金曼 王彤輝 任小飛 李淼

數(shù)據(jù)顯示,肺癌死亡人數(shù)占癌癥死亡人數(shù)的20%,其死亡率在所有類型的腫瘤中排第一位[1]。因此,闡明肺癌進(jìn)展的潛在機制,并確定肺癌的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點迫在眉睫。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種具有內(nèi)源性和保守性的非編碼RNA,通過反向剪接形成共價閉合的連續(xù)環(huán),更穩(wěn)定可以用作有效診斷和治療癌癥的生物標(biāo)志物[2,3]。Tao等[4]發(fā)現(xiàn),circCPA4敲低可以在體外抑制細(xì)胞集落形成、遷移、侵襲、細(xì)胞周期進(jìn)程,并加速肺癌細(xì)胞的凋亡,且circCPA4缺乏可以抑制肺癌小鼠腫瘤生長。研究發(fā)現(xiàn)CircRNA-miRNA-mRNA 信號軸調(diào)節(jié)肺癌發(fā)展進(jìn)程[5]。且Sun等[6]發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-377-3p顯著加速非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞的體外生長和轉(zhuǎn)移以及體內(nèi)腫瘤的生長,而上調(diào)GGA3促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖[7]。本研究主要探究CircCPA4對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡以及EMT的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2020年8月至2022年10月在我院就診的20例肺癌患者肺癌組織及其相鄰正常組織樣本。組織樣品保存在-80℃冰箱。受試者均簽署書面知情同意書,本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。人肺癌細(xì)胞A549購自廈門逸漠生物科技有限公司;人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司;si-NC、si-CircCPA4、inhibitor NC、miR-377-3p inhibitor購自上海生工;CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自無錫云萃生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自弗元(上海)生物科技有限公司;GGA3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購自Abcam。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 (1)A549細(xì)胞接種于Dulbecco的改良DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基含有10%胎牛血清,將A549細(xì)胞在37℃、含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)待A549細(xì)胞生長至70%左右,根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒將si-NC、si-CircCPA4、si-CircCPA4+inhibitor NC、si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞,命名為si-NC組、si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組、si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor 組,另取未做任何處理的A549細(xì)胞記為NC組。轉(zhuǎn)染48 h后,用于后續(xù)實驗。

1.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測CircCPA4、miR-377-3p、GGA3關(guān)系 構(gòu)建CPA4野生型質(zhì)粒(CPA4-WT)和突變型質(zhì)粒(CPA4-MUT),將CPA4-WT和CPA4-MUT分別與mimic NC或miR-377-3p mimic共轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞分別記為miR-NC+WT-CPA4組、miR-377-3p mimic+WT-CPA4組、miR-NC+MUT-CPA4組、miR-377-3p mimic+MUT-CPA4組;構(gòu)建GGA3野生型質(zhì)粒(GGA3-WT)和突變型質(zhì)粒(GGA3-MUT),將GGA3-WT和GGA3-MUT分別與mimic NC或miR-377-3p mimic共轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞,分別記為miR-NC+WT-GGA3組、miR-377-3p mimic+WT-GGA3組、miR-NC+MUT-GGA3組、miR-377-3p mimic+MUT-GGA3組,48 h后評估A549細(xì)胞的熒光素酶活性變化。

1.4 qRT-PCR檢測CircCPA4、miR-377-3p表達(dá) 根據(jù)試劑盒說明書,使用Trizol試劑從肺癌組織和細(xì)胞中提取總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA、引物、MIX混合置于qRT-PCR儀擴增。以GAPDH、U6為內(nèi)參基因,用2-ΔΔCt方法計算CircCPA4、miR-377-3p的相對表達(dá)量。見表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.5 Western blot檢測GGA3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin以及凋亡蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液從A549細(xì)胞中提取蛋白質(zhì),并通過BCA試劑盒檢查蛋白質(zhì)濃度。使用SDS-PAGE電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后,用5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗GGA3(1∶1 000)、E-cadherin(1∶2 000)、N-cadherin(1∶2 000)、Vimentin(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000),4℃下孵育一夜,加入二抗常溫下繼續(xù)反應(yīng)1 h。最后加入ECL試劑顯色,Image J目的條帶灰度值分析。

1.6 CCK-8法檢測A549細(xì)胞增殖情況 將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以5×103個細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板上,隨后每孔加入10 μl CCK-8試劑在37℃下繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度(OD450)值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理后,消化并收獲細(xì)胞。然后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。去除PBS,將細(xì)胞重懸于100 μl緩沖液中。然后將細(xì)胞與5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色溶液在室溫下避光孵育。孵育10 min后,使用流式細(xì)胞儀分析凋亡情況。

1.8 Transwell試驗測定細(xì)胞遷移和侵襲 將基質(zhì)膠預(yù)包被在Transwell上室用于侵襲測定,而不包被基質(zhì)膠的上室用于遷移測定。上室加入5×104個/ml A549細(xì)胞,下室加入含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,孵育48 h后,用棉簽除去濾膜上的細(xì)胞,然后將Transwell室中的殘留細(xì)胞用4%多聚甲醛在4℃下固定10 min,結(jié)晶紫在室溫下染色5 min,并在顯微鏡下隨機選擇5個區(qū)域計算細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 CircCPA4靶向調(diào)控miR-377-3p /GGA3軸 通過TargetScan網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)CircCPA4與miR-377-3p ,miR-377-3p 與GGA3存在結(jié)合位點。與miR-NC+WT-CPA4組比較,miR-377-3p mimic+WT-CPA4組A549細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),而miR-377-3p mimic+MUT-CPA4組A549細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC+MUT-CPA4組無顯著改變(P>0.05);與miR-NC+WT-GGA3組比較,miR-377-3p mimic+WT-GGA3組A549細(xì)胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05),miR-377-3p mimic+MUT-GGA3組較miR-NC+MUT-GGA3組A549細(xì)胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1,表2、3。

圖1 TargetScan網(wǎng)站預(yù)測CircCPA4與miR-377-3p 、miR-377-3p 與GGA3的結(jié)合位點

表2 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CCircCPA4與miR-377-3p 的靶向關(guān)系 n=6,

表3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-377-3p與GGA3的靶向關(guān)系 n=6,

2.2 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3在組織和細(xì)胞中的表達(dá) 肺癌組織較相鄰正常組織CircCPA4、GGA3水平顯著升高(P<0.05),miR-377-3p顯著降低(P<0.05);與BEAS-2B細(xì)胞相比,A549細(xì)胞中CircCPA4、GGA3水平均顯著上調(diào)(P<0.05),miR-377-3p顯著下調(diào)(P<0.05)。見表4、5,圖2、3。

圖2 Western blot檢測肺癌組織及相鄰正常組織中GGA3蛋白表達(dá)

圖3 Western blot檢測細(xì)胞中GGA3蛋白水平

表4 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在組織中的表達(dá) n=20,

表5 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在細(xì)胞中的表達(dá) n=6,

2.3 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá) 與NC組、si-NC組相比,si-CircCPA4組CircCPA4、GGA3水平顯著下調(diào)(P<0.05),miR-377-3p表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);與si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組相比較,si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組GGA3水平顯著上升(P<0.05),miR-377-3p表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。見表6,圖4。

圖4 Western blot檢測A549細(xì)胞GGA3蛋白表達(dá);A NC組;B si-NC組;C si-CircCPA4組;D si-CircCPA4+inhibitor NC組;E si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組

表6 CircCPA4、miR-377-3p、GGA3蛋白在A549細(xì)胞中的表達(dá) n=6,

2.4 沉默CircCPA4或下調(diào)miR-377-3p 對A549細(xì)胞增殖的影響 與NC組、si-NC組相比,si-CircCPA4組A549細(xì)胞OD450值顯著減小(P<0.05);與si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組相比較,si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組OD450值顯著增加(P<0.05)。見表7。

表7 沉默CircCPA4或下調(diào)miR-377-3p對A549細(xì)胞OD450值的影響 n=6,

2.5 沉默CircCPA4或下調(diào)miR-377-3p 對A549細(xì)胞凋亡的影響 與NC組、si-NC組相比,si-CircCPA4組A549細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05);與si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組相比較,si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組A549細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。見表8,圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡

表8 沉默CircCPA4或下調(diào)miR-377-3p 對A549細(xì)胞凋亡率的影響 n=6,%,

2.6 沉默CircCPA4或下調(diào)miR-377-3p對A549細(xì)胞侵襲、遷移以及EMT相關(guān)蛋白的影響 si-CircCPA4組較NC組、si-NC組A549細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量以及N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著下降(P<0.05),E-cadherin蛋白水平顯著上升(P<0.05);si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組較si-CircCPA4組、si-CircCPA4+inhibitor NC組A549細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量以及N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表9、10,圖6～8。

圖6 Transwell檢測A549細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫染色×400)

圖7 Transwell檢測A549細(xì)胞侵襲(×400)

圖8 Western blot檢測細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá);A NC組;B si-NC組;C si-CircCPA4組;D si-CircCPA4+inhibitor NC組;E si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor組

表9 沉默CircCPA4或下調(diào)miR-377-3p 對A549細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)量的影響 n=6,個,

表10 沉默CircCPA4或下調(diào)miR-377-3p 對A549細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 n=6,

3 討論

近年來,circRNA由于其特殊的結(jié)構(gòu)和廣泛的分布,被認(rèn)為是人類癌癥中潛在的生物標(biāo)志物[8]。CircHIPK3沉默有效抑制肺癌細(xì)胞的存活和增殖,顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]。CircMAN2B2敲低顯著抑制了肺癌H1299和A549細(xì)胞的增殖和侵襲[10]。Hong等[11]發(fā)現(xiàn)Circ-CPA4調(diào)節(jié)NSCLC的細(xì)胞生長、干性、耐藥性和免疫逃逸。Tao等[4]也發(fā)現(xiàn)Circ-CPA4在肺癌中高表達(dá),Circ-CPA4上調(diào)可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的進(jìn)展。本研究中,在肺癌組織和肺癌細(xì)胞A549中CircCPA4高表達(dá)。通過細(xì)胞凋亡有效消除癌細(xì)胞一直是臨床癌癥治療的主要手段[12]。在本研究中,沉默CircCPA4后A549細(xì)胞OD450值顯著下降,A549細(xì)胞凋亡率顯著升高,暗示CircCPA4下調(diào)可能通過抑制A549細(xì)胞增殖,促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡來抑制肺癌發(fā)展。EMT是一個重要的發(fā)育過程,也與疾病病理生理學(xué)有關(guān),例如癌癥的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。EMT取決于細(xì)胞黏附分子表達(dá)的減少和緊密連接的喪失。研究表明,EMT的調(diào)節(jié)可能代表了一種針對NSCLC的新興治療方法[14]。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin是EMT常見標(biāo)志物,有研究報道,上調(diào)N-cadherin、vimentin蛋白水平,下調(diào)E-cadherin蛋白水平可以促進(jìn)肺癌EMT[15]。本研究中,CircCPA4沉默使A549遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)量、N-cadherin、Vimentin蛋白水平顯著下降,E-cadherin蛋白水平顯著升高,表明CircCPA4下調(diào)可能通過抑制EMT進(jìn)程,來抑制肺癌的進(jìn)展。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CircCPA4與miR-377-3p存在結(jié)合位點。miR-377-3p在肺癌中低表達(dá)已經(jīng)被證實,例如Ke等[16]發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-377-3p誘導(dǎo)肺部腫瘤發(fā)生。Hua等[17]也發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-377-3p促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展,且促進(jìn)異種移植小鼠中肺癌腫瘤的生長。以上研究均表明miR-377-3p影響肺癌進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示,miR-377-3p在肺癌組織及細(xì)胞低表達(dá),CircCPA4沉默促進(jìn)miR-377-3p表達(dá),而抑制miR-377-3p表達(dá)削弱了沉默CircCPA4抑制A549細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的效果。提示沉默CircCPA4可能通過上調(diào)miR-377-3p發(fā)揮抑制肺癌發(fā)展的作用。

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-377-3p與GGA3存在結(jié)合位點。據(jù)報道,GGA3與癌細(xì)胞的遷移、增殖和凋亡有關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)GGA3可以促進(jìn)NSCLC的細(xì)胞增殖、侵襲,抑制其凋亡[7]。本研究結(jié)果與其一致,GGA3在肺癌組織和A549細(xì)胞高表達(dá),且沉默CircCPA4降低了A549細(xì)胞中GGA3蛋白水平,而下調(diào)miR-377-3p則升高了GGA3蛋白水平,證實沉默CircCPA4可能通過上調(diào)miR-377-3p來抑制GGA3表達(dá),進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖、EMT,促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓沧C實CircCPA4靶向調(diào)控miR-377-3p/GGA3軸。

綜上所述,沉默CircCPA4可能通過上調(diào)miR-377-3p來抑制GGA3表達(dá),進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖、EMT進(jìn)程,促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。