王曉露 成瑩 沐超 胡新榮

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤,其病因多樣。每年因?qū)m頸癌死亡的女性超過50萬人[1],盡管接種人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)疫苗使得宮頸癌的發(fā)病率和死亡率都有所下降,但疫苗接種并不能完全阻止宮頸癌的發(fā)生,且對已患宮頸癌的女性也無治愈作用[2]?，F(xiàn)階段,治療宮頸癌的原則仍以手術(shù)為主并輔以放化療等方式[3],這些手段對中晚期宮頸癌患者的效果并不十分理想[4,5]。因此,臨床上需要更有效、更具有針對性的治療手段。細(xì)胞翻譯功能將攜帶遺傳信息的信使RNA轉(zhuǎn)化為具有功能活性的蛋白質(zhì),保證細(xì)胞存活的同時行使特定細(xì)胞功能活動[6]。腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為是翻譯功能將細(xì)胞紊亂的遺傳信息傳遞出來的一種外在表象。通過抑制腫瘤細(xì)胞的翻譯功能來抑制細(xì)胞表型已被證實(shí)可行[7],由此猜想聯(lián)合敲減翻譯相關(guān)基因是否可以大幅抑制宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為?真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor,eIF4E)是一種致癌基因,eIF4E蛋白作為一種高度保守的mRNA帽結(jié)合蛋白質(zhì),控制著蛋白質(zhì)的帽依賴性翻譯的起始,帽依賴性翻譯是真核生物蛋白質(zhì)主要翻譯方式[8]。研究表明,eIF4E通過與多條信號通路密切聯(lián)系參與腫瘤發(fā)生;在宮頸癌細(xì)胞中eIF4E被異常激活后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和遷移能力[9,10]。Y盒結(jié)合蛋白1(Y-Box binding protein-1,YB-1)同樣也是一種致癌基因,YB-1蛋白有3個結(jié)構(gòu)域:氨基酸N末端(A/P domain)、親水結(jié)構(gòu)域末端(C-terminal domain,CTD)和冷休克結(jié)構(gòu)域(cold shock domain,CSD),3個結(jié)構(gòu)域參與多種生物學(xué)功能。研究表明,YB1基因在多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起作用,YB-1與促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和腫瘤細(xì)胞的遷移等密切相關(guān)[11];除此之外,在腫瘤細(xì)胞中YB1還通過充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)或下調(diào)從而激活/抑制基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)細(xì)胞翻譯[12]。YB1基因在多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中起作用[13-17]。與其他腫瘤相比,eIF4E和YB1基因在宮頸癌上的研究相對較少,因此, 這兩個基因在宮頸癌上還有很多值得探究的地方。通過初步探索聯(lián)合敲減YB1和eIF4E基因?qū)m頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為的影響,為后續(xù)探究YB1和eIF4E基因在宮頸癌中的具體作用以及分子機(jī)制提供更好的參考依據(jù),為將來宮頸癌靶向治療藥物的開發(fā)提供一條新的思路,同時希望為臨床宮頸癌的治療提供一條新路徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo Scientific公司);TS100倒置式生物顯微鏡(美國Thermo Scientific公司);SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州市凈化設(shè)備廠)潔凈工作臺(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司);胎牛血清 FBS(貨號 10270-106),(美國 GIBCO 公司 );DMEM高糖培養(yǎng)基(貨號 C11995500BT),(美國 GIBCO 公司);青-鏈霉素溶液(北京索萊寶科技有限公司);胰酶(北京索萊寶科技有限公司);eIF4E上下游引物(上海捷瑞公司);CCK-8試劑盒(貨號 CK04)(日本同仁公司);Matrigel膠(BD Bioscience);Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(上海 invitrogen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及分組情況 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:宮頸癌HeLa細(xì)胞和C33a細(xì)胞(購自協(xié)和細(xì)胞庫),分組:HeLa細(xì)胞系:mock空白對照組、NC組、sh-YB1組、Si-eIF4E組、 共敲減shYB1+Si-eIF4E組;C33a細(xì)胞系:mock空白對照組、NC組、shYB1組、Si-eIF4E組、shYB1+Si-eIF4E組。

1.3 慢病毒干擾載體 慢病毒干擾載體由上海吉瑪基因公司構(gòu)建,載體名稱: LV3-4YB1-Homo-540904,sh-YB1 序列為: 5’-GGATATGGTTTCATCAACA-3’。實(shí)驗(yàn)過程按說明書操作。見圖1。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HeLa(mock和sh-YB1)、C33a(mock和sh-YB1)細(xì)胞,待細(xì)胞匯合度達(dá)90%時進(jìn)行傳代,分別加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化,1 000 r/min離心5 min ,棄上清液加入3 ml的完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度達(dá)90%時按照以上步驟再次傳代,細(xì)胞傳至第三代時轉(zhuǎn)染。細(xì)胞接種至六孔板,培養(yǎng)至密度約60%時轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞用 Trizol 法提取細(xì)胞RNA,并進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,PCR進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參GAPDH,根據(jù)熔解曲線判斷 RT-qPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。見表1。

表1 RT-qPCR 擴(kuò)增引物序列

1.6 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活性 轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞消化離心完全培養(yǎng)基4 ml重懸,將細(xì)胞吹打混勻后計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。取96孔板5塊,分別標(biāo)記 0、24、48、72、96 h,每孔細(xì)胞數(shù)量3 000個,體積100 ml,消耗系數(shù)1.1,設(shè)置5個復(fù)孔,置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng): 0、24、48、72、96 h。屆時每孔加入現(xiàn)配CCK-8混合液(CCK-8溶液:基礎(chǔ)培養(yǎng)基=1∶10)110 μl。培養(yǎng)箱避光孵育2 h,酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測96孔板吸光度(OD 值),抑制率=[(對照孔吸光度-實(shí)驗(yàn)孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

1.7 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞做好標(biāo)記后消化離心重懸計(jì)數(shù)。六孔板每孔細(xì)胞數(shù)量1 500個,體積2 000 ml,設(shè)置3個復(fù)孔,置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)每個克隆斑細(xì)胞數(shù)>50 個細(xì)胞即終止培養(yǎng),舊培養(yǎng)基吸出、風(fēng)干,后甲醛固定結(jié)晶紫染色,相機(jī)拍照記錄,Image J軟件計(jì)數(shù)克隆?？寺⌒纬陕?=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Matrigel 膠冰箱 4℃ 融化,按照基質(zhì)膠:DMEM 培養(yǎng)基=1∶10 稀釋基質(zhì)膠,用預(yù)冷的100 μl槍頭吸取50ul基質(zhì)膠加入Transwell小室,之后將24孔板置于培養(yǎng)箱中過夜。次日, 24孔板中加入600 μl 15%FBS無雙抗完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞消化離心(方法同上),1 ml無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)并將細(xì)胞稀釋至105個/ml,上室中加入100 μl 細(xì)胞懸液,培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。移液器小心吸除上室內(nèi)液體,PBS清洗2遍,吹干小室膜,甲醇固定結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡鏡下拍照,隨機(jī)選取4個視野照相,利用 Image J 軟件統(tǒng)計(jì)照片的細(xì)胞數(shù),計(jì)算平均值。

1.9 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)中無需加入基質(zhì)膠,其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR、western blot檢測轉(zhuǎn)染效果 分別在24 h、48 h,收集細(xì)胞檢測YB1及eIF4E的 mRNA和蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明:敲減YB1和eIF4E基因后其mRNA和蛋白表達(dá)量明顯下降,mRNA表達(dá)量下降均>60%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);蛋白質(zhì)表達(dá)量下降幅度均>55%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明YB1和eIF4E基因敲減效率較高,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2,圖2、3。

表2 HeLa及C33a系細(xì)胞敲減eIF4E和YB1基因后mRNA和蛋白表達(dá)量

圖2 瞬時轉(zhuǎn)染SiRNA-eIF4E后各組YB1與eIF4E的mRNA相對表達(dá)量;A HeLa細(xì)胞;B HeLa(sh-YB1)細(xì)胞;C C33a細(xì)胞;D Ca33a(sh-YB1)細(xì)胞

圖3 瞬時轉(zhuǎn)染SiRNA-eIF4E后各組YB1與eIF4E的蛋白相對表達(dá)量;A HeLa細(xì)胞;B HeLa(sh-YB1)細(xì)胞;C C33a細(xì)胞;D Ca33a(sh-YB1)細(xì)胞

2.2 敲減YB1和eIF4E對宮頸癌細(xì)胞增殖和平板細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.2.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HeLa和C33a細(xì)胞敲減YB1和eIF4E基因后細(xì)胞增殖能力受到抑制,sh-YB1組、Si-eIF4E組及共敲減YB1+eIF4E組與mock組及NC組之間細(xì)胞吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在增殖能力上:mock 組 與NC組 OD 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。敲減YB1和(或)eIF4E基因后,細(xì)胞吸光度下降明顯(P<0.05),且sh-YB1+Si-eIF4E組吸光度較sh-YB1或Si-eIF4E均減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.2 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)表明, sh-YB1組、Si-eIF4E及共敲減YB1+eIF4E組克隆形成數(shù)量明顯低于mock組及NC組HeLa細(xì)胞系中與mock組相比sh-YB1組及Si-eIF4E組和共敲減YB1+eIF4E組平板細(xì)胞克隆形成率分別降低了27.1%、39.5%和68.3%(P<0.05);C33a細(xì)胞系中與mock組相比sh-YB1組、Si-eIF4E組和共敲減YB1+eIF4E組細(xì)胞克隆形成率分別降低了41.8%、47.8%和77.1%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3～5,圖4、5。

表3 5組細(xì)胞增殖活性HeLa細(xì)胞吸光度

表4 5組細(xì)胞增殖活性C33a細(xì)胞吸光度

表5 HeLa細(xì)胞系與C33a細(xì)胞系細(xì)胞克隆形成數(shù)目 個,

圖4 共敲減YB1和eIF4E基因抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力;A HeLa細(xì)胞系;B C33a細(xì)胞系

圖5 共敲減YB1和eIF4E基因抑制宮頸癌細(xì)胞的克隆形成能力(結(jié)晶紫染色×100);A HeLa細(xì)胞系;B C33a細(xì)胞系

2.3 敲減YB1和eIF4E對宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HeLa和C33a細(xì)胞分別敲減YB1和eIF4E基因后細(xì)胞侵襲和遷移能力受到抑制,sh-YB1組、Si-eIF4E組和共敲減YB1+eIF4E組相比于mock組及NC組之間穿過小室的細(xì)胞明顯減少,且穿過小室的細(xì)胞數(shù)目:共敲減YB1+eIF4E組

表6 共敲減YB1和eIF4E基因抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力

表7 共敲減YB1和eIF4E基因抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力

圖6 共敲減YB1和eIF4E基因抑制宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力(結(jié)晶紫染色×100);A HeLa細(xì)胞系;B C33a細(xì)胞系

圖7 共敲減YB1和eIF4E基因抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力(結(jié)晶紫染色×100);A HeLa細(xì)胞系;B C33a細(xì)胞系

3 討論

宮頸癌手術(shù)術(shù)后身體機(jī)能恢復(fù)過程漫長,諸多后遺癥也會伴隨患者終身,嚴(yán)重的甚至降低患者的生活質(zhì)量[1,7]。HeLa細(xì)胞作為第一個被分離出來的宮頸癌永生化細(xì)胞被廣泛用于腫瘤研究中,HeLa細(xì)胞為侵襲性腺癌HPV18+宮頸癌細(xì)胞;C33a細(xì)胞是染色體數(shù)目為46的假二倍體HPV-宮頸癌細(xì)胞。通過對HPV+和HPV-的兩種宮頸癌細(xì)胞的研究使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加客觀全面。聯(lián)合敲減eIF4E和YB-1基因減弱宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力深入研究聯(lián)合敲減eIF4E和YB-1將對臨床宮頸癌治療靶向藥物的開發(fā)有著重要意義。

eIF4E是eIF4F的組成部分,其含量及活性會影響eIF4F復(fù)合物的形成,eIF4E作為eIF4F的限速分子控制翻譯的進(jìn)程:真核生物蛋白質(zhì)翻譯起始時依賴于mRNA 的 5’端的 m7G 帽結(jié)構(gòu),eIF4E蛋白一邊識別并結(jié)合mRNA 的5’端的 m7G 帽結(jié)構(gòu)形成eIF4E -mRNA復(fù)合物[18];一邊與支架蛋白eIF4G相互作用;eIF4E-mRNA、eIF4G和解旋酶eIF4A結(jié)合形成eIF4F翻譯復(fù)合物,在核糖體上進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯[7]。研究表明,腫瘤細(xì)胞中eIF4E被異常激活,表達(dá)量增高;異常增高的eIF4E通過激活下游myc、BCL2、β-catenin等基因直接/間接調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力[19-21],本實(shí)驗(yàn)表明,敲減eIF4E基因,抑制了宮頸癌中eIF4E基因的表達(dá),明確減少eIF4E蛋白表達(dá)量,顯著降低宮頸癌細(xì)胞的增殖率、遷移率以及侵襲率,對宮頸癌惡性生物學(xué)行為的抑制是有效的。

YB-1屬于Y盒家族,Y盒是CCAAT盒中啟動子盒增強(qiáng)子中發(fā)現(xiàn)的重要序列基序[22]。磷酸化YB1穿梭核膜進(jìn)入到核內(nèi)充當(dāng)生長相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá);胞質(zhì)中的YB1與RNA結(jié)合,調(diào)控mRNA的翻譯[23];通過胞質(zhì)、核內(nèi)的聯(lián)合作用,YB1參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯各過程并調(diào)控其他腫瘤因子[24,25]。研究表明,YB1通過調(diào)控cyclin D1、Twist等基因的表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的能力[26,27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲減YB-1基因減弱了宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力,由此猜測,YB1通過與多種基因的相互作用在宮頸癌惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮著復(fù)雜的作用。

盡管eIF4E和YB-1都調(diào)控腫瘤的翻譯過程,但這兩個基因卻代表了兩種完全不同的翻譯方式:帽式翻譯和非帽式翻譯[28,29]。真核生物通過帽式/非帽式翻譯蛋白質(zhì),共敲減eIF4E和YB-1意在阻止宮頸癌細(xì)胞的帽式和非帽式翻譯功能,以此阻止腫瘤進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)證明,共同敲減eIF4E和YB-1基因后,對宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制率大于單獨(dú)敲減任一基因。但由于細(xì)胞活動的復(fù)雜性和基因之間的敲減率并不相同等條件影響,本實(shí)驗(yàn)存在一定的局限性。

綜上所述,YB1和eIF4E基因與宮頸癌的增殖侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為相關(guān)。聯(lián)合敲減YB1和eIF4E基因致使宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力明顯下降。為深入討論YB1、eIF4E基因?qū)m頸癌HeLa、C33a細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的具體分子機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。