李梁 陳桂珍

【摘 要】目的 檢測氟離子植入豬骨來源羥基磷灰石（PHA）對小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1）黏附、增殖及成骨分化的影響。方法 取豬骨松質(zhì)用高溫燒結(jié)的方法制備PHA，使用氟化鈉浸泡結(jié)合二次高溫燒結(jié)進行氟離子植入，制備獲得氟化豬骨源羥基磷灰石（FPHA）骨塊，進行研磨獲得顆粒材料后制備壓片，采用PHA顆粒制備的壓片為對照組，采用FPHA顆粒制備的壓片為實驗組。在壓片材料表面接種小鼠MC3T3-E1前成骨細胞株，通過掃描電鏡SEM觀察不同時間細胞黏附形態(tài)，CCK-8法檢測細胞增殖情況，RT-PCR法檢測細胞成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶ALP、骨鈣素BGLAP、骨橋蛋白OPN mRNA的表達情況。結(jié)果 掃描電鏡SEM觀察可見，PHA與FPHA組細胞黏附生長良好；兩組細胞接種1、7d后OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FPHA組接種3、5 d后OD值高于PHA組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)PHA組細胞接種3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表達水平均高于PHA組，且兩組細胞接種7 d后材料表面細胞ALP與BGLAP mRNA表達水平均高于細胞接種3 d后，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 PHA與FPHA材料均具有良好的細胞相容性，氟離子植入豬骨羥基磷灰石可促進小鼠前成骨細胞早期增殖與成骨分化。

【關(guān)鍵詞】氟離子；羥基磷灰石；成骨細胞；黏附；增殖；成骨分化

中圖分類號：R783.1 文獻標識碼：A 文章編號：1004-4949（2023）16-0001-04

Effects of Fluoride Incorporation into Porcine Hydroxyapatite on Adhesion， Proliferation and Osteogenic Differentiation of MC3T3-E1 Cells

LI Liang， CHEN Gui-zhen

（Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmacological University， Guangzhou 510080， Guangdong， China）

【Abstract】Objective To evaluate the effects of fluorine incorporation into porcine hydroxyapatite （PHA） on attachment， proliferation and osteogenic differentiation of rat pre-osteoblast cell line MC3T3-E1. Methods PHA was fabricated from porcine bone by thermal treatment. Fluorine incorporation was carried out by sodium fluoride immersion and a second stage thermal treatment. The fluorinated porcine hydroxyapatite （FPHA） bone blocks were prepared， grinded to obtain particle materials， and then prepared into tablets. The tablets prepared by PHA particles were used as the control group， and the tablets prepared by FPHA particles were used as the experimental group. Mouse MC3T3-E1 pre-osteoblast cell line was inoculated on the surface of the tableting material. The cell adhesion morphology at different times was observed by scanning electron microscopy （SEM）. The cell proliferation was detected by CCK-8 method. The expression of osteogenic related genes alkaline phosphatase ALP， osteocalcin BGLAP and osteopontin OPN mRNA was detected by RT-PCR. Results SEM observation showed that the cells in the PHA and FPHA groups adhered and grew well. There was no significant difference in OD value between the two groups on 1st and 7th days after cell inoculation （P>0.05）. The OD value of FPHA group was higher than that of PHA group on 3rd and 5th days after cell inoculation， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The results of RT-PCR showed that the expression levels of ALP and BGLAP mRNA in FPHA group were higher than those in PHA group on 3rd and 7th days after cell inoculation， and the expression levels of ALP and BGLAP on the surface of the two groups on 7th day after cell inoculation were higher than those on 3rd day after cell inoculation， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion PHA and FPHA materials have good cell compatibility. Fluorine incorporation into porcine hydroxyapatite can promote the early proliferation and osteogenic differentiation of mouse preosteoblasts.

【Key words】Fluorine； Hydroxyapatite； Osteoblast； Adhesion； Proliferation； Osteogenic differentiation

動物骨來源羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是口腔臨床應用最廣泛的骨組織替代材料之一，主要由天然骨經(jīng)物理化學手段去除有機物后制備獲得，具有良好的生物相容性和骨傳導性，在體內(nèi)可被緩慢降解并引導成骨[1，2]。但由于其缺乏骨誘導性，研究人員試圖對其改性以更好地滿足骨缺損修復的臨床需求。離子摻雜（植入）可改變磷灰石材料的理化與生物學性能，是目前磷灰石材料改性研究的熱點。氟元素是骨形成及骨基質(zhì)礦化的必需元素，可通過不同的機制影響骨代謝，包括通過降解釋放到體液中參與骨改建，在植骨材料表面與植骨受區(qū)直接刺激成骨或破骨細胞活性，直接刺激成骨細胞合成相關(guān)蛋白等[3]。同時，氟也可促進磷灰石晶體的形成和生長，并對骨組織的礦化起促進作用[4]。因此，氟離子植入可能是提高磷灰石材料成骨效能的有效方案。然而，目前仍缺乏比較成骨細胞對FPHA和HA材料反應的相關(guān)研究。本實驗在前期已制備完成豬骨源羥基磷灰石PHA與氟離子植入豬骨源羥基磷灰石FPHA的基礎上，通過觀察PHA與FPHA兩種材料對小鼠前骨細胞MC3T3-E1早期黏附、增殖及成骨分化的影響，評估FPHA新材料的體外生物學性能，旨在加強對不同生物材料的骨傳導機制的理解，并為開發(fā)用于醫(yī)學植入的更好骨傳導生物材料提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 PHA及FPHA壓片的制備

1.1.1 PHA與FPHA骨顆粒的制備 取成豬股骨頭松質(zhì)骨，高壓鍋內(nèi)煮30 min后取出，去盡軟組織晾干，以30%雙氧水浸泡24 h，雙蒸水沖洗；再以100%酒精浸泡24 h，取出干燥，將骨塊研磨并收集直徑約0.25～1 mm的骨顆粒，以程序控溫馬弗爐（西格瑪公司，SGM6812BK，洛陽）燒結(jié)至800 ℃（升溫速率10 ℃/min，在空氣中維持加熱2 h），自然冷卻至常溫后取出。將PHA顆粒浸泡于0.25 mol/L氟化鈉溶液24 h后，二次高溫燒結(jié)至700 ℃（升溫速率10 ℃/min，在空氣中維持加熱3 h），冷卻后以去離子水清洗浸泡3次，24 h/次，然后置于80 ℃干燥箱整夜干燥，制備獲得FPHA顆粒[5，6]。

1.1.2 PHA與FPHA壓片制備 秤取200 mg骨粉，利用旋轉(zhuǎn)式壓片機制備為直徑8 mm、厚2 mm圓形片狀。放入48孔板中后進行紙塑包裝，以25 KGy劑量進行鈷60γ射線滅菌備用。其中，采用PHA顆粒制備的壓片為對照組（PHA組），采用FPHA顆粒制備的壓片為實驗組（FPHA組）。

1.2 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)與接種 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)小鼠前骨細胞株MC3T3-E1（中國科學院上海細胞庫）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco，美國）及1%青鏈霉素（Sigma，美國）的α-MEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone，美國）中，在37 ℃、5%CO2、95%濕度細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，3 d后換液，細胞鋪板80%左右傳代，將第3～5代細胞應用于細胞黏附、增殖與成骨分化檢測。觀察MC3T3-E1細胞在PHA組與FPHA組壓片表面黏附形態(tài)、MC3T3-E1細胞在PHA與FPHA組壓片表面增殖情況、MC3T3-E1細胞在PHA與FPHA組壓片成骨相關(guān)基因表達。

1.3 MC3T3-E1細胞在PHA與FPHA壓片表面黏附形態(tài)觀察 取懸浮于50 μl培養(yǎng)基中約5×104個細胞接種于各壓片表面，細胞培養(yǎng)箱中靜置30 min，待細胞貼壁后每孔加入250 μl培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別于接種后4 h與24 h后棄培養(yǎng)基，2.5%電鏡專用戊二醛固定2 h，PBS漂洗3次后，酒精梯度脫水（30%、50%、70%、90%、100%），15 min/次，丙酮置換酒精30 min，醋酸異戊酯置換丙酮30 min，CO2臨界點干燥，噴金鍍膜后通過掃描電鏡（FEI，Quanta 200，荷蘭）觀察MC3T3-E1細胞在PHA與FPHA壓片表面的黏附形態(tài)。

1.4 CCK-8評估MC3T3-E1細胞在PHA與FPHA壓片表面增殖情況 將PHA及FPHA壓片放入48孔板中，表面加入500 μl培養(yǎng)基預浸泡24 h后吸出，取懸浮于50 μl培養(yǎng)基中約2×104個細胞接種于各壓片表面，細胞培養(yǎng)箱中靜置30 min，待細胞貼壁后每孔加入250 μl培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞接種1、3、5、7 d后吸盡原培養(yǎng)基，每孔加入300 μl新鮮培養(yǎng)基與30 μl CCK8試劑（DOJINDO，同仁化學研究所，日本），避光孵育60 min后每孔取100 μl加入96孔板。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長下測定各孔光密度值（OD值），OD值即代表增殖的相對細胞數(shù)量。

1.5 RT-PCR檢測MC3T3-E1細胞在PHA與FPHA壓片成骨相關(guān)基因表達 將MC3T3-E1細胞分別接種在PHA與FPHA壓片3、7 d，RT-PCR檢測細胞成骨分化相關(guān)基因ALP、BGLAP、OPN的表達水平：為了提取足夠數(shù)量的總RNA，每組中5個壓片為1個樣本，通過Trizol（Invitrogen，美國）進行總RNA的提?。荒孓D(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa BIOINC，日本）進行逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。通過ABI 750（ABI，美國）熒光定量PCR儀檢測ALP、BGLAP、OPN基因表達水平，內(nèi)參為GAPDH。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件處理本研究數(shù)據(jù)，進行兩組獨立樣本資料t檢驗，檢驗水準α=0.05；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MC3T3-E1細胞黏附形態(tài) PHA組與FPHA組細胞正常黏附生長，24 h細胞充分延展，呈多邊形，伸出大量偽足與材料緊密粘附，并可見細胞間相互連接，見圖1。

2.2 兩組MC3T3-E1細胞增殖情況 兩組細胞接種1 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；FPHA組接種3、5 d后OD值優(yōu)于PHA組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組細胞接種7 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖2。

2.3 兩組MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)基因表達 FPHA組細胞接種3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表達水平均高于PHA組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組細胞接種7 d后材料表面細胞ALP與BGLAP mRNA表達水平均高于細胞接種3 d后，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；兩組細胞接種3、7 d后OPN mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見圖3。

3 討論

從來源上看，HA可分為化學合成羥基磷灰石與生物骨來源羥基磷灰石（BHA）兩類，后者是指由動物骨組織經(jīng)物理和（或）化學手段去除有機物后制備獲得[3]。牛骨來源的羥基磷灰石已在局部頜骨缺損修復中廣為應用，如口腔種植修復治療中的上頜竇提升、拔牙位點保存、種植位點增加骨量等。在用于制備BHA的生物供體當中，豬骨與人骨的成分相似度高，有其他動物骨無法相比的天然多孔結(jié)構(gòu)，本研究制備豬骨來源PHA、FPHA并研究其生物學性能，探索一種新的骨替代材料。

細胞黏附是生物材料與生物體相互作用的第一階段，對隨后的遷移、增殖、分化非常關(guān)鍵，更快的黏附可通過競爭機制減少細菌感染的機會，材料的理化性影響細胞的早期黏附，包括材料親水性、表面粗糙度、孔隙率等。粗糙的表面具有更高的表面能，較表面能低的表面更有利于細胞的黏附和延展[5]，本實驗中制備的PHA、FPHA組壓片在掃描電鏡下顯示出多孔隙的粗糙表面，MC3T3-E1細胞在接種至材料表面2 h后呈現(xiàn)良好的黏附狀態(tài)，提示兩種材料均有良好的細胞相容性。在細胞增殖實驗中，兩組細胞接種1 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），根據(jù)MC3T3-E1細胞的細胞學特征，在接種24 h內(nèi)為黏附及緊密結(jié)合過程，其后進入早期增殖，細胞倍增周期為2～3 d，且實驗操作中兩種材料接種細胞數(shù)量相當，黏附時間一致，本研究認為此階段兩種材料對細胞增殖的影響尚不明顯；FPHA組接種3、5 d后OD值優(yōu)于PHA組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明FPHA組細胞增殖較PHA組快，分析其原因為FPHA組釋放氟離子促進了細胞增殖。兩組細胞接種7 d后OD值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），考慮是由于壓片容納細胞數(shù)量有限，細胞融合達到80%以上后出現(xiàn)細胞增殖抑制。回顧有關(guān)氟離子研究的相關(guān)文獻，大多數(shù)學者認為低濃度的氟離子對成骨有促進作用，高濃度的氟抑制成骨[6]。本實驗在制備條件中氟濃度為0.25 mol/L，制得材料在細胞黏附實驗中被證明有良好的細胞相容性，在細胞增殖實驗中此氟濃度可促進細胞增殖。細胞成骨分化相關(guān)基因檢測中，F(xiàn)PHA組細胞接種3、7 d后ALP、BGLAP mRNA表達水平均高于PHA組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。堿性磷酸酶是一組膜結(jié)合蛋白，在堿性環(huán)境中可以水解為一系列單磷酸酯，具有轉(zhuǎn)磷酸基的作用。與成骨分化相關(guān)的ALP是一種細胞外酶，通過水解有機磷酸酯為細胞外基質(zhì)礦化過程中磷灰石的沉積提供足夠的磷酸根，因此在體外鈣化過程中起著決定性的作用，ALP是細胞成骨分化的重要早期標志。骨鈣素是一種由成骨細胞產(chǎn)生的非膠原蛋白激素[7]，因此常被用作骨形成過程的標志物。在許多研究中，BGLAP被用作判斷給定藥物促進骨形成能力的生物標志物[8]。本研究實驗結(jié)果提示氟植入材料能促進表面細胞的早期成骨分化。

綜上所述，PHA與FPHA均具有良好的細胞相容性，MC3T3-E1能在兩種材料表面黏附生長。氟離子植入豬骨羥基磷灰石可促進MC3T3-E1細胞的增殖與早期成骨分化。

參考文獻

[1] Szcze？ A，Ho？ysz L，Chibowski E.Synthesis of hydroxyapatite for biomedical applications[J].Adv Colloid Interface Sci，2017，249：321-330.

[2] Shang S，Zhao Q，Zhang D，et al.Molecular dynamics simulation of the adsorption behavior of two different drugs on hydroxyapatite and Zn-doped hydroxyapatite[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2019，105：110017.

[3] Wang JF， Zhou HZ， Tang GH， et al. Reducing the inhibitive effect of fluorine and heavy metals on nitrate reduction by hydroxyapatite substrate in constructed wetlands[J].J Hazard Mater，2023，446：130692.

[4] Zhang J，Shishatskaya EI，Volova TG，et al.Polyhydroxyalkanoates （PHA） for therapeutic applications[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2018，86：144-150.

[5] Li T，Hao L，Li J，et al.Insight into vitronectin structural evolution on material surface chemistries： The mediation for cell adhesion[J].Bioact Mater，2020，5（4）：1044-1052.

[6] Lin Z，Cao Y，Zou J，et al.Improved osteogenesis and angiogenesis of a novel copper ions doped calcium phosphate cement[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2020，114：111032.

[7] Sun D，Xu W，Liang C，et al.Smart Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe for Monitoring Cellular Alkaline Phosphatase Activity during Osteogenic Differentiation[J].ACS Sens，2020，5（6）：1758-1767.

[8] Lin X，Hunziker EB，Liu T，et al.Enhanced biocompatibility and improved osteogenesis of coralline hydroxyapatite modified by bone morphogenetic protein 2 incorporated into a biomimetic coating[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2019，96：329-336.

編輯 胡錦英