余武秀，申繼忠

(上海艾農(nóng)國際貿(mào)易有限公司，上海 200122)

歐盟農(nóng)藥管理文件沒有對微生物農(nóng)藥定義，但微生物(micro-organism)卻被經(jīng)常使用，植物保護(hù)產(chǎn)品活性物質(zhì)也包括了微生物和病毒。

1 歐盟微生物農(nóng)藥登記管理法規(guī)和登記資料要求

執(zhí)行Regulation(EC)1107/2009[1]前，歐盟農(nóng)藥管理依據(jù)理事會(huì)指令Council Directive 91/414/EEC[2]，其附錄II 為農(nóng)藥活性成分登記資料要求，包括化學(xué)農(nóng)藥(常規(guī)農(nóng)藥)有效成分(Part A)和微生物農(nóng)藥活性成分(Part B)2 個(gè)部分；附錄III 為制劑登記資料要求，包括化學(xué)農(nóng)藥制劑(Part A)和微生物農(nóng)藥制劑(Part B)2 個(gè)部分。Regulation(EC)No 1107/2009 的附錄不再包括資料要求，活性成分和制劑的登記資料要求分別通過Commission Regulation (EU) No 283/2013[3]和 Commission Regulation (EU) No 284/2013[4]予以規(guī)定，都包含化學(xué)農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥2 個(gè)部分。

Regulation(EC)No 1107/2009 登記資料要求脫胎于化學(xué)農(nóng)藥登記資料要求，不能很好地適用于微生物農(nóng)藥評審要求。風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的終點(diǎn)沒有清楚的定義，可能產(chǎn)生不同的解釋，甚至要求更多資料。登記評審不透明、費(fèi)用高、登記時(shí)間也遠(yuǎn)長于美國(表1)[5-6]。

表1 歐盟新舊法規(guī)評審/登記程序及其所需時(shí)間

新的數(shù)據(jù)要求于2013 年發(fā)布，低風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)準(zhǔn)也于2017 年發(fā)布，為什么現(xiàn)在還會(huì)有這些問題呢？2019 年德國SCC 科學(xué)咨詢公司(SCC GmbH -Scientific Consulting Company)Lars Huber 博士指出，以微生物為例，2013 年法規(guī)Regulation (EC) No 283/2013和Regulation(EC)No 284/2013 新發(fā)布的一般數(shù)據(jù)要求，仍有沿用2011 年(Council Directive 91/414/EEC有效期至2011 年)的數(shù)據(jù)要求，而沿用的這些數(shù)據(jù)要求是針對化學(xué)活性物質(zhì)。例如，管理術(shù)語“代謝物”、“相關(guān)代謝物”或“次級代謝物”均適用于化學(xué)制品，而與微生物的生物學(xué)特性毫無關(guān)聯(lián)[7]。

2 微生物農(nóng)藥登記管理法規(guī)修訂

歐盟修訂了微生物農(nóng)藥管理法規(guī)和登記要求，并于2022 年2 月8 日，歐盟成員國批準(zhǔn)了4 項(xiàng)實(shí)施法規(guī)(Implementing Regulations)。實(shí)施法規(guī)修訂主要針對微生物農(nóng)藥的登記管理，通過修訂委員會(huì)法規(guī) Commission Regulation (EU) No 283/2013 和Commission Regulation(EU)No 284/2013，改進(jìn)微生物農(nóng)藥登記資料要求(Part B)[8]。

4 項(xiàng)實(shí)施法規(guī)分別是：⑴修訂Regulation(EU)No 283/2013：修訂關(guān)于微生物有效成分的審批標(biāo)準(zhǔn)[9]。⑵修訂Regulation(EU)No 284/2013：修訂關(guān)于含有微生物的原藥審批的資料要求[10]。⑶修訂Regulation(EU)No 546/2011：評價(jià)和授權(quán)含微生物生物制劑產(chǎn)品的資料要求[11]。⑷修訂Annex II to Regulation(EC)No 1107/2009：含有微生物的植物保護(hù)產(chǎn)品評估和授權(quán)的具體統(tǒng)一原則[12]。

新法規(guī)基于每種微生物的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合了最新的科學(xué)知識(shí)。新法規(guī)有利于促進(jìn)微生物作為植物保護(hù)產(chǎn)品中的活性物質(zhì)的審批以及含有這些活性物質(zhì)的制劑產(chǎn)品的登記。新法規(guī)對微生物的管理要求“因地制宜”、更加靈活，新的登記要求需要的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更少，有望給歐盟作物保護(hù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來諸多好處[13]。以最新科學(xué)為依據(jù)的新法規(guī)使歐盟成為微生物農(nóng)藥全球最先進(jìn)的管理機(jī)構(gòu)之一。

從農(nóng)場到餐桌戰(zhàn)略和綠色協(xié)議旨在減少對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)品的依賴和使用。歐盟擬修訂和實(shí)施新的微生物農(nóng)藥登記要求可以促進(jìn)微生物農(nóng)藥的使用，新的登記數(shù)據(jù)要求有利于含有微生物的植物保護(hù)產(chǎn)品更快地進(jìn)入歐盟市場。新法規(guī)與歐洲綠色協(xié)議(European Green Deal)完全配合，有利于實(shí)現(xiàn)從農(nóng)場到餐桌戰(zhàn)略(Farm to Fork Strategy)。

微生物的生物特性在風(fēng)險(xiǎn)評估中起核心作用，新的實(shí)施行動(dòng)所需的許多數(shù)據(jù)都以特定微生物的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)為條件。任何情況下，一種微生物只有被證明不會(huì)引起人類或動(dòng)物疾病情況下才能獲準(zhǔn)使用。

自然產(chǎn)生且大多無害的微生物在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的作用，例如，通過分解土壤中的有機(jī)物使其為其他生物所用，或通過向土壤中添加大氣氮(固氮)使其為植物所用。

微生物的使用幾乎和人類存在的時(shí)間一樣長，比如面包、奶酪、啤酒和葡萄酒的制造重都有微生物的作用，“百姓日用而不知”。在現(xiàn)代，它們的用途被擴(kuò)大了，如作為食品/飼料添加劑中益生菌的基本成分，或用于生產(chǎn)藥用活性物質(zhì)等。

與植物保護(hù)產(chǎn)品使用的所有其他活性物質(zhì)一樣，微生物只有符合監(jiān)管法規(guī)制定的審批準(zhǔn)則，才可獲準(zhǔn)使用。

成員國、歐洲食品安全局(EFSA)和歐盟委員會(huì)在每一種活性物質(zhì)進(jìn)入市場并用于植物保護(hù)產(chǎn)品之前，都要對其對人類和環(huán)境的安全性進(jìn)行評估。然后再由成員國授權(quán)每種含有獲批準(zhǔn)活性物質(zhì)的植物保護(hù)產(chǎn)品用于預(yù)期用途。目前，經(jīng)過科學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評估證實(shí)在植物保護(hù)產(chǎn)品中使用的安全性之后，歐盟已經(jīng)批準(zhǔn)了70 多種微生物活性物質(zhì)作為植物保護(hù)產(chǎn)品的有效成分。

含有微生物的生物農(nóng)藥產(chǎn)品，如果在最佳條件下正確使用，可能與化學(xué)農(nóng)藥一樣有效。在條件不是最優(yōu)的地方，它們可能不如化學(xué)農(nóng)藥有效，因?yàn)樽鳛樯铮鼈冃枰白顑?yōu)使用條件”才能成功控制有害生物。

這些生物制品在有機(jī)農(nóng)業(yè)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，農(nóng)民可以使用微生物作為生物控制劑。新法規(guī)將加強(qiáng)微生物植物保護(hù)產(chǎn)品的市場準(zhǔn)入，為歐盟有機(jī)種植者提供新的可持續(xù)替代品來控制植物有害生物。歐盟有機(jī)農(nóng)業(yè)將受益于微生物植物保護(hù)產(chǎn)品的引進(jìn)。2019 年，歐盟有近33 萬有機(jī)農(nóng)民，在某些成員國的農(nóng)業(yè)面積中占比高達(dá)20%。此外，“從農(nóng)場到餐桌戰(zhàn)略”的目標(biāo)之一是增加歐盟有機(jī)農(nóng)業(yè)的總耕地面積，到2030 年歐盟至少有25%的農(nóng)業(yè)用地是有機(jī)農(nóng)業(yè)。

微生物在有害生物綜合治理中也發(fā)揮著重要作用：在使用化學(xué)植物保護(hù)產(chǎn)品之前，農(nóng)民必須優(yōu)先考慮預(yù)防措施、監(jiān)測和使用生物農(nóng)藥(包括以微生物為基礎(chǔ)的產(chǎn)品)。有害生物綜合治理的目的還在于將農(nóng)藥的使用和其他形式的干預(yù)措施控制在經(jīng)濟(jì)和生態(tài)合理的水平，同時(shí)還可以采用其他措施，如輪作、選擇適當(dāng)?shù)钠贩N和栽培技術(shù)。

3 修訂前后的微生物活性物質(zhì)評審和制劑登記要求對比

修訂前后的微生物農(nóng)藥活性物質(zhì)審批要求和制劑登記要求對比分別列于表2 和表3 中。

表2 微生物活性物質(zhì)審批資料要求修訂前后的比較

表3 歐盟微生物制劑產(chǎn)品登記資料要求修訂前后的對比

需要說明的是，如果有效成分是：⑴化學(xué)物質(zhì)(包括化學(xué)信息素、生物材料提取物)，或⑵由微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，即從微生物中純化得到的代謝產(chǎn)物，或不是從不再能夠復(fù)制或轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的微生物提純的代謝物，那么需要根據(jù)化學(xué)農(nóng)藥有效成分登記要求提供相應(yīng)的登記資料。

在申請微生物活性物質(zhì)的審批時(shí)，申請人必須提交一個(gè)代表性制劑產(chǎn)品的數(shù)據(jù)，因此在歐盟層面的活性物質(zhì)評估是決定相關(guān)制劑能否進(jìn)入市場的關(guān)鍵?；钚晕镔|(zhì)通過評審后，相關(guān)制劑的評審則可參考活性物質(zhì)評審信息和評審結(jié)果。

證據(jù)權(quán)重法的含義：當(dāng)某項(xiàng)從每個(gè)毒理數(shù)據(jù)源得到的數(shù)據(jù)被認(rèn)為不足以支持某個(gè)觀點(diǎn)時(shí)，則從若干個(gè)獨(dú)立的數(shù)據(jù)源得到的綜合證據(jù)可能具有足夠的權(quán)重，將對該物質(zhì)有某項(xiàng)特殊的危害特性做出假設(shè)或結(jié)論。如就健康危害評估而言，可通過整合化合物構(gòu)效關(guān)系、毒理學(xué)、流行病學(xué)和醫(yī)學(xué)等相關(guān)數(shù)據(jù)和信息，來確定用于制定安全限值的敏感效應(yīng)終點(diǎn)。

3.1 修訂后的微生物活性物質(zhì)審批要求、制劑登記授權(quán)與化學(xué)活性物質(zhì)及制劑登記授權(quán)的不同之處

3.1.1 微生物活性物質(zhì)和制劑資料要求的歷史回顧

Council Directive 91/414/EEC 的附錄II 中分別規(guī)定了化學(xué)農(nóng)藥和微生物(包括病毒)農(nóng)藥有效成分的審批資料要求。而在附錄III 中分別規(guī)定了化學(xué)農(nóng)藥和微生物(包括病毒)農(nóng)藥制劑的登記要求。但是這些資料要求的設(shè)定與化學(xué)農(nóng)藥的基本一樣。

在Regulation(EC)No 1107/2009 之后，發(fā)布了Commission regulation(EU)No 283/2013 和Commission regulation(EU)No 284/2013，分別制定了化學(xué)農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥活性物質(zhì)審批以及化學(xué)農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥制劑的登記資料要求。歐盟在評價(jià)幾個(gè)新的由微生物活性物質(zhì)組成的產(chǎn)品期間積累一些經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為可以引入更精確的微生物數(shù)據(jù)要求，特別是職業(yè)健康、消費(fèi)者接觸和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)等方面可以進(jìn)行重大改變，于是歐洲委員會(huì)在2001 年又頒布了委員會(huì)指令Commission Directive 2001/36/EC[15]，修訂了Council Directive 91/414/EEC 附錄II 和附錄III 對微生物活性物質(zhì)審批和制劑登記的資料要求。委員會(huì)認(rèn)為，應(yīng)該將微生物農(nóng)藥的登記要求與化學(xué)農(nóng)藥區(qū)分開來，如關(guān)于環(huán)境中的歸宿和行為以及殘留的要求是適用于化學(xué)品的，而其他的如關(guān)于傳染性的，則是專門針對微生物的。

3.1.2 修訂后的微生物活性物質(zhì)審批要求的變化

修訂的目的是進(jìn)一步將微生物活性物質(zhì)審批要求與化學(xué)活性物質(zhì)進(jìn)行區(qū)別。與修訂之前相比，修訂后主要在如下幾個(gè)方面體現(xiàn)出與化學(xué)活性物質(zhì)審批的不同[16](表2)。

⑴關(guān)于微生物的鑒定

“應(yīng)使用最好的可用技術(shù)在菌株水平上鑒別和描述微生物”。這一點(diǎn)在Council Directive 91/414附錄IIB 中已經(jīng)有相同的措辭。還強(qiáng)調(diào)在進(jìn)行微生物鑒定時(shí)不需要全基因組序列(WGS)數(shù)據(jù)。

實(shí)施Regulation(EC)No 1107/2009[1]之后，重新制定了微生物活性物質(zhì)審批資料要求法規(guī)Commission Regulation (EU) No 283/2013 和制劑登記授權(quán)的資料要求法規(guī)Commission Regulation(EU)No 284/2013。由于微生物的作用方式往往基于微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物(化學(xué)物質(zhì))，因此對于微生物產(chǎn)品中的代謝物的資料要求，按化學(xué)農(nóng)藥對待還是按微生物對待，在Commission Regulation(EU)No 283/2013 和Commission Regulation (EU) No 284/2013 中仍存在不確定性。

修訂后的法規(guī)Draft Commission Regulation(EU) No 283/2013 和Draft Commission Regulation(EU)No 284/2013 試圖澄清這種情況。如果產(chǎn)品是從微生物中純化的代謝產(chǎn)物或含有代謝產(chǎn)物的產(chǎn)品中微生物已經(jīng)死亡(不再能夠復(fù)制或轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì))，此時(shí)Part A(化學(xué)活性物質(zhì))是適用的。對單一或確定的微生物組合，或者聲稱只有在活的微生物存在時(shí)才有助于植物保護(hù)產(chǎn)品發(fā)揮作用的代謝產(chǎn)物，Part B(微生物)適用。

⑵微生物防治劑試驗(yàn)樣品

該修正案引入了術(shù)語“生產(chǎn)的微生物病蟲害控制劑的原樣(microbial pest control agent as manufactured，MPCAAM)”，因?yàn)樾枰褂蒙a(chǎn)的MPCAAM 樣品進(jìn)行某些測試，而不是使用純化后生產(chǎn)的活性物質(zhì)或MPCAAM 的其他成分。

⑶使用WGS 鑒定所關(guān)注的代謝物

必須通過各種方法，如根據(jù)科學(xué)文獻(xiàn)，來確定所關(guān)切的代謝產(chǎn)物。根據(jù)全基因組序列數(shù)據(jù)分析，確定編碼代謝產(chǎn)物的基因的缺失被認(rèn)為是證明該代謝產(chǎn)物不存在危害的重要手段。

如果代謝產(chǎn)物對微生物產(chǎn)品的作用方式有貢獻(xiàn)，或者預(yù)計(jì)會(huì)有顯著的殘留物，那么需要提交代謝物的數(shù)據(jù)。

⑷獲得性和內(nèi)在抗菌素耐藥性(AMR)及植物保護(hù)微生物的AMR 評價(jià)

Part B 還定義了獲得性和內(nèi)在抗菌素耐藥性。如果某個(gè)抗菌素耐藥性基因：①位于染色體上；②缺乏可移動(dòng)的遺傳元素；③由同一物種的大多數(shù)野生型菌株共有，則該基因被認(rèn)為是固有的。而獲得性抗菌素耐藥性意味著：①非內(nèi)在的和獲得性的新抗性；②使微生物能夠在抗菌劑的存在下生存或繁殖；③濃度高于抑制同一物種野生型菌株的濃度。

如果認(rèn)為細(xì)菌菌株不具有任何已知的、功能性的和可轉(zhuǎn)移的對相關(guān)抗菌藥物耐藥的基因編碼，則可以批準(zhǔn)其為活性物質(zhì)。此外，如果其對至少2 類抗菌藥物的易感性已被證明，則活性微生物物質(zhì)可以被認(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)的活性物質(zhì)。低風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的批準(zhǔn)期限為15 年，長于正常的10 年。

此外，在數(shù)據(jù)要求方面，修訂后采用證據(jù)權(quán)重法，綜合利用已有信息，盡可能減少毒性試驗(yàn)研究的需要。

繼Regulation(EC)No 1107/2009 實(shí)施以后，所有獲得歐盟批準(zhǔn)的農(nóng)藥活性物質(zhì)都要被列入Commission Implementing Regulation (EU) No 540/2011[17]的附錄中(Part A～E)。其中Part A 是始于2011 年的最初批準(zhǔn)的活性物質(zhì)；Part B 是更新和新批準(zhǔn)的活性物質(zhì)；Part C 是批準(zhǔn)的基礎(chǔ)物質(zhì)；Part D是批準(zhǔn)的低風(fēng)險(xiǎn)活性物質(zhì)；Part E 則是替代候選物質(zhì)。該法規(guī)中的附錄雖活性物質(zhì)審批的進(jìn)行不斷更新其附錄[18]。

目前為止，根據(jù)歐盟農(nóng)藥活性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢得知，共有73 個(gè)微生物活性物質(zhì)獲得了歐盟的批準(zhǔn)[19-20]。根據(jù)前述已批準(zhǔn)的低風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)名單，23 個(gè)微生物活性成分被列為低風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，其余51 個(gè)微生物活性成分屬于普通活性成分。

3.2 修訂后的微生物制劑登記授權(quán)要求的變化

微生物制劑的登記授權(quán)應(yīng)基于微生物活性物質(zhì)的評審結(jié)果。原則上，通過活性物質(zhì)評審的微生物使用到制劑中，只要添加劑如助劑、增效劑和安全劑等是經(jīng)過安全評價(jià)的物質(zhì)則可以減免很多制劑的資料要求，尤其是對人的健康影響、環(huán)境歸宿和行為、生態(tài)毒性等。

從表3 的分析可見，修訂后的主要變化體現(xiàn)在下面幾個(gè)方面：

⑴修訂后，引進(jìn)了證據(jù)權(quán)重法，試圖更充分地利用現(xiàn)有信息，以便盡最大程度地減少對試驗(yàn)研究的要求。

⑵對某些項(xiàng)目的要求有更為充分的說明，試圖讓申請人更容易理解和掌握相關(guān)的數(shù)據(jù)要求。但是也同時(shí)降低了可操作性。

4 微生物農(nóng)藥制劑統(tǒng)一評價(jià)原則的修訂

繼Council Directive 91/414/EEC 實(shí)施之后，又制定了Council Directive 94/43/EC[21]，建立了Council Directive 91/414/EEC 的附錄VI，即農(nóng)藥登記的統(tǒng)一評價(jià)原則。這個(gè)統(tǒng)一評審原則文件主要適合于化學(xué)農(nóng)藥。

為了適合微生物農(nóng)藥登記評審的特殊要求，2005 年歐盟委員會(huì)又為成員國制定了微生物農(nóng)藥制劑的統(tǒng)一評價(jià)原則，即Council Directive 2005/25/EC[22]。

新的法規(guī)Regulation(EC)No 1107/2009 出臺(tái)之后，又重新制定了化學(xué)農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥制劑的統(tǒng)一評價(jià)原則[Commission Regulation(EU)No 546/2011][23]。

2022 年8 月，歐盟委員會(huì)對Commission Regulation(EU)No 546/2011 作進(jìn)一步修訂。

Commission Regulation(EU)No 546/2011(2011 年6 月10 日實(shí)施)規(guī)定了植物保護(hù)產(chǎn)品的評估和批準(zhǔn)的統(tǒng)一原則。該法規(guī)附件之Part A 和Part B 分別適用于含有化學(xué)物質(zhì)和微生物的植物保護(hù)產(chǎn)品，是現(xiàn)有的評估植物保護(hù)產(chǎn)品是否可能對人類健康、動(dòng)物健康產(chǎn)生有害影響的統(tǒng)一原則，或在獲得批準(zhǔn)后對環(huán)境產(chǎn)生不可接受的影響的統(tǒng)一原則。

“從農(nóng)場到餐桌戰(zhàn)略”是歐盟委員會(huì)建立的公平、健康和環(huán)境友好型食品體系戰(zhàn)略，旨在減少對化學(xué)植物保護(hù)產(chǎn)品的依賴和使用，包括促進(jìn)微生物等生物活性物質(zhì)的投放市場。為了實(shí)現(xiàn)這些，必須考慮到已經(jīng)發(fā)生重大變化的最新科學(xué)和技術(shù)知識(shí)，就含有微生物的植物保護(hù)產(chǎn)品制定統(tǒng)一的評審原則。

因?yàn)槲⑸锸怯猩挠袡C(jī)體，所以需要一種特定的方法來與化學(xué)物質(zhì)比較，以便也考慮到關(guān)于微生物生物學(xué)的科學(xué)現(xiàn)狀，因?yàn)樗鼈兪怯猩挠袡C(jī)體。這些科學(xué)知識(shí)包括關(guān)于微生物關(guān)鍵特性的信息，例如它們的致病性和傳染性、可能產(chǎn)生的相關(guān)代謝物以及將抗菌素耐藥性基因轉(zhuǎn)移到其他具有致病性并發(fā)生在歐洲環(huán)境中的微生物的能力，這可能影響人用和獸用抗菌素的有效性。因此，需要進(jìn)一步規(guī)范數(shù)據(jù)要求，以落實(shí)關(guān)于抗菌素耐藥性可轉(zhuǎn)移性的最新科學(xué)和技術(shù)知識(shí)，并確保對活性物質(zhì)是否可能對人類或動(dòng)物健康產(chǎn)生有害影響進(jìn)行評估，如法規(guī)Regulation(EC)No 1107/2009 第4 條所規(guī)定的對人類和動(dòng)物健康影響的審批標(biāo)準(zhǔn)所示。

現(xiàn)有的關(guān)于含有微生物的植物保護(hù)產(chǎn)品的科學(xué)知識(shí)使人們可以采用更好和更具體的方法來評估這些產(chǎn)品，評估方法是根據(jù)各自物種的作用方式和生態(tài)特征，并在可能的情況下?lián)髯缘奈⑸镏晗颠M(jìn)行。由于可以更有針對性地進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，所以在評估含有微生物的植物保護(hù)產(chǎn)品所帶來的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)該考慮到這些科學(xué)知識(shí)。

因此，為了更好地反映最新的科學(xué)發(fā)展和微生物的特性，同時(shí)保持對人類和動(dòng)物健康以及環(huán)境的高度保護(hù)，有必要相應(yīng)地調(diào)整現(xiàn)有的統(tǒng)一評審原則。

5 關(guān)于微生物農(nóng)藥測試方法

關(guān)于微生物農(nóng)藥的測試，目前沒有全球統(tǒng)一的方法。OECD在這方面一直試圖開發(fā)出一套供OECD成員國使用的方法，但目前還未成熟。而美國EPA早在1996 年就發(fā)布了一套專供微生物農(nóng)藥的測試方法，即所謂的885 系列方法。FAO/WHO 在其微生物農(nóng)藥登記要求指導(dǎo)文件中，也推薦使用美國EPA 和OECD 的相關(guān)方法。歐盟一直采用美國的885系列方法。

5.1 OECD 微生物測試方法開發(fā)進(jìn)展

2019 年，OECD 舉辦了第九屆微生物農(nóng)藥工作組關(guān)于微生物測試方法的研討會(huì)[24]。此次研討會(huì)對用于人類健康和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估的不同測試方法以及在實(shí)施和解釋過程中出現(xiàn)的挑戰(zhàn)和問題。整個(gè)研討會(huì)的目的是為了提出改進(jìn)微生物檢測方法的建議。

管理當(dāng)局和利益相關(guān)者確實(shí)認(rèn)識(shí)到現(xiàn)有測試方法對微生物測試的價(jià)值，但是，同時(shí)他們承認(rèn)現(xiàn)有方法存在一些固有局限性，但是目前已經(jīng)獲得的經(jīng)驗(yàn)和當(dāng)前的科學(xué)進(jìn)步可以解決這些測試方法的局限性。鑒于可靠地評估微生物農(nóng)藥安全性的測試方法具有十分重要的意義，因此管理部門和利益相關(guān)者應(yīng)該共同努力改進(jìn)這些方法。

OECD 舉辦的第九屆微生物農(nóng)藥工作組關(guān)于微生物測試方法的研討會(huì)是為了介紹和討論現(xiàn)有微生物測試方法的適用性，說明生物農(nóng)藥登記申請者和管理者面臨的障礙和問題，并啟動(dòng)程序，提出改進(jìn)微生物檢測方法的建議。

此次會(huì)議主要總結(jié)了：①來自利益相關(guān)者的經(jīng)驗(yàn)和觀點(diǎn)，包括OECD 關(guān)于數(shù)據(jù)要求和測試準(zhǔn)則調(diào)查的背景和反饋；微生物，及對人類毒理學(xué)的挑戰(zhàn)；歐盟的經(jīng)驗(yàn)：測試方法和微生物的評價(jià)；微生物農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估；水生和陸生：微生物和非生物的試驗(yàn)方法；傳粉昆蟲和微生物測試方法；微生物的長期水蚤毒性研究(OECD TG 211)的經(jīng)驗(yàn)的和對研究設(shè)計(jì)的修改建議；如何開發(fā)和將OECD 化學(xué)品測試指南用于微生物。②來自政府的經(jīng)驗(yàn)和觀點(diǎn)，包括澳大利亞、日本、美國、加拿大對微生物測試方法的經(jīng)驗(yàn)。

研討會(huì)期間的一個(gè)普遍看法是，大多數(shù)OECD成員國對微生物生物農(nóng)藥登記的數(shù)據(jù)要求大多與化學(xué)農(nóng)藥相同。為此，為了提供某些數(shù)據(jù)，還是使用化學(xué)農(nóng)藥評估方法對微生物農(nóng)藥進(jìn)行測試。在某些情況下，使用由美國EPA 開發(fā)的支持微生物防治劑的登記的單獨(dú)的測試指南(885 系列)。但是，有人指出，其中一些微生物的檢測方法：①存在一定的技術(shù)局限性；②獲得的結(jié)果不容易解釋；③被認(rèn)為已經(jīng)落后于目前的科學(xué)發(fā)展。

人們也承認(rèn)在過去的20 年中，在使用某些化學(xué)農(nóng)藥測試指南并將之用于微生物測試，或開發(fā)新的替代方法更好地滿足它們的需求等方面，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。

還強(qiáng)調(diào)指出，應(yīng)對現(xiàn)有測試方法在處理微生物農(nóng)藥登記要求的數(shù)據(jù)方面的價(jià)值進(jìn)行審查。有人建議工作應(yīng)該首先重點(diǎn)改進(jìn)現(xiàn)有的測試方法，然后逐步地使用科學(xué)論證對微生物農(nóng)藥登記要求的數(shù)據(jù)進(jìn)行修改。

與會(huì)者提出了若干建議，為改善微生物農(nóng)藥的測試鋪平了道路：①審查所有的測試方法，并在使用時(shí)識(shí)別它們在檢測微生物方面的局限性；②準(zhǔn)備一份界定范圍的文件，為全面覆蓋各類微生物測試，找出現(xiàn)有方法的局限性和可能的解決方案，以完善微生物檢測方法；然后，顧及到活性生物的生物學(xué)特性，考慮改編和改進(jìn)現(xiàn)有的測試方法或開發(fā)新的替代方法；國際植物傳粉者關(guān)系委員會(huì)(ICPPR)微生物研究小組正在進(jìn)行的工作將被考慮；③為免除對某些數(shù)據(jù)的要求，可以準(zhǔn)備具有科學(xué)論據(jù)的文件以滿足數(shù)據(jù)要求(如對蚯蚓和彈尾/彈尾測試的要求)。

2020 年，OECD 召開第十屆微生物農(nóng)藥工作組關(guān)于生物信息學(xué)和微生物農(nóng)藥管理研討會(huì)[25]。本屆會(huì)議主要探討生物信息學(xué)在微生物管理中的應(yīng)用。下列結(jié)論和建議作為會(huì)議的結(jié)果進(jìn)行了討論：

⑴人們認(rèn)為在國際間協(xié)調(diào)微生物農(nóng)藥登記所需要的基因組數(shù)據(jù)類型和數(shù)據(jù)評估方式是很重要的。

⑵微生物農(nóng)藥行業(yè)應(yīng)該學(xué)習(xí)其他領(lǐng)域正在發(fā)生的事情，例如向食品和飼料添加劑行業(yè)學(xué)習(xí)。

⑶由于管理當(dāng)局內(nèi)部的專業(yè)知識(shí)分析對現(xiàn)有數(shù)據(jù)的能力可能有限，因此可能需要針對新方法進(jìn)行培訓(xùn)。

⑷在這個(gè)階段，還沒有設(shè)想使用基因組測序，生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫將導(dǎo)致新的數(shù)據(jù)需求。WGS 可以用于處理微生物登記的某些數(shù)據(jù)要求，特別是在微生物鑒定、表征和抗菌物質(zhì)耐藥性基因確定方面。但是，應(yīng)進(jìn)一步考慮是否有可能使用WGS作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)需求。

⑸應(yīng)更多地利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估全面。

⑹關(guān)于如何利用生物信息學(xué)促進(jìn)微生物農(nóng)藥的登記，應(yīng)確定一些可能的研究案例。

可見，此次研討會(huì)是前瞻性的，對于生物信息學(xué)未來在新穎農(nóng)藥登記中的應(yīng)用前景目前仍保持謹(jǐn)慎態(tài)度。

5.2 美國EPA 開發(fā)的微生物測試方法

美國與1996 年最早開發(fā)了專用于微生物農(nóng)藥的各種測試方法指導(dǎo)[26]，最終目的依據(jù)美國農(nóng)藥法規(guī)FIFRA，為支持微生物農(nóng)藥登記而開發(fā)的，滿足對微生物防治劑的組成、環(huán)境影響和人類健康影響進(jìn)行測試的要求。

這些方法被稱為885 系列方法，覆蓋微生物農(nóng)藥評價(jià)的各個(gè)方面。

6 歐盟、美國和FAO/WHO 微生物農(nóng)藥登記要求特點(diǎn)比較

以下是筆者根據(jù)微生物農(nóng)藥登記資料的特點(diǎn)[27-29]，從幾個(gè)特殊方面的資料要求對歐盟、美國和FAO/WHO 的登記要求做了簡單的對比。

⑴批次分析：歐盟要求至少5 批次預(yù)案要分析。美國要求多批次分析，但是沒注明幾個(gè)批次。FAO/WHO 也要求3～5 批次的原藥和制劑樣品分析(適用于批次生產(chǎn)情況)。

⑵次生代謝產(chǎn)物：美國沒有提到微生物次生代謝產(chǎn)物，死的和活體微生物農(nóng)藥一樣管制。歐盟對次生代謝產(chǎn)物尤其關(guān)注。FAO/WHO 也在登記要求中始終關(guān)注相關(guān)次生代謝產(chǎn)物(毒素)。FAO/WHO 給出相關(guān)次生化合物(代謝物)的定義：與人類或動(dòng)物健康和/或環(huán)境有毒理學(xué)關(guān)系的任何次生化合物(代謝物)，一些毒素可以被認(rèn)為是相關(guān)的次生化合物(代謝物)。

⑶對抗菌素的耐藥性：歐盟特別關(guān)注微生物的抗菌素耐藥基因(antimicrobial resistance genes)，美國沒有提及。FAO/WHO 也要求提供微生物對人或獸醫(yī)用抗生素/抗菌劑的耐藥性/敏感性數(shù)據(jù)。

⑷美國和FAO/WHO 均按照使用模式有區(qū)別地要求登記資料。歐盟沒有強(qiáng)調(diào)這一點(diǎn)。除了公共衛(wèi)生用微生物農(nóng)藥以外，美國對其他微生物農(nóng)藥不要求提供藥效資料(美國對其他農(nóng)藥也如此)。而歐盟和FAO/WHO 要求較為詳細(xì)的藥效資料。

⑸美國和FAO/WHO 對殘留和環(huán)境歸宿等資料多為視情況而要求，以盡可能減免要求為宗旨。只要求某些關(guān)鍵的生態(tài)毒性資料如對鳥、蜜蜂、非靶標(biāo)昆蟲和某些水生生物的毒性數(shù)據(jù)。歐盟要求的信息和研究數(shù)據(jù)相對更多。

⑹污染微生物：歐盟要求相關(guān)污染微生物鑒定、含量和分析方法等，美國登記要求沒有要求相關(guān)資料，F(xiàn)AO/WHO 也要求污染微生物的相關(guān)資料。OECD 出臺(tái)有污染微生物限量規(guī)定。

⑺活性物質(zhì)(原藥)等同性認(rèn)定：歐盟登記資料要求沒有專門提及微生物活性物質(zhì)的等同性認(rèn)定。但是OECD 出臺(tái)有等同性認(rèn)定指導(dǎo)。美國沒有提到等同性認(rèn)定。

⑻修訂后的歐盟微生物資料要求引進(jìn)“證據(jù)權(quán)重法”，以便盡可能地利用現(xiàn)有資料，減少對不必要的試驗(yàn)研究的要求。

⑼美國和FAO/WHO 對登記資料的要求都有非常明確的說明，非常有利于主管部門和申請人理解掌握。相比之下，歐盟的說明則非常復(fù)雜，不確定性很大，不利于申請人理解和掌握，也極易增加評審結(jié)果的不確定性。

目前，全球不同地區(qū)/國家對生物農(nóng)藥的管理規(guī)定和登記要求差別很大。美國是全球生物農(nóng)藥登記要求最為靈活的，因此獲得登記投放市場的品種和數(shù)量均居前列。歐盟過去要求相對苛刻，因此登記進(jìn)程緩慢。

有些產(chǎn)品如植物農(nóng)藥和微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥，由于對其“有效成分”的認(rèn)定存在一定的困難，經(jīng)常延緩登記進(jìn)程，甚至導(dǎo)致登記失敗。研究發(fā)現(xiàn)，植物農(nóng)藥和微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥往往難以認(rèn)定某單一組分是所謂的“有效成分”，而是多個(gè)組分協(xié)同作用才產(chǎn)生可以接受的應(yīng)用效果。但是，管理者經(jīng)常要求登記申請者提供活性組分的一系列資料，這顯然是難以做到的，所需要的成本也是中小型企業(yè)難以負(fù)擔(dān)的。

因此，綜合考慮這類產(chǎn)品的安全性和在歷史上長期安全使用等因素給予產(chǎn)品登記授權(quán)，加快此類生物農(nóng)藥投放市場是一個(gè)更為切實(shí)可行的思路。像對待化學(xué)合成農(nóng)藥一樣對待生物農(nóng)藥的“有效成分”并提出類似要求則是不適當(dāng)?shù)摹?/p>

美國在這方面相對靈活。甚至有些微生物殺蟲劑的標(biāo)簽上把發(fā)酵產(chǎn)物整體計(jì)入有效物質(zhì)含量。如MBI 公司的微生物殺蟲劑Grandevo?標(biāo)簽顯示發(fā)酵物含量為30%(作為有效物質(zhì))，已在美國、新西蘭和智利獲得登記。該產(chǎn)品是一種基于微生物的殺蟲劑，其中包含數(shù)種活性化合物，可以驅(qū)避、阻止害蟲取食，減少繁殖并誘殺吮吸和咀嚼式害蟲如蒼蠅和螨蟲種群。

蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑在北美市場上銷售的Dipel?DF 標(biāo)簽含量為54%，是以發(fā)酵產(chǎn)物計(jì)量的。

MBI 公司的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品Majesten?的活性成分是失活的伯克霍爾德氏菌屬的A396 菌株(Burkholderiaspp.strain A396)的死細(xì)胞以及發(fā)酵液，殺線蟲的活性物質(zhì)來自于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝物。而且研究發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品中含有多種次生代謝產(chǎn)物[29]，它們的活性譜也不盡相同。這樣的產(chǎn)品能在美國獲得快速登記，而在歐盟是不可想象的。

7 小結(jié)

為了實(shí)現(xiàn)歐洲綠色協(xié)議和從農(nóng)場到餐桌戰(zhàn)略，歐盟于2022 年修訂了微生物農(nóng)藥監(jiān)管和登記要求及登記評審原則等，以促進(jìn)對環(huán)境和生態(tài)及人類更為友好的微生物農(nóng)藥的上市。從修訂后的登記要求可見，雖然修訂的初衷是加速微生物農(nóng)藥的上市，但在某些登記要求(如對次生代謝產(chǎn)物的資料要求以及對抗生素耐藥性的信息)上則更為嚴(yán)謹(jǐn)。為了減輕資料要求負(fù)擔(dān)，新修訂后的資料要求引進(jìn)了“證據(jù)權(quán)重法”以減少對某些試驗(yàn)研究的需要。雖然這次修訂比以往有一定的進(jìn)步，但是仍然有很多需要改進(jìn)的地方，諸多方面的登記要求仍然受化學(xué)農(nóng)藥登記要求的限制。