楊光凱 薛詩怡 李嘉禎 李匯斌 高燕 張小軍 郝燕燕

摘要：【目的】測定紅寶石蘋果果實有機(jī)酸組成及其含量，分析蘋果酸含量變化與其代謝相關(guān)酶的關(guān)系，探究紅寶石果實低酸特性的生理基礎(chǔ)?！痉椒ā恳圆煌L發(fā)育期紅寶石和富士2001 蘋果果實為試驗材料，采用蒽酮比色法測定果實總糖含量，高效液相色譜法測定有機(jī)酸組分及含量，測定分析果實蘋果酸相關(guān)代謝酶活性及與蘋果酸含量的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】紅寶石蘋果果實中有機(jī)酸成分主要為蘋果酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和琥珀酸5 種，與富士2001 蘋果果實中有機(jī)酸組分一致，其皆以蘋果酸為主。不同發(fā)育期2 個蘋果品種果實中總糖含量相近，但總酸含量差異顯著。對果實有機(jī)酸不同組分定量分析，發(fā)現(xiàn)果實總酸含量差異主要是由蘋果酸含量差異所致。進(jìn)一步分析蘋果酸含量與其相關(guān)代謝酶活性之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育前期紅寶石蘋果果實中蘋果酸含量大量積累，主要是該時期NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）活性增強(qiáng)促進(jìn)了蘋果酸的大量合成，以及NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）活性降低減少了蘋果酸的分解，富士2001 蘋果與之類似。【結(jié)論】紅寶石蘋果是蘋果酸為主的低酸型蘋果品種，NADP-ME和NAD-MDH在其果實蘋果酸積累中起主要協(xié)同調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：紅寶石蘋果；有機(jī)酸；高效液相色譜；蘋果酸代謝酶

中圖分類號：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）05-0884-09

蘋果是世界四大水果之一，在我國已有兩千多年栽培歷史。我國蘋果種植面積和產(chǎn)量均居世界首位，但在單產(chǎn)和果品質(zhì)量等方面，與日本、美國、新西蘭等國家還存在一定的差距。提高果品品質(zhì)已成為我國蘋果產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展亟需解決的問題之一[1]。果實糖酸組分及含量是果實風(fēng)味的重要組成部分，近年來有關(guān)果實糖酸形成及代謝調(diào)控相關(guān)研究已受到廣泛關(guān)注[2-3]。糖酸比是園藝植物果實風(fēng)味評價的重要指標(biāo)，而果實有機(jī)酸組分與含量影響著糖酸比[3-4]。

果實有機(jī)酸根據(jù)碳結(jié)構(gòu)可分為脂肪族羧酸（蘋果酸、酒石酸等）、糖衍生有機(jī)酸（葡萄糖醛酸等）和酚酸（硝酸、水楊酸等）[5]。大多數(shù)園藝植物果實中含有一種或兩種主要有機(jī)酸，按照成熟果實中有機(jī)酸的組分及含量可分為：檸檬酸型（柑橘類水果）、蘋果酸型（蘋果、梨等）和酒石酸型（葡萄等）[6]。在蘋果果實中，蘋果酸為主要有機(jī)酸，約占總有機(jī)酸含量的90%，且野生蘋果較栽培蘋果酸性更強(qiáng)，果實蘋果酸含量變化更大[5，7]。已有研究表明果實蘋果酸主要由草酰乙酸（OAA）經(jīng)蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）作用在細(xì)胞質(zhì)中合成，并通過NAD-MDH和NADP蘋果酸酶（NADP-ME）降解為OAA 和丙酮酸[8]。此外，蘋果酸還可分別通過三羧酸（TCA）循環(huán)和乙醛酸循環(huán)在線粒體和乙醛氧體中生成，其合成代謝途徑主要受到蘋果酸脫氫酶（NAD- MDH）的調(diào)控[9-11]。除NAD-MDH外，NADP-ME和PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）在蘋果酸代謝中也扮演著重要角色，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶[12]。目前，已在蘋果[13-14]、梨[15-16]、桃[17-18]、杏[19-20]、李[21]等多種果實中證實NAD-MDH、NADP-ME和PEPC 3 種酶協(xié)同作用影響果實蘋果酸的積累。紅寶石蘋果是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所于20 世紀(jì)80 年代選育的蘋果品種，低酸高糖是其一大特色。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紅寶石蘋果果實在整個發(fā)育期幾乎感覺不到酸味，而公認(rèn)的低酸品種富士2001 蘋果則酸味較明顯。為探究紅寶石蘋果果實超低酸特性的生理機(jī)制，筆者在本研究中以紅寶石蘋果和富士2001 蘋果果實為試驗材料，分析2 個品種果實中有機(jī)酸組分、不同發(fā)育階段含量，蘋果酸代謝酶活性的差異及動態(tài)變化規(guī)律，探究紅寶石蘋果果實低酸的生理基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究紅寶石蘋果果實有機(jī)酸代謝的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為紅寶石蘋果和富士2001 蘋果，成熟期皆為10 月下旬，樹齡8 年，喬化栽培，砧木為平邑甜茶，株行距4 m×5 m。分別選取2 個品種長勢一致且良好的3 株樹進(jìn)行樣品采集。紅寶石蘋果和富士2001 蘋果均于2020 年5 月20 日開始采集樣品，共取樣7 次，分別為：花后40 d、花后80 d、花后110 d、花后140 d、花后155 d、花后170 d 以及花后200 d。每次取樣在每一植株樹冠外圍不同方向各選取3 個大小較一致，且整體狀況良好的果實。樣品前處理：果實去皮去核切成小塊并混合樣品后加液氮速凍，保存于超低溫冰箱（-80 ℃），用于總糖、有機(jī)酸含量測定及蘋果酸代謝相關(guān)酶活性分析。

1.2 方法

1.2.1 果實總糖含量測定 果實總糖含量采用蒽酮比色法測定。

1.2.2 果實有機(jī)酸含量測定 果實有機(jī)酸提取及含量測定參考郭燕等[22]的方法。準(zhǔn)確稱取1.00 g果肉，加入適量液氮研磨成粉末，加入適量超純水使提取液達(dá)到5 mL，室溫水浴超聲提取30 min，12 000 r ·min-1離心15 min 后將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL的容量瓶中，殘渣再加入超純水5 mL，再次離心15 min，合并上清液，用超純水定容，提取液過0.45 μm微孔濾膜，利用U3000 型高效液相色譜儀測定有機(jī)酸含量。果實總酸含量由各有機(jī)酸含量相加計算得出。

色譜條件：色譜柱為Syncronis C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為0.01 mol ·L- 1 KH2PO4，pH 為2.5（磷酸調(diào)節(jié)）；流速0.5 mL · min- 1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測器為VWD紫外檢測器，檢測波長215 nm。各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純。5 種有機(jī)酸均能在20 min內(nèi)被完全分離，且峰形正常，分離效果良好。各有機(jī)酸被分離的先后順序依次為草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸。根據(jù)單個標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間確定各有機(jī)酸組分，各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的R2為0.997 2～0.999 2，線性關(guān)系良好，回收率為99.5%～101.5%，精密度較高，符合分析方法的要求。果實中有機(jī)酸含量的測定作3 次重復(fù)，采用峰面積歸一法計算含量，最終含量（w）用mg·g-1表示。

1.2.3 果實蘋果酸相關(guān)代謝酶活性測定 參照王鵬飛等[23]和史娟等[24]的方法，所有操作在0～4 ℃環(huán)境下進(jìn)行。將1.00 g 果肉加液氮迅速研磨成粉末，加6 mL提取緩沖液[0.2 mol·L-1 Tris-HCl 緩沖液（pH=8.2）、0.6 mol · L- 1 蔗糖、10 mmol · L- 1 異抗壞血酸]，4 ℃下12 000 r ·min-1 離心20 min，取上清液定容至10 mL，取其中5 mL用于測定NAD-MDH（NAD-蘋果酸脫氫酶）和NADP-ME（NADP-蘋果酸酶）活性，剩余酶液加入透析袋，4 ℃下在大量提取緩沖液中透析過夜，用于測定PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）活性。采用UV-2450 型紫外可見分光光度計測定酶活性，以1 min OD值變化0.01 作為1 個酶活性單位，酶活性（以蛋白質(zhì)計）表示為（U·mg-1），3次重復(fù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2010 和Origin 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行差異顯著性分析（Duncan 新復(fù)極差法），應(yīng)用SPSS 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實中可溶性糖含量的變化

由圖1 可知，在整個果實發(fā)育期，紅寶石蘋果果實可溶性糖含量的動態(tài)變化趨勢與富士2001 蘋果基本一致，整體呈增加趨勢。在果實發(fā)育初期（花后40～80 d）和果實發(fā)育后期（花后170～200 d）二者可溶性糖含量差異不顯著，在花后110 d 可溶性糖含量差異逐漸增大，至花后155 d 可溶性糖含量差異達(dá)到最大，此時呈顯著差異。在果實整個生長發(fā)育期內(nèi)，紅寶石蘋果果實可溶性糖含量始終低于富士2001蘋果果實。

2.2 果實總酸含量的變化

由圖2 可知，隨著果實生長發(fā)育，紅寶石蘋果果實總酸含量的變化趨勢與富士2001 蘋果基本一致，整體呈降低趨勢。在果實發(fā)育初期（花后40～80 d）先下降，后又緩慢升高。花后140 d，總酸含量達(dá)到最高。此后，隨著果實的成熟，總酸含量開始下降至果實成熟時（花后200 d）降到最低，但在花后155 d 富士2001 蘋果果實總酸含量呈增加趨勢，這與紅寶石蘋果果實趨勢相反。在整個果實生長發(fā)育期內(nèi)，紅寶石蘋果果實總酸含量始終低于富士2001 蘋果果實，且差異顯著。

2.3 果實有機(jī)酸含量的變化

2.3.1 蘋果酸 由圖3可知，蘋果酸是紅寶石蘋果和富士2001 蘋果果實最主要的有機(jī)酸，其含量在2 個品種果實整個生長發(fā)育過程中比例均較高，且含量變化趨勢與總酸基本一致。2 個品種果實中蘋果酸含量的大量積累主要在果實發(fā)育前期，隨著果實成熟，蘋果酸含量逐漸降低。不同的是，紅寶石蘋果果實在花后140～170 d蘋果酸含量緩慢降低，而富士2001蘋果果實在同一時期卻先降低后升高。果實發(fā)育初期，紅寶石蘋果果實蘋果酸含量為3.15 mg·g-1，占總酸的89.03%，果實成熟時占總酸的91.80%，富士2001 蘋果果實蘋果酸含量是紅寶石蘋果果實的2.41～4.63倍。在整個發(fā)育過程中，紅寶石蘋果果實蘋果酸含量始終顯著低于富士2001 蘋果果實。

2.3.2 檸檬酸 由圖4 可知，在果實整個發(fā)育過程中，2 個品種果實檸檬酸含量整體均呈降低趨勢，且含量均較低。在果實發(fā)育初期，紅寶石蘋果果實檸檬酸含量先升高后降低，而富士2001 蘋果果實先降低后升高。在果實膨大期（花后110～140 d），二者果實檸檬酸含量及變化趨勢相近，均呈下降趨勢。在花后140～170 d，紅寶石蘋果果實檸檬酸含量先緩慢升高后迅速降低，而富士2001 蘋果果實檸檬酸含量呈下降趨勢?；ê?70～200 d 二者果實檸檬酸含量緩慢升高。此時，紅寶石蘋果果實檸檬酸含量占總酸的2.35%，而富士2001 蘋果果實檸檬酸含量占總酸的0.79%。

2.3.3 草酸 由圖5 可知，紅寶石蘋果和富士2001蘋果果實草酸含量在花后80～140 d 變化趨勢較為相近，而花后140～200 d 變化趨勢差異較大。紅寶石蘋果果實中草酸含量在果實發(fā)育初期變化不大，花后140～170 d 含量急劇升高，在花后170 d 達(dá)到最高0.024 mg· g-1，而后呈下降趨勢，花后200 d 草酸含量為0.012 mg · g-1。而富士2001 蘋果果實草酸含量從花后40～140 d 呈降低趨勢，含量為0.008～0.000 9 mg · g-1。隨后保持平穩(wěn)，直至果實成熟。

2.3.4 酒石酸 由圖6 可知，在整個果實發(fā)育時期，紅寶石蘋果和富士2001 蘋果果實酒石酸含量變化趨勢類似。在果實發(fā)育初期二者果實酒石酸含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在花后140～155 d，二者酒石酸含量急劇升高并達(dá)到最高，分別為0.019 mg·g-1和0.015 mg·g-1，后又急劇下降。不同的是，紅寶石蘋果果實在花后170 d 酒石酸含量下降趨勢漸緩，而富士2001 蘋果果實在花后155 d 整體呈現(xiàn)迅速下降趨勢。直至果實成熟時，紅寶石蘋果果實酒石酸含量為0.011 mg·g-1，高于富士2001 蘋果果實酒石酸含量的0.001 3 mg·g-1。

2.3.5 琥珀酸 由圖7 可知，在果實整個生長發(fā)育時期，紅寶石蘋果及富士2001 蘋果果實中琥珀酸含量變化整體呈降低趨勢。紅寶石蘋果果實琥珀酸含量在果實發(fā)育初期為0.288 mg· g-1，占總酸的8.36%，隨著果實的生長發(fā)育，至果實成熟時含量為0.121 mg·g-1。2 個品種果實中琥珀酸含量均在幼果期迅速下降，直至果實膨大期又緩慢上升。不同的是，在花后140～170 d 紅寶石蘋果果實琥珀酸含量先上升后下降，花后170 d 后琥珀酸含量又逐漸上升，而富士2001 蘋果果實檸檬酸含量變化趨勢與紅寶石蘋果果實相反。

2.4 蘋果酸代謝相關(guān)酶活性的變化

2.4.1 NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH） 由圖8可知，在果實整個生長發(fā)育期，紅寶石蘋果和富士2001 蘋果果實中NAD-MDH活性變化趨勢較為相似。幼果期二者果實酶活性變化趨勢基本一致，NAD-MDH活性均出現(xiàn)不同程度降低，花后155 d 活性突然升高，至花后170 d 活性達(dá)到最高，其中紅寶石蘋果果實為2 827.49 U·mg-1，富士2001 蘋果為4401.66 U·mg-1。在果實整個生長發(fā)育階段，紅寶石蘋果果實NAD-MDH活性一直低于富士2001 蘋果。

2.4.2 NADP-蘋果酸酶（NADP-ME） 由圖9 可知，紅寶石蘋果和富士2001 蘋果果實中NADP-ME活性變化差異較大，整體趨勢大致相反。紅寶石蘋果果實中NADP-ME活性在果實發(fā)育初期先降低，后呈現(xiàn)一直升高的狀態(tài)，至果實成熟期（花后200 d）達(dá)到最高，為5.08 U·mg- 1。而富士2001 蘋果果實中NADP-ME活性在果實發(fā)育初期（花后80 d）和花后155 d 均呈先增高、后降低趨勢，在花后140 d 活性最低，為0.21 U·mg-1。

2.4.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC） 由圖10可知，紅寶石蘋果和富士2001蘋果果實中PEPC活性變化差異較大。紅寶石蘋果果實中PEPC活性變化趨勢整體呈W形，在幼果期，PEPC活性迅速降低，在花后80 d又緩慢升高，花后110 d后又逐漸下降至最低，為19.09 U·mg-1，隨著果實成熟，PEPC活性又逐漸升高，直至果實成熟。除花后145～170 d，其余時期紅寶石蘋果果實酶活性均高于富士2001。富士2001蘋果在果實發(fā)育初期PEPC活性迅速降至最低，為23.54 U·mg-1，之后又緩慢升高，在果實成熟期趨于穩(wěn)定。

2.4.4 果實中蘋果酸含量與其代謝酶活性相關(guān)性分析 對紅寶石蘋果和富士2001蘋果果實的蘋果酸含量和其代謝酶活性進(jìn)行相關(guān)性分析（表1），紅寶石蘋果和富士2001 蘋果果實中NAD-MDH活性與蘋果酸含量的變化呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.78、0.66；NADP-ME活性與蘋果酸含量的變化呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.67、-0.81；而果實中PEPC活性與蘋果酸含量的變化呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.76、0.69。

3 討論

果實風(fēng)味是衡量果實品質(zhì)的重要指標(biāo)，其受果實中有機(jī)酸組分及含量的影響[25]。果實中有機(jī)酸組分及含量受遺傳特性、生態(tài)條件及栽培管理水平的影響[5，16-17]。劉清鶴等[15]的研究發(fā)現(xiàn)梨果實中有機(jī)酸主要由蘋果酸、檸檬酸、酒石酸和奎寧酸組成，為蘋果酸優(yōu)勢型。桃果實中有機(jī)酸主要由蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸和莽草酸組成，蘋果酸含量最高，約占總酸含量的60.61%[26]。葡萄果實主要有機(jī)酸為酒石酸、蘋果酸和檸檬酸[27]。高萌[28]的研究發(fā)現(xiàn)43 個栽培蘋果品種果實中蘋果酸含量為1.72～10.10 mg·g-1，而紅寶石蘋果成熟期果實總酸含量為2.48 mg·g-1，為低酸型品種。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，紅寶石蘋果果實中有機(jī)酸主要為蘋果酸、草酸、檸檬酸、酒石酸和琥珀酸，這與徐愛紅等[29]在紅富士蘋果中研究一致。相較于富士2001 蘋果，紅寶石蘋果總糖含量與之相近，但有機(jī)酸含量在整個果實發(fā)育期均顯著低于富士2001蘋果，這也是其風(fēng)味較濃郁的主要原因。

在果實生長發(fā)育過程中，總糖、有機(jī)酸是影響果實糖酸風(fēng)味的重要因子[30-31]。本研究中紅寶石蘋果果實中總糖含量變化規(guī)律與富士2001 蘋果基本一致，呈不斷增加趨勢，至成熟期達(dá)到最高。2 個品種果實總酸含量存在較大差異，在整個果實發(fā)育期紅寶石蘋果果實蘋果酸含量占總酸含量的89%，富士2001 蘋果則為97%；但富士2001 蘋果成熟果實總酸含量約是紅寶石的2.54 倍。由此可知二者總酸含量的差異主要是由蘋果酸含量的差異所致。紅寶石蘋果果實中蘋果酸含量在整個發(fā)育過程中呈現(xiàn)降低-升高-降低的趨勢，且始終顯著低于富士2001 蘋果。此外，紅寶石蘋果果實中還有一定含量的檸檬酸、酒石酸、琥珀酸和草酸，其含量均高于對照品種富士2001 蘋果。其中檸檬酸、酒石酸和琥珀酸三者含量變化趨勢與富士2001 蘋果類似，但紅寶石蘋果果實中草酸含量在果實發(fā)育后期先急劇升高，后急劇下降，富士2001 蘋果草酸含量變化則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，這種差異成因有待進(jìn)一步研究。

果實生長發(fā)育過程中蘋果酸含量變化由NADMDH、NADP-ME、PEPC、CS（檸檬酸合酶）等多種代謝酶共同調(diào)控，且受遺傳特性與自然環(huán)境的影響[21，23，29]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，紅寶石蘋果果實中NAD-MDH、PEPC活性與蘋果酸含量存在極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系，而NADP-ME活性與蘋果酸含量存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這表明紅寶石蘋果果實蘋果酸含量變化受到PEPC、NAD-MDH、NADP-ME 3種酶共同調(diào)控，這與史娟等[24]在紅富士蘋果中的研究結(jié)果較一致。在果實整個發(fā)育期，紅寶石蘋果果實中NAD-MDH活性變化趨勢與富士2001 蘋果相近，但NAD-MDH 活性一直顯著低于富士2001 蘋果，這可能是2個品種果實發(fā)育期果實蘋果酸含量較大差異的重要因素。在果實發(fā)育后期，紅寶石蘋果和富士2001 蘋果果實中蘋果酸降解關(guān)鍵酶NADP-ME活性均迅速升高，且紅寶石蘋果果實NADP-ME酶活性顯著高于富士2001 蘋果。綜上可知，NADMDH和NAD-ME活性差異是紅寶石蘋果果實蘋果酸含量顯著低于富士2001 蘋果的主要原因。

4 結(jié)論

紅寶石蘋果果實中有機(jī)酸組分包含蘋果酸、檸檬酸、草酸、酒石酸和琥珀酸等5 種，且主要有機(jī)酸為蘋果酸，與富士2001蘋果一致。紅寶石蘋果果實總糖含量與富士2001蘋果相近，但有機(jī)酸含量顯著低于富士2001 蘋果，屬低酸型特異種質(zhì)資源。紅寶石蘋果和富士2001蘋果果實中蘋果酸含量差異主要是果實發(fā)育期NAD-MDH和NADP-ME活性差異所致。

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