姜雪冰,吳文碧,李波,邵彥翔,李響△

(1.四川大學(xué) 生物治療國家重點實驗室,成都 610041;2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院 泌尿外科/泌尿外科研究所,成都 610041)

0 引言

光固化三維(three dimension,3D)打印主要采用計算機控制激光束或數(shù)字光,觸發(fā)光敏材料按照特定圖案逐層光固化,以得到個性化定制的構(gòu)建體。該技術(shù)成型速度快、精度高,為體外構(gòu)建組織器官等生物醫(yī)學(xué)工程研究提供了重要技術(shù)支撐[1-3]。水凝膠是光固化3D打印組織器官的重要支架材料,是以水為分散介質(zhì)的3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其固有的組成成分和結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞外基質(zhì),為嵌入細(xì)胞的活力和細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)提供保障[4-5]。光固化水凝膠材料主要為烯烴單體材料(例如聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate, PEGDA)、甲基丙烯?；髂z(gelatin methacryloyl, GelMA)及甲基丙烯?；该髻|(zhì)酸(hyaluronic acid esterified by methacrylate, HAMA)等),或某些特定的光化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)修飾的單體材料(例如巰基-烯、降冰片烯修飾的聚乙二醇等[6-7])。

水凝膠的力學(xué)性能指其在一定環(huán)境下,承受如:拉伸、壓縮、彎曲及扭轉(zhuǎn)應(yīng)力等外加載荷時,所表現(xiàn)出的力學(xué)特征。一般采用楊氏模量來表征,即應(yīng)力應(yīng)變之間的比例關(guān)系,根據(jù)檢測方法不同,可使用壓縮模量和拉伸模量表征水凝膠的壓縮、拉伸性能。對于性能較差的水凝膠,也可以采用剪切模量、損耗模量等[8-9]流變學(xué)性能表征其粘彈性。相關(guān)研究表明,水凝膠力學(xué)性能可誘導(dǎo)細(xì)胞將微環(huán)境的機械應(yīng)力信號轉(zhuǎn)化為生化信號,繼而影響細(xì)胞的形態(tài)、遷移、增殖和分化等[10]。Xie等[11]將脫細(xì)胞基質(zhì)微粒與GelMA水凝膠按一定比例混合,有效提高了水凝膠的機械性能,軟骨細(xì)胞在水凝膠中增殖和體內(nèi)耳軟骨再生方面均有明顯優(yōu)勢。Du等[12]利用二次交聯(lián)的方式提升k-角叉菜膠/聚丙烯酰胺(k-CG-PAAm)雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠力學(xué)性能,軟骨細(xì)胞在水凝膠中經(jīng)循環(huán)壓縮后,仍能保持高活力,證明了堅韌支架的承載能力可為細(xì)胞提供有利的微環(huán)境。通過對水凝膠力學(xué)性能的調(diào)控,可更好地模擬組織微環(huán)境,以滿足不同細(xì)胞的特定需求。此外,將水凝膠植入體內(nèi)時,為避免因水凝膠剛度過高或過低而與周圍組織產(chǎn)生磨損、擠壓等作用,3D打印的水凝膠必須擁有與活體組織相匹配的力學(xué)支撐[13-14]。

光固化水凝膠是由自由基引發(fā)的鏈聚合反應(yīng),即在光源照射下,光引發(fā)劑吸收光子而裂解成自由基,自由基與預(yù)聚物中的乙烯基鍵發(fā)生反應(yīng),聚合物鏈間發(fā)生化學(xué)交聯(lián)而形成水凝膠。但目前光固化3D打印水凝膠普遍存在彈性、硬度等力學(xué)性能達(dá)不到預(yù)期效果的情況。這是因為水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)由共價鍵相連接,雖然共價鍵的穩(wěn)定性強,但其斷裂的不可逆性使得水凝膠在受到較強外力時,會產(chǎn)生不可逆的損傷,且單一組分的水凝膠力學(xué)性能單一,導(dǎo)致與活體組織不匹配,無法實現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)和大尺寸的打印。如何改善光固化3D打印水凝膠的力學(xué)性能是目前生物材料研究的重點之一。

本文針對較常用的光固化3D打印水凝膠材料,例如:甲基丙烯?；鶊F(tuán)(methacryloyl, MA)修飾明膠(gelatin,Gel)得到的甲基丙烯酸?；髂z(GelMA)等,從水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、水凝膠制備工藝條件以及打印結(jié)構(gòu)等方面簡述了幾種改善材料力學(xué)性能的途徑,見圖1,并總結(jié)了目前光固化3D打印水凝膠在力學(xué)性能研究方面所面臨的挑戰(zhàn)。

圖1 光固化3D打印水凝膠力學(xué)性能的影響因素示意圖

1 光固化3D打印水凝膠力學(xué)性能的優(yōu)化途徑

1.1 水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

光固化3D打印水凝膠是由一種或兩種以上的光敏單體光聚合形成的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),其力學(xué)性能主要與網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相關(guān)。對于單一網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)而言,主要通過改變單體材料自身特性來改善水凝膠的力學(xué)性能,但可調(diào)控的范圍有限。通常考慮采用不同交聯(lián)方式或共混其他成分的方法調(diào)控水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),制備得到不同力學(xué)性能的光固化3D打印水凝膠。根據(jù)水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)調(diào)控方式,大致分為單一網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、共聚、摻雜和二次交聯(lián)四個方面,見圖2。

圖2 水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化途徑

圖3 水凝膠制備工藝的優(yōu)化途徑

圖4 水凝膠打印結(jié)構(gòu)的優(yōu)化途徑

1.1.1單一網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 制備水凝膠的光敏單體按主要來源分為天然材料和合成材料兩類,一般而言,大部分合成材料類(例如硅酮和聚乙二醇等聚合物[15-16])水凝膠的力學(xué)性能優(yōu)于天然材料。影響光固化水凝膠力學(xué)性能的因素主要包括單體光敏基團(tuán)取代度、分子量以及分子結(jié)構(gòu)等。其中,光敏基團(tuán)取代度是主要影響因素。以常用的GelMA為例,研究表明,在相同濃度(質(zhì)量百分比為30%)下,MA取代度為94.9%的水凝膠儲能模量是67.6 kPa,而取代度為14.8%的模量則只有1.9 kPa[17]。單體分子量也會影響水凝膠的力學(xué)性能,例如分子量為700 Da的PEGDA打印結(jié)構(gòu)抗拉伸性能優(yōu)于分子量為250 Da的結(jié)構(gòu);在相同濃度下,分子量高的水凝膠斷裂伸長率更高[18]。參與聚合物之間化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)的乙烯基鍵隨著MA取代度的升高而增加,同等條件下,當(dāng)MA的取代度越高,則聚合物鏈之間的化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)越多,可形成更致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),提供更強的力學(xué)性能。

1.1.2共聚 目前常利用不同力學(xué)性能的光敏單體共聚制備性能優(yōu)越的水凝膠。共聚水凝膠主要是由兩種或兩種以上的單體通過共價鍵的方式形成的互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)(IPN)。例如,采用力學(xué)性能較強的PEGDA與生物相容性好的GelMA混合,可明顯提高水凝膠的壓縮性能至原來的6倍,成骨細(xì)胞能在該共聚水凝膠表面黏附增殖[19]。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)是另一種生物相容性較好的可降解生物材料,具有高粘彈性和空間填充性,但其壓縮性能只有0.01～8.00 kPa,力學(xué)性能和加工性能都較差[20-21]。Rakin等[22]將HAMA與GelMA按不同比例混合共聚制備水凝膠,隨著GelMA濃度增加,質(zhì)量百分比為2%的HAMA水凝膠彈性模量由2.44 kPa增加到10.8 kPa。Sung等[23]制備可光固化的酪胺功能化海藻酸鹽水凝膠(ALG-TYR),通過引入膠原蛋白(COL),將水凝膠的壓縮模量提升至到原來數(shù)值的33倍。Zhang等[24]將丙烯酰胺與PEGDA共混,在2, 4, 6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧膦(2, 4, 6-trimethyl benzoyldiphenyl phosphine oxide, TPO)納米引發(fā)劑的作用下,可打印出高分辨率、高保真度、拉伸性能較強的復(fù)雜結(jié)構(gòu)水凝膠。力學(xué)性能檢測發(fā)現(xiàn),該水凝膠樣品可被拉長到原來長度的13倍以上。組成共聚水凝膠的單體獨立交聯(lián)又相互纏繞,該互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不僅可以保留單體的原有特性,還能將不同性能、功能的聚合物穩(wěn)定的結(jié)合在一起,實現(xiàn)性能和功能上的雙重提高,使水凝膠的力學(xué)性能達(dá)到預(yù)期。

1.1.3摻雜 摻雜某些特定的納米顆粒(例如羥基磷灰石、功能化的二氧化硅、氧化石墨烯、碳納米管等)或摻雜納米纖維(例如聚己內(nèi)酯(poly(epsilon-caprolactone), PCL)、蠶絲纖維等剛性材料)可提升光固化水凝膠的力學(xué)性能[25-28]。其中,功能化的納米顆粒可與聚合物鏈發(fā)生相互作用,進(jìn)而提高本體水凝膠的力學(xué)性能[27]。當(dāng)研究人員在GelMA溶液中添加金納米顆粒(AuNPs)時,光固化后可將水凝膠的壓縮模量提高至原來的1.5倍;當(dāng)在GelMA溶液添加氯化物鹽和羥基磷灰石納米粒子時,混合形成的新型3D打印墨水可通過離子濃度進(jìn)行調(diào)控,使動態(tài)模量達(dá)到5 MPa,在關(guān)節(jié)軟骨組織重建方面有潛在的應(yīng)用價值[29-30]。Antonela等[31]在聚丙烯酰胺(PAAm)中混入不同比例的多壁碳納米管(MWCNTs),將彈性模量從 6.5 ×105Pa 提高至 1.1×107Pa,表現(xiàn)出優(yōu)異的機械性能,展現(xiàn)出從組織工程領(lǐng)域到生物電子設(shè)備領(lǐng)域的巨大潛力。納米纖維可與聚合物鏈之間形成堅固的界面化學(xué)鍵,從而提升光固化水凝膠的力學(xué)性能。Li等[32]在巰基化的HA與PEGDA制備的水凝膠中摻雜馬來酰亞胺(maleimide, MAL)基功能化的電紡絲PCL納米纖維。該納米纖維與水凝膠形成界面共價鍵,制備得到的水凝膠力學(xué)性能與天然脂肪組織相近,其儲能模量和剪切模量可隨納米纖維和交聯(lián)劑PEGDA濃度的升高而增加。另外,將某些特定的細(xì)胞引入網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也會影響水凝膠的力學(xué)性能。Deng等[33]將人轉(zhuǎn)化生長因子β3 (transforming growth factor-β3, TGF-β3)與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載到聚D, L-丙交酯(poly(D,L-lactide), PDLLA)/HA水凝膠中進(jìn)行體外培養(yǎng),研究結(jié)果表明,通過調(diào)控TGF-β3的釋放可促進(jìn)該細(xì)胞分泌糖胺聚糖,在一定范圍內(nèi)隨著生長因子含量增加,PDLLA/HA水凝膠力學(xué)性能增加。在聚合物凝膠網(wǎng)絡(luò)中加入功能化的納米顆粒,可使水凝膠在保持本身特性的同時,引入納米顆粒的穩(wěn)定性和剛性,此外納米顆?；蚣{米纖維還可與聚合物鏈之間的界面提供非共價的相互作用,在拉伸壓縮過程中耗散能量使水凝膠網(wǎng)絡(luò)均勻化,顯著提高了光固化水凝膠的力學(xué)性能。

1.1.4二次交聯(lián) 在共聚水凝膠中,由于共價鍵的斷裂是不可逆的,在受較強外力拉伸時,水凝膠會發(fā)生不可逆的永久性損壞,導(dǎo)致材料的整體機械性能下降。光固化3D打印水凝膠采用化學(xué)鍵合的方式形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),通過輔以物理交聯(lián)改變水凝膠的力學(xué)性能。物理交聯(lián)通常由溫度、pH、濃度和離子等因素引起,常見的交聯(lián)方式有氫鍵、疏水作用、靜電作用、主-客體相互作用、金屬配位鍵等。例如,單寧酸富含游離羥基,可作為氫鍵供體滲入到GelMA水凝膠結(jié)構(gòu)中,使得水凝膠的拉伸性能和壓縮性能顯著提高,可分別提升至原來的6倍和2.5倍;利用類似原理,還有通過添加硫酸銨、乙醇等試劑,增強分子間的疏水作用,提高水凝膠的力學(xué)性能[34-36]。家蠶絲素空間結(jié)構(gòu)含有許多因疏水作用和氫鍵作用形成的結(jié)晶或半結(jié)晶結(jié)構(gòu)域,因此,經(jīng)甲基丙烯?；募倚Q絲素水凝膠(silk fibroin with glycidyl methacylate, Silk-GMA) 具有優(yōu)越的拉伸性能[37-38]。靜電作用同樣被應(yīng)用到提高HA水凝膠力學(xué)性能的研究中,在氧化HA和酰肼改性HA水凝膠化學(xué)交聯(lián)之后,通過電荷相互作用在水凝膠內(nèi)部形成雙網(wǎng)絡(luò),使其拉伸提高至原來的2.1倍[39]。同時,主客體超分子結(jié)構(gòu)也被應(yīng)用到優(yōu)化HA水凝膠力學(xué)性能的研究中,將金剛烷與β-環(huán)糊精分別連接到HAMA上,預(yù)交聯(lián)后經(jīng)紫外光固化得到的水凝膠力學(xué)性能明顯增強;金剛烷與β-環(huán)糊精還被用于海藻酸鹽水凝膠,使彈性模量最大可達(dá)6.5 kPa[40-41]。此外,Yi等[42]采用金屬配位鍵構(gòu)建了以組氨酸和鋅離子(Zn2+)修飾的GelMA水凝膠,組氨酸的咪唑基團(tuán)可與Zn2+形成金屬配位鍵,通過增加Zn2+濃度,交聯(lián)水凝膠的壓縮模量可從3.5 kPa提升至7.8 kPa。對于二次交聯(lián)的光固化水凝膠來說,在受到外力拉伸時,其第二次發(fā)生的物理交聯(lián)可充當(dāng)可逆的犧牲鍵,以增強水凝膠的韌性,實現(xiàn)自我恢復(fù)的特性,提高水凝膠的力學(xué)性能。

1.2 水凝膠制備工藝條件

水凝膠制備的工藝條件也是影響光固化3D打印水凝膠力學(xué)性能的重要因素之一,包括預(yù)聚物濃度、光源強度、曝光時間、光引發(fā)劑濃度等。其中,預(yù)聚物濃度是最主要的因素。通常預(yù)聚物濃度越高水凝膠力學(xué)性能越強,例如質(zhì)量濃度(w/v)為20%的GelMA水凝膠相較于15%和10%的水凝膠,具有更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),水凝膠壓縮模量更高(約100 kPa)[17]。在另一項研究中,質(zhì)量百分比為30%的Silk-GMA水凝膠壓縮模量最高可達(dá)120 kPa(50%的形變),拉伸模量最高可到50 kPa(80%的形變),均高于20% Silk-GMA水凝膠[43]。此外,打印所采用的光源波長、光引發(fā)劑的濃度、光照強度和時間等均是影響水凝膠力學(xué)性能的重要因素[44]。Larsen等[45]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)整PEGDA與環(huán)氧單體的比例可大幅度改變水凝膠剛度,環(huán)氧單體濃度越高,樣品的壓縮性能越強;同時,與450 nm藍(lán)光相比,在365 nm的紫外光照下溶液成型更好,且隨光照時間延長,壓縮性能更優(yōu)。Xue等[46]采用數(shù)字光處理(digital light processing,DLP)3D打印技術(shù)調(diào)整曝光的時間,而不改變PEGDA水凝膠的幾何結(jié)構(gòu),力學(xué)測試結(jié)果表明,通過設(shè)定最佳曝光時間,柱形鏤空結(jié)構(gòu)彈性模量可提高60%。預(yù)聚物濃度直接決定單體溶液中含有乙烯基鍵的多少,光引發(fā)劑的濃度決定了通過吸收光斷裂產(chǎn)生自由基的多少,因此,預(yù)聚物和引發(fā)劑濃度越高,體系中越多的乙烯基鍵與自由基發(fā)生反應(yīng),聚合物鏈間的化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)越充分,形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密,因而具有更高的力學(xué)性能。光源部分包含光的強弱和曝光時間的長短。光照越強、曝光時間越長,可使光引發(fā)劑斷裂產(chǎn)生更多自由基。在光聚合反應(yīng)中,各因素相互影響,通過同時調(diào)節(jié)預(yù)聚物濃度、光引發(fā)劑濃度以及光源強度、時間可實現(xiàn)較為理想的水凝膠力學(xué)強度。

此外,采用凍干或者洗脫等方式對水凝膠進(jìn)行后處理,形成微納米孔,使水凝膠具有負(fù)泊松比效應(yīng),能夠增強水凝膠的力學(xué)性能[47]。Xia等[48]發(fā)現(xiàn)將HAMA/GelMA水凝膠冷凍干燥后,與未經(jīng)凍干處理的水凝膠相比,凍干水凝膠復(fù)水后的楊氏模量提高了2.5倍(約25 kPa)。Hossein等[49]介紹了由木瓜種子粘液和纖維素納米原纖維(QSM/CNF)組成的新型水凝膠,冷凍干燥后,壓縮和彈性模量都增加了2倍左右。Ying等[50]則將聚環(huán)氧乙烷作為被洗脫材料,采用雙水相乳液原理制備了基于GelMA的微納米孔水凝膠,壓縮力學(xué)性能檢測數(shù)據(jù)表明,與標(biāo)準(zhǔn)水凝膠相比,該水凝膠經(jīng)壓縮后,更容易復(fù)原,具有一定的形狀記憶功能。具有微納米孔的水凝膠是一種非均質(zhì)結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)負(fù)泊松比效應(yīng)。當(dāng)水凝膠材料受壓時,材料向被沖擊區(qū)域聚集變得更加致密,瞬時密度增大,提高抵抗壓縮的能力。而一般的均質(zhì)水凝膠受壓時則相反,被沖擊區(qū)域材料向兩側(cè)分離,力學(xué)性能明顯低于具有微納米孔的水凝膠。

1.3 打印結(jié)構(gòu)

由于不同的3D設(shè)計結(jié)構(gòu)(三角形、矩形、菱形以及六邊形等)在軸向和橫向的應(yīng)力分布不同,因而影響水凝膠整體結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能。通過采用有限元模型來預(yù)測部分結(jié)構(gòu)的壓縮性能,可為優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計提供理論依據(jù)[51-52]。Cui等[53]采用3D打印將不同連接度的設(shè)計單元結(jié)構(gòu)進(jìn)行組合,確保組裝成完整3D結(jié)構(gòu)的同時,具有不同的剛度和強度特性。此外,不同的打印方式也會影響其力學(xué)性能,對比橫向和縱向打印成型制備拉伸樣品,發(fā)現(xiàn)縱向樣品的拉伸韌性約為3.28 MPa,比橫向樣品的拉伸韌性(0.99 MPa)高3倍以上[54]。三維結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能主要體現(xiàn)在自身的穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)的承載力上面,與很多因素相關(guān),包括重心、受力截面面積、截面慣性矩、失穩(wěn)臨界力等。相同截面積的空心圓柱、實心圓柱、方柱,力學(xué)性能呈遞減趨勢,雖然截面積不變,但空心圓柱的慣性矩較大,具有更大的失穩(wěn)臨界力,其結(jié)構(gòu)的承載力也越大,表現(xiàn)出更好的抗壓性。此外,三維結(jié)構(gòu)的橫向、縱向打印方式也會影響其力學(xué)性能,這類似于單向纖維增強復(fù)合材料,順著纖維方向的拉伸強度高于垂直于纖維方向的拉伸強度。當(dāng)縱向打印時,拉伸水凝膠相當(dāng)于順著纖維方向拉伸,當(dāng)橫向打印時,拉伸相當(dāng)于垂直于纖維方向拉伸。因此,縱向打印的拉伸模量高于橫向打印的拉伸模量。

2 總結(jié)與展望

力學(xué)性能是光固化3D打印水凝膠構(gòu)建理想生物制品的重要條件。水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改變是改善力學(xué)性能的主要方法,對于單一網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),力學(xué)性能可調(diào)控的范圍有限,而多組分水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),通過物理化學(xué)反應(yīng)形成交聯(lián)互穿網(wǎng)絡(luò),或摻雜剛性材料使水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密,增強力學(xué)性能。此外,水凝膠制備工藝的條件及3D打印結(jié)構(gòu)也會影響水凝膠的力學(xué)性能。

目前光固化3D打印水凝膠已被應(yīng)用到神經(jīng)、軟骨和血管等組織中,但不同組織需要生物材料的力學(xué)性能和生物學(xué)功能存在較大差異,例如血管組織需考慮水凝膠的韌性和物質(zhì)交換;神經(jīng)導(dǎo)管則需考慮材料柔韌性、手術(shù)縫合性等。如何調(diào)控水凝膠力學(xué)性能,并將其廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,可從以下幾個方面考慮:

(1)共價鍵的不可逆斷裂性限制了光固化水凝膠力學(xué)性能的調(diào)控,而通過物理交聯(lián)形成的“犧牲鍵”一般都具有可逆性,犧牲鍵的動態(tài)性質(zhì)可為水凝膠提供高機械性能和自修復(fù)能力,若能僅通過物理交聯(lián)使光固化水凝膠形成具有可逆鍵的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),不含有共價鍵,則可增強水凝膠的韌性和自修復(fù)能力;(2)研究力學(xué)性能較優(yōu)的新型光敏單體材料;(3)利用現(xiàn)有光敏材料進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計,采用多組分方式制備3D打印水凝膠;(4)探索力學(xué)性能影響活體組織器官生物學(xué)功能實現(xiàn)的作用機制,同時監(jiān)測3D打印制品在體內(nèi)力學(xué)性能的動態(tài)變化,為光固化3D打印水凝膠的設(shè)計制備提供新的思路;(5)結(jié)合大尺寸復(fù)雜結(jié)構(gòu)3D打印技術(shù),開展大動物實驗及臨床試驗等,推動3D打印制品的臨床應(yīng)用。