏈復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)及ATP合成障礙［17］。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，暴露于高氧的大鼠肺泡細(xì)胞線粒體耗氧量減少，復(fù)合體 Ⅰ 和 Ⅱ 的活性分別降低77%和63%，ATP合成減少［19-20］；同樣，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示高氧降低了小鼠肺泡上皮細(xì)胞（MLE-12）對底物的利用率，抑制呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ功能，導(dǎo)致氧化磷酸化水平降低及ATP合成減少［8，21］，提示線粒體氧化磷酸化在高氧狀態(tài)下受到顯著抑制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AEC Ⅱ細(xì)胞在高氧4 h以內(nèi)能量代謝呈雙向改變：高氧1 h能量代謝出現(xiàn)顯著“頓抑”現(xiàn)象，2～3 h有代償性增高，4 h再次出現(xiàn)降低；同時，ATPase活性和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ的核心亞基ND1、COXI、ATPase6 mRNA表達(dá)水平與ATP含量變化趨勢一致。由此可知短時間高氧暴露可引起線粒體能量代謝障礙，從而參與高氧肺損傷的病理過程。

然而，本研究中呼吸鏈復(fù)合體Ⅲ核心亞基Cytb的表達(dá)及MMP在高氧4 h內(nèi)均未發(fā)生明顯的變化，這與Garcia等［8］及Resseguie等［22］研究結(jié)果一致。Cytb表達(dá)可能與細(xì)胞類型、高氧暴露的時間及對氧化應(yīng)激刺激的敏感性不同有關(guān)。MMP是反映細(xì)胞內(nèi)線粒體功能狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，是線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件。Audi等［23］將大鼠暴露于95%的高氧48 h后發(fā)現(xiàn)肺組織線粒體發(fā)生去極化，即MMP降低；同樣Zhu等［24］發(fā)現(xiàn)高氧24 h顯著降低了人肺泡上皮細(xì)胞MMP。而本研究中MMP表達(dá)沒有明顯變化，這可能是因?yàn)槎虝r間高氧只影響了細(xì)胞的氧化磷酸化，并未對線粒體結(jié)構(gòu)造成廣泛損傷［8］，或是線粒體在呼吸鏈損傷的狀態(tài)下通過糖酵解產(chǎn)生ATP來維持MMP［25］。

Garcia等［8］在探究高氧4 h對MLE-12細(xì)胞線粒體功能的影響時發(fā)現(xiàn)，在總的氧化磷酸化水平降低、ATP生成減少的同時，線粒體內(nèi)、外膜融合蛋白轉(zhuǎn)錄增加，而線粒體分裂蛋白未發(fā)生改變，從而導(dǎo)致線粒體質(zhì)量增加。線粒體代謝學(xué)與動力學(xué)關(guān)系密切，已有研究證實(shí)線粒體融合是對線粒體代謝失調(diào)的保護(hù)性反應(yīng)［26］。本研究中高氧2～3 h代償性增高的原因及機(jī)制是否與線粒體動力學(xué)有關(guān)，還需進(jìn)一步探究。

AEC Ⅱ功能呈能量依賴性，AEC Ⅱ內(nèi)線粒體數(shù)量是Ⅰ型細(xì)胞的31倍，線粒體體積是其他肺組織細(xì)胞的3倍［27］。高氧引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)線粒體DNA突變或缺失［28］，線粒體呼吸鏈酶活性降低，引起AEC Ⅱ 能量代謝失衡，從而造成肺表面活性物質(zhì)分泌不足，AEC Ⅱ 分化、修復(fù) Ⅰ 型細(xì)胞能力受損［29-30］。因此，高氧誘導(dǎo)線粒體功能障礙引起的AEC Ⅱ能量代謝紊亂，可能是造成高氧肺損傷的原因之一。

綜上，本研究結(jié)果表明，短時間高氧雖然會出現(xiàn)損傷后代償效應(yīng)，但代償后仍會導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合體核心亞基ND1、COXI及ATPase6的表達(dá)降低及線粒體ATPase的活性被抑制，進(jìn)而干擾AEC Ⅱ 能量代謝，參與高氧肺損傷的病理過程。但本研究未進(jìn)一步探究線粒體動力學(xué)及其與能量代謝之間的關(guān)系，未來還需要對高氧肺損傷時線粒體功能相關(guān)表型和機(jī)制的變化進(jìn)行深入分析。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-05-06）