熊晨崴,周鑫疊,周超,張俊杰,王皓,黃勇△

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 骨科,常州 213000; 2.南京醫(yī)科大學(xué) 常州醫(yī)學(xué)中心,常州 213000;3.大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院,大連 116000;4.共和縣中醫(yī)院 骨科,青海省海南藏族自治州共和縣 811800;5.常州大學(xué) 醫(yī)學(xué)與健康工程學(xué)院,常州 213164)

0 引言

植入型醫(yī)療器械在臨床上廣泛使用,若使用前其表面滅菌不徹底,極易造成微生物被膜的粘附,且難以去除,一旦植入患者體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致患者體內(nèi)細(xì)菌感染,危害患者健康[1-3]。因此,為防止植入型醫(yī)療器械表面微生物被膜的形成,最有效的方法是在醫(yī)療器械表面涂覆抗菌涂層[4-5]。傳統(tǒng)抗菌涂層通常采用兩種方式構(gòu)建,即:(1)表面修飾親水性聚合物[6],如聚乙二醇(PEG)、聚(甲基丙烯酸羧基乙酯)或聚N-乙烯基吡咯烷酮,以減少蛋白質(zhì)和細(xì)菌吸附;(2)表面修飾金屬離子[7]、NO抗菌劑[8]等,通過(guò)藥物釋放或接觸等抗菌。由于醫(yī)療器械在運(yùn)輸、儲(chǔ)存或臨床使用過(guò)程中易受劃痕、摩擦等破壞,導(dǎo)致表面抗菌涂層脫落,失去抗菌作用,限制了抗菌醫(yī)療器械的臨床應(yīng)用。為此,有必要設(shè)計(jì)具有自愈合特性的抗菌涂層[9-10]。

層層自組裝技術(shù)(layer-by-lager,LbL)具有自愈合的特性,該技術(shù)由相鄰電荷的聚電解質(zhì)交替的多層結(jié)構(gòu)構(gòu)建而成,其愈合特性主要通過(guò)異電荷聚電解質(zhì)層之間的靜電力和離子作用力下發(fā)生鏈段的遷移運(yùn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)。目前,國(guó)內(nèi)外多個(gè)課題組報(bào)道了采用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建表面抗菌涂層的研究,實(shí)現(xiàn)了良好的自愈合和抗菌效果[3,11-12]。但層層自組裝抗菌涂層在動(dòng)態(tài)的生理環(huán)境中極易脫落,失去抗菌作用,這是由于其自組裝層內(nèi)的聚電解質(zhì)層因非共價(jià)鍵作用可逆斷開(kāi)所致。因此,有必要構(gòu)建一種既不影響自愈合性能,又具有較好結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的自組裝抗菌涂層。

周超等[16]在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的自愈合抗菌涂層上有了一定研究,本研究在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了涂層制備工藝,采用呋喃結(jié)構(gòu)的咪唑鹽聚離子液體(PILF)作為聚陽(yáng)離子電解質(zhì)層和高效抗菌劑,以含有馬來(lái)酰亞胺的聚丙烯酸(PAAF)作為聚陰離子電解質(zhì)層,通過(guò)層層自組裝技術(shù)構(gòu)建多層結(jié)構(gòu);然后以末端修飾有馬來(lái)酰亞胺的聚乙二醇(MPEG)與聚陽(yáng)離子電解質(zhì)層發(fā)生“Diels-Alder”點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng),將自組裝層交聯(lián),賦予其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、快速自愈性和長(zhǎng)期抗生物膜的效果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料

乙烯基咪唑-3-溴乙烷根據(jù)文獻(xiàn)自制,鹽酸多巴胺(99%)、聚乙二醇(PEG,Mn= 6 000 g/mol)、聚丙烯酸(PAA,MW=100 000 g/mol)、溴丁烷(99%)、呋喃-2-羧酸鈉(99%)、偶氮二異丁氰(AIBN,99%)、糠胺(99%)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS, 99%)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,99%)、4-二甲氨基吡啶(DMAP,99%)、三乙胺(99%)和其他化學(xué)品均從上海阿拉丁生化科技股份有限公司購(gòu)買(mǎi),并按接收方式使用。

1.2 呋喃結(jié)構(gòu)的咪唑鹽聚離子液體合成

首先,將乙烯基咪唑-3-溴乙烷(4.12 g,20.00 mmol),AIBN(0.03 g,0.20 mmol)溶于20 mL甲醇中,氮?dú)獗Ｗo(hù)下60 ℃反應(yīng)12 h,聚合物在丙酮中沉淀;接著,在DMF中與等量的呋喃-2-羧酸鈉混合,與溴離子發(fā)生離子交換;然后,用去離子水透析24 h,以去除過(guò)量的呋喃-2-羧酸鈉;最后,冷凍干燥后,得到呋喃羧酸咪唑鹽聚離子液體(PILF)。

1.3 合成聚丙烯酸接枝2-呋喃胺(PAAF)

首先,PAA(1.00 g,0.01 mmol)溶于磷酸鹽緩沖鹽水(50 mL,pH 7.4)攪拌2 h;其次,依次加入NHS(0.32 g,2.80 mmol)和EDC(0.54 g,2.80 mmol),在室溫下快速攪拌6 h;接著,加入 2-呋喃胺(0.27 g,2.80 mmol),在37 ℃下再攪拌48 h;然后,用去離子水透析2 d,經(jīng)冷凍干燥后得到該產(chǎn)品。

1.4 雙馬來(lái)酰亞胺聚乙二醇(MPEG)的合成

首先,將PEG(5.88 g,0.98 mmol)溶于二氯甲烷(30 mL),同時(shí)常溫下滴加三乙胺(0.30 g,2.94 mmol)和DMAP(0.36 g,2.94 mmol);其次,將3-馬來(lái)酰亞胺丙酰氯(0.55 g,2.94 mmol)溶解在二氯甲烷(30 mL)中,冰浴條件下恒速滴加到上述PEG溶液中;接著,在室溫下攪拌混合物過(guò)夜;然后,分別用鹽酸溶液1 M(50 mL)、飽和碳酸氫鈉溶液(50 mL)、飽和NaCl溶液(50 mL)洗滌溶液,并用硫酸鎂干燥,并在冰乙醚中沉淀,過(guò)濾干燥得到白色固體。

1.5 通過(guò)混合反應(yīng)制備交聯(lián)表面多層涂層

首先,將不銹鋼片(d=10 mm)在去離子水和乙醇超聲浴中洗滌15 min;其次,用食人魚(yú)溶劑(v(硫酸):v(過(guò)氧化氫)=7∶3)預(yù)處理10 min,以清潔表面雜質(zhì),并使表面富含羥基;接著,將預(yù)處理后的SS載玻片浸入含有鹽酸多巴胺(4 mg/mL)的pH 8.5溶液中,在室溫下快速攪拌,直至顏色由金屬變成深棕色。用去離子水洗滌涂有聚多巴胺的不銹鋼片3次,并在50 ℃的真空烘箱中干燥30 min。

配有1 g/mL的聚電解質(zhì)溶液(PILF為帶正電荷聚電解質(zhì),PAAF為負(fù)電荷聚電解質(zhì)),采用層層自組裝技術(shù)在涂覆有聚多巴胺的不銹鋼片表面沉積PILF/PAAF自組裝層。每一層聚電解質(zhì)在不銹鋼片表面沉積吸附10 min,然后用去離子水沖洗1 min,沉積20層聚電解質(zhì)層,以PILF為外層。然后,將涂覆有PILF/PAAF多層結(jié)構(gòu)不銹鋼片浸沒(méi)于含有MPEG交聯(lián)劑的溶液中(1 mL,c=0.5 mM)在50 ℃ 發(fā)生Diels-Alder 反應(yīng)4 min,涂層定義為(C-PILF/PAAF)。以不交聯(lián)的PILF/PAAF自組裝層作為對(duì)照,定義為(PILF/PAAF) 。

1.6 表征方法

聚合物結(jié)構(gòu)采用核磁共振波普1H NMR(Bruker AVANCE III, 400 MHz,美國(guó))表征。不銹鋼片表面涂層結(jié)構(gòu)分別采用紅外光譜表征(Nicolet-460,賽默飛世爾)和X射線光電子能譜表征(KRATOS Axis Ultra HAS,島津)。靜態(tài)水接觸角使用JC2000D1測(cè)角器(Powereach,中國(guó)),并在室溫下采用無(wú)柄水滴法測(cè)量。不銹鋼片上的LbL自組裝多層涂層的厚度通過(guò)橢圓偏光顯微鏡(VASE J. A. Woollam)進(jìn)行測(cè)量,涂層表面電位通過(guò)Zeta電位儀測(cè)定(安東帕,瑞士)。

1.7 涂層自愈合過(guò)程和涂層穩(wěn)定性表征

用手術(shù)刀在表面涂層上劃10～15 μm寬的裂紋,且深度至基材層。然后,將破壞的涂層浸入室溫下的PBS溶液中。用原子力顯微鏡(布魯克,美國(guó))和偏光光學(xué)顯微鏡(尼康,Nikon, ECLIPSE E200,日本)觀察并拍攝每個(gè)樣品的自愈合過(guò)程。涂層穩(wěn)定性可通過(guò)自組裝涂層浸泡于PBS溶液中,并通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)表征(日本島津 UV-2450分光光度計(jì))。

1.8 涂層的體外抗菌活性表征

采用革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和大腸桿菌評(píng)價(jià)自組裝涂層的抗菌性能。每個(gè)樣品(d=10 mm,先前紫外線消毒1 h)被放入24孔板中,將1 mL細(xì)菌懸浮液(大腸桿菌或金黃色葡萄球菌)分別以107CFU/mL的濃度播種到每個(gè)孔中,在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng),分別培養(yǎng)1、3、5和7 d。用PBS溶液輕輕清洗不銹鋼片3次,以去除未附著的細(xì)菌,然后放入含有PBS(10 mL)的離心管中,超聲波沐浴30 min,將所有附著的細(xì)菌從涂層表面分離出來(lái),將剝離的細(xì)菌懸浮液在PBS溶液中適當(dāng)稀釋,并分別在溶菌湯瓊脂(LB瓊脂)和Mueller-Hinton瓊脂(MHA)板上計(jì)數(shù)。使用式(1)計(jì)算菌落減少對(duì)數(shù):

(1)

1.9 涂層細(xì)胞毒性表征

首先,采用MC3T3-E1細(xì)胞(Beyotime Bio,中國(guó))在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng),用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化并離心;其次,用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞懸浮液的濃度,使其細(xì)胞密度為105個(gè)細(xì)胞/mL;接著,采用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化銨(MTT,Beyotime Bio,中國(guó))法檢測(cè)細(xì)胞存活率。每個(gè)樣品浸泡在37 ℃,24 h;然后,將100 μL MC3T3-E1細(xì)胞懸液和100 μL浸提液接種到96孔板中,并準(zhǔn)備6個(gè)平行重復(fù)。以100 μL PBS溶液作為空白對(duì)照。在37 ℃、5%二氧化碳中孵育24 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),再孵育4 h。每個(gè)孔中的溶液用150 μL的二甲亞砜(DMSO)取代,然后搖勻15 min。采用酶標(biāo)儀(F50 TECAN)測(cè)定562 nm處的吸光度。式(2)為計(jì)算細(xì)胞存活率:

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 聚電解質(zhì)的制備及自組裝抗菌涂層的構(gòu)建

在制備涂層前,根據(jù)已有文獻(xiàn)分別制備了聚陽(yáng)離子電解質(zhì)PILF、聚陰離子電解質(zhì)PAAF和交聯(lián)劑MPEG(見(jiàn)圖1)[17]。其中,聚陽(yáng)離子電解質(zhì)即含呋喃結(jié)構(gòu)的咪唑鹽聚離子液體,具有較高的電負(fù)性,已證明其具有高效的抗菌活性和較好的生物相容性[18]。 所構(gòu)建的聚電解質(zhì)和交聯(lián)劑分別通過(guò)核磁共振1H NMR進(jìn)行了表征,見(jiàn)圖2。圖2(a)中PILF的1H NMR的化學(xué)位移,對(duì)應(yīng)連接季銨鹽的質(zhì)子,其質(zhì)子濃度為4.01 ppm,呋喃(7.50、6.85和6.48 ppm)的質(zhì)子積分比為2∶1∶1,證實(shí)目標(biāo)聚離子液體PILF已成功合成[18];在圖2(b)中,化學(xué)位移6.3～6.4 ppm出現(xiàn)的雙重峰證明了呋喃接枝到聚丙烯酸上制成PAAF,圖2(c)中化學(xué)位移6.1和6.3 ppm出現(xiàn)的峰,以及峰面積的計(jì)算證明了馬來(lái)酰亞胺不飽和雙鍵成功修飾到PEG末端,制備成MPEG。

表1 不銹鋼基材表面物理性能

圖3 (a).面涂層紅外光譜圖;(b).PS光電子能譜寬頻掃描;(c).接觸角

2.2 自組裝涂層的自愈合性能和穩(wěn)定性

基材表面的自組裝涂層的自愈合性能通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)表征。修飾有交聯(lián)后的C-PILF/PAAF自組裝涂層的不銹鋼基材經(jīng)人工劃痕后, 通過(guò)AFM表面形貌和光學(xué)顯微鏡觀察,見(jiàn)圖4(a)。交聯(lián)后的C-PILF/PAAF自組裝涂層上形成了寬度和深度分別為10～15 μm和20 μm的裂縫。將樣品浸入PBS溶液后,交聯(lián)后的C-PILF/PAAF自組裝涂層的裂縫在15～30 min內(nèi)愈合,而在相同時(shí)間內(nèi)未交聯(lián)的自組裝涂層PILF/PAAF未能完全愈合。這是由于交聯(lián)自組裝涂層一方面在PBS中溶脹引起交聯(lián)劑雙馬來(lái)酰亞胺聚乙二醇(MPEG)將聚電解質(zhì)層快速牽引,另一方面聚電解質(zhì)層之間的靜電吸引,誘導(dǎo)聚合物鏈的移動(dòng),使得受損涂層在短時(shí)間內(nèi)重建[16,19-20]。

圖4 (a). C-PILF/PAAF涂層的自愈合性能;(b).未交聯(lián)的PILF/PAAF涂層的穩(wěn)定性;(c).交聯(lián)后的C-PILF/PAAF涂層的穩(wěn)定性

自組裝涂層的長(zhǎng)期穩(wěn)定性在醫(yī)療器械的臨床使用中至關(guān)重要,不僅可延長(zhǎng)其使用壽命,還能降低使用成本。將修飾有未交聯(lián)的自組裝涂層PILF/PAAF與交聯(lián)后的自組裝涂層C-PILF/PAAF的石英片浸泡在PBS溶液中,通過(guò)紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)證明了未交聯(lián)的自組裝涂層PILF/PAAF在1 d后從基材表面脫落,而交聯(lián)的自組裝涂層C-PILF/PAAF在5 d內(nèi)均保持較好的穩(wěn)定性,見(jiàn)圖4。

2.3 自組裝涂層的抗菌活性和細(xì)胞相容性測(cè)定

通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落數(shù)的統(tǒng)計(jì),評(píng)價(jià)自組裝涂層表面的體外抗菌活性,見(jiàn)圖5(a)、(b)。在7 d內(nèi),附著在不銹鋼片內(nèi)的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌逐漸增加,而涂覆有交聯(lián)自組裝涂層C-PILF/PAAF 的不銹鋼片,菌落數(shù)明顯少于無(wú)涂層的不銹鋼片。通過(guò)式(1)可得,交聯(lián)自組裝涂層C-PILF/PAAF在7 d內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)平均減少了1.74 lgCFU/(殺菌率98.2%),對(duì)大腸桿菌的菌落數(shù)平均減少了1.19 lgCFU/(殺菌率93.6%),具有持續(xù)抗菌的性能。這是由于自組裝涂層最外層的咪唑鹽聚離子液體既是陽(yáng)離子聚電解質(zhì)層,又是高效的抗菌劑,具有較強(qiáng)的正電荷效應(yīng),結(jié)合表1交聯(lián)自組裝涂層C-PILF/PAAF的表面Zeta電位為8.14 mV,能有效破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜[18]。

圖5 7 d內(nèi)菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)及其細(xì)胞毒性對(duì)比

使用MC3T3-E1細(xì)胞評(píng)價(jià)自組裝表面涂層的細(xì)胞相容性。圖5(c)中的MTT檢測(cè)所示,涂覆自組裝表面涂層的不銹鋼片具有良好的細(xì)胞存活率,達(dá)到90%左右,證明了C-PILF/PAAF涂層不僅具有較高的抗菌活性,還具有較低的細(xì)胞毒性。

3 結(jié)論

本研究以咪唑鹽聚離子液體抗菌劑作為聚陽(yáng)離子電解質(zhì)層和抗菌聚合物,與聚陰離子電解質(zhì)層聚丙烯酸,采用層層自組裝技術(shù)在不銹鋼片表面構(gòu)建多層結(jié)構(gòu),并通過(guò)Diels-Alder技術(shù)使用MPEG將聚電解質(zhì)層交聯(lián),由此制成具有自愈合性能和長(zhǎng)期穩(wěn)定特性的涂層。通過(guò)體外生物評(píng)價(jià)證明,所構(gòu)建的自組裝涂層具有良好的持久抗菌能力和較低的生物毒性,該方法將為抑制生物醫(yī)療器械在臨床使用過(guò)程中的細(xì)菌感染提供有效策略。