竇婷, 鄧林紅△, 王翔△

(1.常州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院,常州 213164;2.常州大學(xué) 藥學(xué)院,常州 213164;3.常州大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,常州 213164)

0 引言

生物組織是一種復(fù)雜、非均一的結(jié)構(gòu)[1-2]。因膠原纖維排列不同而顯示出不同的致密化水平和硬度[3]。由高度排列的I型膠原組成的肌腱組織硬度高[4-5],而由各向同性的膠原纖維組成的組織,如肝[6]、腎[7]或動(dòng)脈壁[8]等,相對(duì)更柔軟。組織硬度是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能(如干細(xì)胞分化[9],癌癥侵襲[10]和纖維化進(jìn)展[11])的重要生物力學(xué)因素之一。較軟基質(zhì)[12]有利于間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞;中等硬度促進(jìn)肌源性分化;硬質(zhì)基質(zhì)促進(jìn)成骨分化[13];血管的生成受基底硬度調(diào)節(jié)[4];腫瘤細(xì)胞簇[14]通常包裹于致密而堅(jiān)硬的細(xì)胞外基質(zhì)中,并以此充當(dāng)屏障,免受化療藥物的影響[15]。故此,對(duì)組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)致密化水平的研究具有重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。

力學(xué)微環(huán)境是組織非均一性結(jié)構(gòu)形成的重要調(diào)節(jié)因素[16-17]。在無(wú)外界力學(xué)約束的情況下,微組織自由收縮。其中,細(xì)胞和膠原蛋白呈隨機(jī)分布。在由四個(gè)微柱構(gòu)成的垂直雙軸約束條件下[18],微組織缺乏單向的細(xì)胞和基質(zhì)纖維排列,因此,保持機(jī)械各向同性[19]。而雙微柱裝置[20]產(chǎn)生的單軸力學(xué)約束,可誘導(dǎo)微組織在約束方向上形成與各向異性相關(guān)的細(xì)胞和纖維排列[4,21]。因此,可通過(guò)改變培養(yǎng)過(guò)程中的力學(xué)邊界條件來(lái)控制微組織致密化[22]過(guò)程中基質(zhì)的各向異性。但是,閉合二維邊界條件如何影響微組織的非均一性結(jié)構(gòu)形成,尚不清楚。本研究設(shè)計(jì)并制備了一種正方形聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)微弦裝置。該閉合邊界條件可產(chǎn)生非均一的力學(xué)約束。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PDMS微結(jié)構(gòu)上的3T3和膠原混合物在48 h后,自發(fā)收縮形成穩(wěn)定的微組織。在不同約束區(qū)域中,細(xì)胞排列及細(xì)胞外基質(zhì)均具有明顯差異,且導(dǎo)致不同的大分子通透性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Sylgard 184(Dow Corning公司);三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷、鬼筆環(huán)肽(Af647-Phalloidin)、4 kDa、40 kDa (FITC-dextran)葡聚糖(Sigma公司);聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA),單分散熒光微球(阿拉丁生化科技股份有限公司);鼠尾I型膠原 (Advanced Biomatrix公司);杜氏改良培養(yǎng)基 (dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶 (Gibco公司);硅脂 (Baysilone公司);細(xì)胞增殖試劑盒 (碧云天生物技術(shù)有限公司);Fibronectin Rabbit Polyclonal Antibody (Abcam公司)。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);生物安全柜(BSC-1304ⅡA2,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(LSM 710)(德國(guó) Zeiss公司);原子力顯微鏡(JPK Nanowizard3,德國(guó)Bruker公司);等離子清洗機(jī)(Potentlube PT-5S,深圳三和波達(dá)機(jī)電科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1PDMS微弦的制備 首先,將Sylgard 184和交聯(lián)劑以10∶1比例混合并澆筑在硅模具上,高溫固化后得到PDMS微弦負(fù)模。再將PDMS負(fù)模表面涂布1% PVA的脫模劑。將PDMS預(yù)聚物加入負(fù)模的微槽內(nèi),80 ℃固化4 h后,正方形微弦四角位置粘合4個(gè)2 mm高的PDMS圓形支持塊。四個(gè)支持塊通過(guò)等離子處理,鍵合于一個(gè)18 mm圓形蓋玻片上。將裝置浸泡在水中過(guò)夜后,剝離反模得到PDMS微弦結(jié)構(gòu)。最后將微弦裝置放置于12孔培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2細(xì)胞及微組織培養(yǎng) NIH-3T3成纖維細(xì)胞(7-12代)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。I型膠原蛋白經(jīng)pH中性調(diào)解后與一定數(shù)量的細(xì)胞混合,得到終濃度為106細(xì)胞/mL和2 mg/mL膠原蛋白的混合物。4 ℃條件下,將20 μL細(xì)胞膠原混合物滴加于微弦中央位置,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱固化50 min后,再向培養(yǎng)孔板中加入2 mL培養(yǎng)基,然后置于培養(yǎng)箱或顯微鏡下進(jìn)行長(zhǎng)期成像。

1.2.3微弦收縮的力學(xué)仿真計(jì)算 使用COMSOL Multiphysics模擬正方形微弦因微組織收縮而產(chǎn)生的應(yīng)力分布。微組織收縮48 h后獲取圖像中一條微弦邊界的形變進(jìn)行函數(shù)擬合,得到y(tǒng)=(-6E-05)x2+0.205 9x+286.96為微弦的應(yīng)變函數(shù)。設(shè)置微弦內(nèi)區(qū)域?yàn)榭蓧嚎s超彈性材料 (密度為1 kg/m3,楊氏模量為380 Pa,Neo-Hookean模型),建立平面應(yīng)力模型計(jì)算。

1.2.4微組織的活細(xì)胞成像及透光率變化測(cè)量 倒置熒光顯微鏡的多點(diǎn)成像載物臺(tái)可同時(shí)對(duì)12孔板內(nèi)的多個(gè)微組織目標(biāo)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)自動(dòng)成像。顯微鏡的環(huán)境維持在37 ℃和5% CO2。使用5×/0.16 NA物鏡和ORCA-Flash 4.0相機(jī)(日本濱松)進(jìn)行相成像(1 h/幀)。使用Image J測(cè)量不同時(shí)間正方形微組織對(duì)角線之間的灰度值變化,量化微組織不同區(qū)域的透光率。

1.2.5細(xì)胞增殖檢測(cè) 微組織培養(yǎng)48 h后,加入10 μM的EDU(5-乙炔基-2′-脫氧尿苷)增殖試劑[23]孵育12 h,將EDU結(jié)合到新合成的DNA中。微組織經(jīng)固定、通透化處理后,加入反應(yīng)液,室溫避光染色3 h;加入Hoechst溶液,室溫避光染色1 h;最后使用3% BSA洗滌3次/5 min。用Zeiss 710共聚焦顯微鏡于10×/0.3 NA或20×/0.5 NA物鏡下分別在綠色(488 nm)和藍(lán)色(405 nm)通道對(duì)微組織3D成像。使用Image J對(duì)圖像進(jìn)行高斯處理,對(duì)微組織100 μm深度的區(qū)域進(jìn)行量化分析,計(jì)算單位面積下EDU陽(yáng)性和細(xì)胞總數(shù)的比率。

1.2.6熒光成像和圖像分析 微組織培養(yǎng)48 h后,對(duì)其固定、通透化和封閉處理。使用結(jié)合Alexa Fluor Plus 647的鬼筆環(huán)肽(phalloidin-AF647)與DAPI對(duì)F-actin和細(xì)胞核室溫避光染色3 h,最后使用PBS洗3次/10 min。用Zeiss 710共聚焦顯微鏡于20×/0.5 NA物鏡下,分別在紅色(633 nm)和藍(lán)色(405 nm)通道對(duì)微組織3D成像。使用Image J對(duì)微組織100 μm深度區(qū)域的細(xì)胞排列分布和細(xì)胞核密度進(jìn)行量化分析。

微組織纖連蛋白(Fibronectin)免疫熒光染色:微組織培養(yǎng)48 h后,對(duì)其固定、通透化和封閉處理,FN一抗4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。使用PBS洗3次/5 min,AF488 G-ANTI-Rb二抗室溫孵育4 h。再用結(jié)合Alexa Fluor Plus 647的鬼筆環(huán)肽(phalloidin-AF647)與DAPI對(duì)F-actin和細(xì)胞核室溫避光染色3 h,最后使用PBS洗3次/10 min。用Zeiss 710共聚焦顯微鏡于10×/0.3 NA物鏡下,分別在綠色(488 nm)、紅色(633 nm)和藍(lán)色(405 nm)通道對(duì)微組織3D成像。通過(guò)Image J將微組織Z軸進(jìn)行投影成像,量化組織內(nèi)部到組織邊界的熒光強(qiáng)度。

1.2.7微組織楊氏模量測(cè)量 微組織培養(yǎng)48 h后,使用0.5% TritonX-100室溫處理1 h,去除細(xì)胞活性。將微組織取下并反向粘在載玻片上(注意微組織的距離與初始狀態(tài)相同),用AFM探針(MLCT-O10)對(duì)樣品進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn)。設(shè)定在50×50 μm范圍內(nèi)采集4×4個(gè)測(cè)點(diǎn),在每個(gè)微組織直角和中心區(qū)域取3～5個(gè)位置進(jìn)行測(cè)量,得到力-距離曲線。用JPK數(shù)據(jù)處理軟件確定微組織的彈性模量。

1.2.8FITC-葡聚糖擴(kuò)散檢測(cè) 制備細(xì)胞膠原混合物時(shí),加入0.5%的單分散熒光微球(546 nm),用于標(biāo)記微組織輪廓。微組織培養(yǎng)48 h后,分別加入0.5 mg/mL的4 kDa或40 kDa FITC葡聚糖分子。用Zeiss 710共聚焦顯微鏡于10×/0.3 NA 物鏡下分別在紅色 (561 nm)和綠色(488 nm)通道對(duì)微組織3D成像。使用Image J對(duì)微組織100 μm深度的區(qū)域進(jìn)行量化分析,計(jì)算其相對(duì)熒光強(qiáng)度(1 h時(shí)微組織的熒光強(qiáng)度/10 min微組織的熒光強(qiáng)度)。

2 結(jié)果

2.1 正方形微弦約束下微組織的形成

為了解生長(zhǎng)在正方形微弦上的微組織受力情況,對(duì)微弦裝置進(jìn)行力學(xué)仿真計(jì)算。由圖1(a)左圖可知,對(duì)正方形微弦加載收縮力后,正方形直角區(qū)域產(chǎn)生較高的應(yīng)力,而正方形中心區(qū)域的張力較小。因此,正方形內(nèi)應(yīng)力呈非均一分布,可誘導(dǎo)微組織非均一結(jié)構(gòu)的生成。在成功制備懸空的正方形PDMS微弦裝置后(見(jiàn)圖1(a)右圖),將細(xì)胞-膠原混合物加載到正方形微弦中,并進(jìn)行活細(xì)胞時(shí)間成像。由圖1(b)可知,微組織在成纖維細(xì)胞的作用下持續(xù)收縮,48 h后形成一個(gè)近似正方形的微組織結(jié)構(gòu)。微組織內(nèi)部的透光率由于致密化而逐漸下降。其中,直角區(qū)域的透光率低于中央?yún)^(qū)域(見(jiàn)圖1(c)),提示微組織逐漸形成了非均一結(jié)構(gòu)。

2.2 微組織內(nèi)細(xì)胞的非均一性

為進(jìn)一步研究該微組織的非均一性,本研究首先聚焦于微組織內(nèi)細(xì)胞的空間分布。通過(guò)用熒光鬼筆環(huán)肽核標(biāo)記細(xì)胞微絲骨架,發(fā)現(xiàn)在正方形微組織的直角區(qū)域,細(xì)胞排列顯示出高度的各向同性,與張力呈90 °分布。而在微組織中心區(qū)域,細(xì)胞則呈各向異性排列,見(jiàn)圖2(a)。此外,本研究還通過(guò)細(xì)胞核染色對(duì)微組織不同區(qū)域的細(xì)胞密度進(jìn)行了測(cè)量,結(jié)果顯示,兩區(qū)域中細(xì)胞個(gè)數(shù)基本在380左右,其細(xì)胞分布無(wú)顯著性差異,見(jiàn)圖2(b)。

圖2 微組織不同區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的非均一性

為研究力學(xué)約束是否影響微組織內(nèi)細(xì)胞增殖的速度,在正方形微組織收縮培養(yǎng)48 h時(shí),本研究使用EDU標(biāo)記增殖細(xì)胞的DNA。圖2(c)中,實(shí)線框表示微弦的位置,虛線框表示微組織內(nèi)的直角和中心區(qū)域。共聚焦成像顯示,微組織邊界區(qū)域的EDU陽(yáng)性率高。通過(guò)計(jì)算EDU標(biāo)記的細(xì)胞核與總細(xì)胞核數(shù)量的比值,對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示,微組織直角區(qū)域的細(xì)胞增殖率為12.37%,中間區(qū)域的細(xì)胞增殖率為11.08%,無(wú)顯著性差異。

2.3 微組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的非均一性

為表征微組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的非均一性,本研究對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的纖連蛋白(Fibronectin)進(jìn)行測(cè)定。圖3(a)中,實(shí)線表示微弦的位置,虛線框表示熒光強(qiáng)度的位置。免疫熒光成像顯示,微組織中心區(qū)域到直角區(qū)域的纖連蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸增加。由圖2(b)可知,中心區(qū)域到直角區(qū)域中細(xì)胞數(shù)量接近,直角區(qū)域的纖連蛋白水平較高,可能是由于該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生了較多的纖連蛋白。

圖3 微組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的非均一性

組織硬度是反映細(xì)胞外基質(zhì)致密化水平的重要力學(xué)指標(biāo)。因此,本研究使用AFM探針?lè)謩e對(duì)微組織的直角區(qū)域和中心區(qū)域進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn),測(cè)量其楊氏模量,見(jiàn)圖3(b)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,微組織直角區(qū)域楊氏模量為378.04 Pa,比中心區(qū)域的楊氏模量113.59 Pa高出2倍左右,證明微組織直角區(qū)域的致密化程度高于中央?yún)^(qū)域。

2.4 微組織非均一性對(duì)分子擴(kuò)散的影響

上述研究證實(shí)正方形力學(xué)約束可導(dǎo)致微組織內(nèi)非均一結(jié)構(gòu)的形成。為研究微組織非均一性對(duì)大分子擴(kuò)散的影響,本研究向微組織培養(yǎng)基中加入熒光標(biāo)記的葡聚糖,使用共聚焦顯微鏡分別對(duì)微組織不同區(qū)域內(nèi)100 μm深的區(qū)域進(jìn)行成像,見(jiàn)圖4(a)。通過(guò)定量分析10～60 min微組織的熒光變化,發(fā)現(xiàn)4 kDa葡聚糖在微組織中心區(qū)域的擴(kuò)散速度高于直角區(qū)域,見(jiàn)圖4(b),說(shuō)明對(duì)比力學(xué)約束低的區(qū)域,力學(xué)約束高的大分子通透性更高。然而,40 kDa葡聚糖的擴(kuò)散速度不僅顯著低于4 kDa葡聚糖,在不同力學(xué)約束區(qū)域中也未顯示出明顯差異,表明力學(xué)約束對(duì)組織通透性的影響程度還取決于擴(kuò)散物質(zhì)的分子量。

圖4 微組織非均一性對(duì)分子擴(kuò)散的影響

3 結(jié)束語(yǔ)

胚胎發(fā)育及組織創(chuàng)傷愈合[24]過(guò)程中普遍存在致密組織的漸進(jìn)形成[25],表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)劇烈的形態(tài)變化和組織剛度的提高[26]。該過(guò)程不僅受生化因子的調(diào)控,還受細(xì)胞的收縮力和微環(huán)境張力之間的平衡以及由此產(chǎn)生的復(fù)合力場(chǎng)的調(diào)控。本研究利用正方形PDMS微弦產(chǎn)生的力學(xué)約束誘導(dǎo)微組織形成非均一結(jié)構(gòu),從細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)兩個(gè)角度對(duì)其非均一結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果顯示,3D環(huán)境中細(xì)胞排列受力學(xué)約束的調(diào)控,呈現(xiàn)出垂直于力場(chǎng)的各向同性分布現(xiàn)象,這可能是細(xì)胞為減少機(jī)械牽拉而作出的適應(yīng)性反應(yīng)。此外,細(xì)胞密度和增殖在不同力學(xué)約束條件下,未發(fā)生明顯變化。在對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)研究中,纖連蛋白豐度及微組織硬度都顯示出與力學(xué)約束的相關(guān)性,即較高的力學(xué)約束會(huì)導(dǎo)致較高的組織致密化水平。組織致密化不僅參與組織發(fā)育和修復(fù),還與腫瘤等病理過(guò)程密切相關(guān)。過(guò)度致密化的細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)阻礙分子擴(kuò)散,進(jìn)而影響大分子藥物接近靶細(xì)胞[15]。本研究使用熒光標(biāo)記的葡聚糖[27]模擬大分子藥物,發(fā)現(xiàn)4 kDa的大分子在微組織低力學(xué)約束區(qū)域具有較高的擴(kuò)散速度,在高力學(xué)約束區(qū)域的擴(kuò)散速度降低至與40 kDa的大分子相當(dāng)?shù)乃?。該結(jié)果將有助于后續(xù)進(jìn)一步了解大分子藥物在組織內(nèi)的傳遞。