盧蒙恩 崔蕎蕎 郭曉霞 馬智聰

骨折在臨床上是一種常見病、多發(fā)病。最新研究表明,我國(guó)每年發(fā)生創(chuàng)傷性骨折的人數(shù)超過400萬,且骨折發(fā)生率呈上升趨勢(shì)[1,2]。骨折愈合是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過程,是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞信號(hào)通路共同作用的結(jié)果[3]。艾司氯胺酮通過抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)發(fā)揮麻醉和鎮(zhèn)痛作用,廣泛應(yīng)用于骨科手術(shù)和術(shù)后鎮(zhèn)痛[4]。研究表明,艾司氯胺酮能夠促進(jìn)骨折愈合可能與增加骨折愈合中 BDNF、VEGF、BMP-2 的合成與釋放,但其研究存在一定的局限性,并未研究其他骨生長(zhǎng)相關(guān)因子[5]。本實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)大鼠脛骨骨折模型腹腔注射艾司氯胺酮后血清中降鈣素相關(guān)基因肽(CGRP)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、胰島素生長(zhǎng)因子1(IGF-1)濃度的變化,探討艾司氯胺酮對(duì)大鼠骨折后骨生長(zhǎng)相關(guān)因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 48只6周齡清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重(200±25)g,由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動(dòng)物置于20℃左右動(dòng)物房中分籠飼養(yǎng)1周,自由進(jìn)食水及食物,以適應(yīng)環(huán)境。隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分為2組,即:實(shí)驗(yàn)組(腹腔注射艾司氯胺酮40 mg·kg-1·24 h-1,稀釋至1 ml),對(duì)照組(腹腔注射0.9%氯化鈉溶液1 ml)。離心機(jī)(Thermo Fisher,美國(guó));LX-800酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,美國(guó))。艾司氯胺酮(廠家:江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào):210828BL);CGRP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒(廠家:江蘇酶免,批號(hào):MM-0490R1);NGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒(廠家:江蘇酶免,批號(hào):MM-0187R1);IGF-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)盒(廠家:江蘇酶免,批號(hào):MM-0197R1)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立:將48只SD大鼠隨機(jī)均分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,禁飲食12 h后使用7%水合氯醛麻醉,于骨折模型打擊器下方仰臥位固定大鼠四肢,將右側(cè)脛骨備皮后外展內(nèi)旋固定于鐵砧上,將2.5 kg砝碼抬高至15 cm處自由下落致脛骨中段橫行骨折。在脛骨平臺(tái)處切皮、碘伏消毒,將0.8 mm克氏針插入髓腔,并行手法將骨折端復(fù)位后逆行插入骨折遠(yuǎn)端固定,0.9%氯化鈉溶液沖洗后,關(guān)閉切口。為預(yù)防感染,造模后2組大鼠分籠飼養(yǎng),5 d內(nèi)肌內(nèi)注射青霉素8 萬/100 g,隔日用碘伏消毒傷口。自造模后第1天起,實(shí)驗(yàn)組每日腹腔內(nèi)注射艾司氯胺酮40 mg/kg,稀釋至1 ml,對(duì)照組每日腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液1 ml。

1.2.2 標(biāo)本收集與處理:在造模后第1周、2周、4周分別從2組隨機(jī)選取8只禁飲食大鼠,腹腔給予7%水合氯醛麻醉后,于頸動(dòng)脈置管取血,離心后置于-80℃冰箱保存待檢。取血后保留大鼠右側(cè)脛骨,4%多聚甲醛在4℃下固定24 h后使用20%乙二胺四乙酸脫鈣1個(gè)月,脫鈣完成后取骨痂組織,脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟,HE染色,在顯微鏡下觀察骨痂組織學(xué)特征。

1.2.3 Elisa法檢測(cè)2組大鼠血清中CGRP、NGF、IGF-1在各時(shí)間點(diǎn)的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況 實(shí)驗(yàn)過程中48只SD大鼠未出現(xiàn)麻醉并發(fā)癥,術(shù)后切口未出現(xiàn)感染,均進(jìn)入結(jié)果分析。

2.2 HE染色組織學(xué)比較 1周時(shí)對(duì)照組HE染色可見少量纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞產(chǎn)生,實(shí)驗(yàn)組HE染色可見大量纖維細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),新生血管增多;2周時(shí)對(duì)照組HE染色可見纖維細(xì)胞及少量軟骨組織和骨小梁存在,實(shí)驗(yàn)組HE染色可見大量纖維細(xì)胞及軟骨組織存在,且骨小梁生成增多;4周時(shí)對(duì)照組HE染色可見纖維細(xì)胞及軟骨組織,骨小梁較成熟,實(shí)驗(yàn)組HE染色可見大量纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞,骨小梁成熟良好,且多為編織骨。見圖1。

圖1 2組建模后不同時(shí)間點(diǎn)骨組織形態(tài)(HE×100)

2.3 2組CGRP濃度比較 建模后對(duì)照組血清中CGRP濃度在2周時(shí)達(dá)到高峰,實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間變化呈升高趨勢(shì),不同時(shí)間點(diǎn)均比對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血清中CGRP濃度比較 n=24,pg/ml,

2.4 2組IGF-1濃度比較 建模后對(duì)照組血清中IGF-1濃度在2周時(shí)達(dá)到高峰,實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間變化呈升高趨勢(shì),不同時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血清中CGF-1濃度比較 n=24,ng/ml,

2.5 2組NGF濃度比較 建模后對(duì)照組血清中NGF濃度在2周時(shí)達(dá)到高峰,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組在1周時(shí)有明顯升高,但在2周及4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組血清中NGF濃度較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)2組大鼠血清中NGF濃度比較 n=24,pg/ml,

3 討論

骨折愈合過程中,細(xì)胞因子在其中發(fā)揮著重要作用,它們能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)合成等過程,促進(jìn)骨愈合,其中CGRP、IGF-1、NGF是骨生長(zhǎng)相關(guān)因子。

艾司氯胺酮麻醉和鎮(zhèn)痛效果是R-氯胺酮的4倍,且不良反應(yīng)的發(fā)生率較氯胺酮明顯降低,被廣泛應(yīng)用于骨科、神經(jīng)外科及婦產(chǎn)科等手術(shù)和術(shù)后發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用[4]。研究表明,艾司氯胺酮能夠促進(jìn)骨折愈合,這與其增加骨生長(zhǎng)相關(guān)因子的合成和釋放有關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 建立大鼠脛骨骨折模型后,通過腹腔注射艾司氯胺酮,實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中CGRP、IGF-1水平在1、2、4周時(shí)明顯上調(diào),而NGF水平只在1周時(shí)明顯升高,2、4周時(shí)表現(xiàn)為下降。

CGRP是一種廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng),具有促進(jìn)成骨以及合成血管的神經(jīng)肽[6]。已被證實(shí),CGRP在骨折局部濃度明顯升高[7]。孫東良等[8]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,在腦外傷后合并骨折中,骨折端CGRP在骨折愈合的早中期表達(dá)增高,有利于多種細(xì)胞趨化、增殖與分化,促進(jìn)成骨。有研究表明,骨折愈合過程由成骨細(xì)胞(osteoblast,OB)介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)介導(dǎo)的骨吸收共同參與完成,而這一過程與核因子與核因子 κB 受體活化因子(receptor activator of nuclear factor κB,RANK)/核因子 κB 受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand,RANKL)/骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin,OPG)信號(hào)通路緊密聯(lián)系[9]。有學(xué)者指出CGRP刺激OB分化,同時(shí)通過RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)抑制OC的形成[10]。Kadriu等[11]發(fā)現(xiàn)氯胺酮在治療重度抑郁癥患者時(shí)能夠顯著增加OPG/RANKL比率和血漿中OPG水平,肖嘯等[12]研究發(fā)現(xiàn),CGRP在一定濃度范圍內(nèi)可以增強(qiáng)OPGmRNA 的表達(dá),同時(shí)抑制 RANKL mRNA 的表達(dá),并且能夠明顯上調(diào) OPG/RANKL 的比值。結(jié)合本實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組血清中CGRP在各時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組(P<0.05),認(rèn)為艾司氯胺酮促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能與血清中CGRP水平上調(diào),增加OPG/RANKL比率有關(guān)。

IGF-1是一種促進(jìn)生長(zhǎng)的內(nèi)分泌激素,對(duì)細(xì)胞增殖、骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育及骨量和骨密度的維持方面起著重要的調(diào)控作用[13]。有研究表明,IGF-1通過活化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白,刺激募捐間的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化,從而維持適當(dāng)?shù)墓俏⒔Y(jié)構(gòu)和骨量[14]。有學(xué)者指出IGF-1在骨形成及骨重建方面也有著重要調(diào)節(jié)效應(yīng)[15]。說明IGF-1在骨細(xì)胞的增殖分化中起著重要的調(diào)控作用。在骨的重建過程中,骨基質(zhì)釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和IGF-1協(xié)同促進(jìn)骨吸收和骨形成,加速骨的重建[16]。Wang等[17]在處理大鼠尿路上皮細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn),使用氯胺酮可以促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)。另有研究表明,氯胺酮能夠增加內(nèi)側(cè)前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC)突觸體制備的突觸蛋白,進(jìn)而誘導(dǎo)釋放IGF-1[18]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中2組大鼠IGF-1水平研究結(jié)果,我們認(rèn)為艾司氯胺酮促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制可能與mPFC的突觸蛋白增加,進(jìn)而誘導(dǎo)IGF-1表達(dá)增加有關(guān)。

NGF是一種促進(jìn)中樞和外周神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、成熟和可塑性的重要調(diào)節(jié)因子[19]。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn),骨折愈合過程中NGF在骨膜基質(zhì)祖細(xì)胞和骨折相關(guān)的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)明顯上調(diào),并促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)和發(fā)育。而骨折的愈合和形成與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持密切相關(guān),說明NGF在一定程度上能夠促進(jìn)骨折愈合。另有研究發(fā)現(xiàn),NGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)以及新生血管的成熟[21-23]。進(jìn)一步印證NGF促進(jìn)骨折愈合的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在骨折斷端局部注射治療NGF后,骨痂生成量明顯增多,骨痂剛度和抗折彎強(qiáng)度也顯著增加[24]。馬樂圓等[25]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),NGF在骨折伴顱腦損傷的大鼠模型中明顯增加并加速骨折愈合。根據(jù)劉建軍等[26]應(yīng)用NGF治療骨折大鼠的研究,結(jié)果顯示NGF能夠明顯促進(jìn)IGF-1的分泌,進(jìn)而促進(jìn)成骨。本實(shí)驗(yàn)中,相較對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組NGF水平在1周時(shí)明顯上升,HE染色組織學(xué)結(jié)果顯示術(shù)后1周時(shí)大量纖維細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),新生血管增多,提示艾司氯胺酮在短期內(nèi)能夠促進(jìn)骨折愈合,并上調(diào)NGF水平,但在2、4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組NGF水平較空白組顯著下降,這一結(jié)論與Ke等[27]研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮慢性濫用者的血清中NGF水平明顯低于健康人相符。根據(jù) Rapp等[28]阻斷小鼠NGF/ 酪氨酸激酶受體 (tyrosine kinase receptor A,TrkA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)并不會(huì)影響骨折愈合的研究結(jié)果,提示長(zhǎng)期應(yīng)用艾司氯胺酮會(huì)導(dǎo)致NGF水平降低,但對(duì)骨折愈合無影響。另外給予NGF抗體或TrkA免疫球蛋白(TrkA-IgG)可消除或抑制NGF的增加[29],而萬麗等[30]觀察NMDA受體非特異性拮抗劑氯胺酮對(duì)甲醛致炎小鼠疼痛行為學(xué)的影響發(fā)現(xiàn),至炎小鼠在注射40 mg/kg氯胺酮后背根節(jié)酪氨酸激酶受TrkA表達(dá)會(huì)受到抑制,我們認(rèn)為艾司氯胺酮長(zhǎng)期應(yīng)用導(dǎo)致NGF水平下調(diào)可能與NGF特異性受體TrkA受到抑制有關(guān)。

綜上所述,CGRP、IGF-1、NGF的是艾司氯胺酮促進(jìn)骨折愈合的相關(guān)因子,這些因子的作用可能是由于艾司氯胺作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),影響機(jī)體相關(guān)因子的產(chǎn)生和釋放而發(fā)揮作用,為臨床治療提供了新的思路和方法。