呂銀德，趙俊芳*，秦令祥

（漯河食品職業(yè)學(xué)院 食品工程系，河南 漯河 462300）

葡萄酒釀造是一個(gè)復(fù)雜的多菌種參與的生物轉(zhuǎn)化過程，主要包括由酵母菌完成的乙醇發(fā)酵和由乳酸菌完成的蘋果酸乳酸發(fā)酵[1]。乙醇發(fā)酵是葡萄酒釀造中最主要的發(fā)酵過程，在此過程中，糖類物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，同時(shí)產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物。根據(jù)酵母菌酒精產(chǎn)能特性，其被分為釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母菌（non-Saccharomycesyeast）。釀酒酵母菌具有較強(qiáng)的乙醇耐受性和乙醇代謝能力，在發(fā)酵過程中通過轉(zhuǎn)化糖類可產(chǎn)生大量乙醇；而非釀酒酵母菌在發(fā)酵過程中可產(chǎn)生甘油、酸類、酯類、醛類、高級(jí)醇等多種次級(jí)代謝物，決定著葡萄酒的風(fēng)味、豐富性和復(fù)雜度，使葡萄酒具有獨(dú)特的典型性[2-4]。蘋果酸乳酸發(fā)酵是葡萄酒釀造中繼乙醇發(fā)酵后重要的二次發(fā)酵，在此過程中釀酒乳酸菌—酒類酒球菌（Oenococcus oeni）將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸和二氧化碳，同時(shí)產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物[5]。蘋果酸乳酸發(fā)酵具有降低葡萄酒酸度、提高葡萄酒生物穩(wěn)定性和增加葡萄酒香氣等多種作用，是釀造紅葡萄酒和部分白葡萄酒的重要步驟，對(duì)葡萄酒口感、風(fēng)味和典型性具有重要影響[6-7]。

通常情況下乙醇發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒具有較高的酸度，其主要是由酸度較高的蘋果酸和酒石酸造成[8]。過高的酸度對(duì)葡萄酒口感和品質(zhì)具有較大的負(fù)面影響，令消費(fèi)者難以接受，因此乙醇發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行降酸處理是葡萄酒釀造中的必要步驟。通常蘋果酸是在乙醇發(fā)酵結(jié)束后的蘋果酸乳酸發(fā)酵階段通過乳酸菌將其降解為一元酸乳酸，從而達(dá)到降酸的目的[9-11]。而目前在乙醇發(fā)酵階段通過酵母菌將蘋果酸降解為乳酸的研究還較少。部分鮮食葡萄酒酸度高，通過生物方法降低酒體酸度也是提高其品質(zhì)的重要途徑[12-13]。不同來源酵母菌具有不同的功能和發(fā)酵特性[14]，將鮮食葡萄來源的酵母菌用于葡萄酒生產(chǎn)可能會(huì)產(chǎn)生意想不到的效果，而關(guān)于此方面的研究還較少。

本試驗(yàn)從鮮食葡萄自然發(fā)酵液分離出的酵母菌中篩選降酸酵母菌，并對(duì)其發(fā)酵性能、耐受性和糖苷酶活性進(jìn)行測(cè)定，篩選出具有良好性能的葡萄酒釀造酵母菌。這對(duì)提高葡萄酒品質(zhì)和開發(fā)新的酵母菌資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌株：從夏黑葡萄自然發(fā)酵液中分離，保存于實(shí)驗(yàn)室，命名為XH1～XH20；商業(yè)化酵母菌DV01：上海杰兔生物科技有限公司。

L-蘋果酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-蘋果酸試劑盒：上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司；對(duì)硝基苯基-β-葡萄糖苷：北京威知生物科技有限公司；溶菌酶：上海生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

蘋果酸降解指示培養(yǎng)基[15]：在YNB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加硫酸銨5 g/L，L-蘋果酸20 g/L，溴甲酚綠0.1 g/L，雙蒸水配制，0.45 μm濾膜過濾。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母浸粉蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母氮源基礎(chǔ)（yeast nitrogen base，YNB）培養(yǎng)基：今品化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DSX-280B型式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；JBCJ-V超凈工作臺(tái)：蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；PSH-300生化培養(yǎng)箱：中科生命科技股份有限公司；LIOOJS500雙目顯微鏡：無錫萬物生態(tài)科技有限公司；UH5300紫外分光光度計(jì)：日本日立公司；FE28 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 降酸酵母菌的篩選

參照白玉峰等[15]所述方法篩選具有L-蘋果酸降解能力的酵母菌。每天觀察并記錄培養(yǎng)基顏色變化，若培養(yǎng)基顏色從黃色變?yōu)樗{(lán)色，說明菌株具有L-蘋果酸降解能力，顏色變化越大說明L-蘋果酸降解能力越強(qiáng)。每株菌做3個(gè)平行。

1.3.2 降酸酵母菌的鑒定

參照鄧曉茜等[16]所述方法，提取酵母菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）后，采用通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增ITS并測(cè)序，序列經(jīng)序列經(jīng)美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information,NCBI）的Gen Bank數(shù)據(jù)庫中，采用基本局部比對(duì)搜索工具（basic localalignment search tool,BLAST）進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA-7軟件以鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 降酸酵母菌的發(fā)酵性能測(cè)定

產(chǎn)酒精力測(cè)定及香氣評(píng)價(jià)：參照李亞輝等[17]所述的方法，測(cè)定酵母菌的產(chǎn)酒精能力并由感官評(píng)定小組進(jìn)行香氣評(píng)價(jià)，重復(fù)測(cè)定3次。

發(fā)酵力測(cè)定：采用董亞晨等[18]所述CO2質(zhì)量損失法測(cè)定酵母菌的發(fā)酵能力，重復(fù)測(cè)定3次，繪制發(fā)酵力曲線。

1.3.4 降酸酵母菌的耐受性能測(cè)定

葡萄糖耐受性測(cè)定：調(diào)整YPD培養(yǎng)基葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L，以葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L為對(duì)照[19]?？疾炱鋵?duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。

乙醇耐受性測(cè)定：調(diào)整YPD培養(yǎng)基中乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、12%、14%、16%、18%、20%，以不添加乙醇為對(duì)照[17]。考察其對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。

SO2耐受性測(cè)定：調(diào)整YPD培養(yǎng)基中SO2質(zhì)量濃度分別為100 mg/L、150mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、350 mg/L，以不添加SO2為對(duì)照[20]?？疾炱鋵?duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。

以上均按5%（0.6×106CFU/mL）的接種量接種酵母菌，28 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)48 h，采用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定不同葡萄糖質(zhì)量濃度、不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、不同SO2質(zhì)量濃度下發(fā)酵液中的活菌數(shù)，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.5 降酸酵母菌的糖苷酶活性測(cè)定

樣品處理：參照LI Y H等[21]所述方法獲得酵母培養(yǎng)液上清、完整細(xì)胞和細(xì)胞破碎液。

酶活測(cè)定：參照李亞輝等[22]所述方法分別對(duì)酵母培養(yǎng)液上清、完整細(xì)胞和細(xì)胞破碎液進(jìn)行β-葡萄糖苷酶活測(cè)定。酶活定義為：在每克酵母菌（干質(zhì)量）作用下每分鐘生成對(duì)硝基苯酚的量為一個(gè)酶活單位，μmol/（g·min）。每個(gè)樣品酶活測(cè)定重復(fù)3次。

1.3.6 降酸酵母菌的降酸性能測(cè)定

以夏黑葡萄為原料，分別按0.5%接種量接種篩選的降酸酵母菌，以商業(yè)化酵母菌DV01為對(duì)照，于25 ℃條件下發(fā)酵，當(dāng)糖含量低于4.0 g/L時(shí)發(fā)酵結(jié)束。利用蘋果酸試劑盒分別在發(fā)酵前和發(fā)酵后測(cè)定發(fā)酵液中蘋果酸含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS18.0和Design Expert V8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降酸酵母菌的篩選及鑒定

2.1.1 降酸酵母菌的篩選

20株酵母菌培養(yǎng)后顯色結(jié)果見表1。由表1可知，酵母菌XH8降酸能力強(qiáng)，XH10降酸能力較強(qiáng)，XH3和XH15降酸能力弱，其余菌株無降酸能力，故選擇菌株XH8、XH10、XH3和XH15進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 酵母菌在蘋果酸降解指示培養(yǎng)基上的顯色結(jié)果Table 1 Chromogenic results of yeasts on malic acid degradation indicator medium

2.1.2 酵母菌的鑒定

篩選出的菌株XH3、XH8、XH10和XH15的菌落和細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可知，4株菌菌落呈圓形，中間凸起，乳白色，質(zhì)地均勻，表面光滑、濕潤、粘稠，邊緣規(guī)整；4株菌細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形，生殖方式為芽殖，無菌絲。菌落和細(xì)胞形態(tài)均符合酵母菌特點(diǎn)。

圖1 4株降酸酵母菌的菌落和細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony and cell morphology of 4 acid-reducing yeasts

菌株XH3、XH8、XH10和XH15的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。由圖2可知，菌株XH3、XH8和XH10與釀酒酵母具有100%相似度，可鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；菌株XH15與畢赤酵母具有100%相似度，可鑒定為黃皮畢赤酵母（Pichia scutulata）。

圖2 基于ITS基因序列4株降酸酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 4 strains of acid-reducing yeasts based on ITS gene sequence

2.2 降酸酵母菌的發(fā)酵性能

2.2.1 產(chǎn)酒精力測(cè)定及香氣評(píng)價(jià)

對(duì)篩選的4株酵母菌XH3、XH8、XH10和XH15的產(chǎn)酒精力進(jìn)行測(cè)定，并在培養(yǎng)后進(jìn)行香氣評(píng)價(jià)，結(jié)果見表2。

表2 4株降酸酵母菌的產(chǎn)酒精力和香氣評(píng)價(jià)結(jié)果Table 2 Results of alcoholic yield and aroma evaluation results of 4 acid reducing yeasts

由表2可知，菌株XH3和XH15具有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力，發(fā)酵液的酒精度分別為7.9%vol和8.3%vol，菌株XH8和XH10的產(chǎn)酒精力較差，發(fā)酵液的酒精度分別為4.2%vol和4.8%vol。4株酵母菌發(fā)酵后均具有發(fā)酵香和酒香。結(jié)果表明，菌株XH3和XH15不僅具有較強(qiáng)的產(chǎn)酒精能力，且能產(chǎn)生較好的香氣。

2.2.2 發(fā)酵力測(cè)定

對(duì)篩選的4株降酸酵母菌XH3、XH8、XH10和XH15的發(fā)酵力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株XH3和XH15的總CO2產(chǎn)生量分別為19.75 g和20.56 g，菌株XH8和XH10的總CO2產(chǎn)生量分別為12.15 g和15.40 g。菌株XH3和XH15的CO2產(chǎn)生量明顯高于菌株XH8和XH10；菌株XH3在發(fā)酵前60 h隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CO2產(chǎn)生量逐漸升高，發(fā)酵第60小時(shí)時(shí)，CO2產(chǎn)生量最大為3.3 g，然后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CO2產(chǎn)生量逐漸下降；菌株XH15在發(fā)酵前72 h隨著時(shí)間延長(zhǎng)產(chǎn)生的CO2量逐漸升高，第72小時(shí)時(shí)，CO2產(chǎn)生量最大為3.4 g，然后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，CO2產(chǎn)生量逐漸下降。菌株XH8和XH10分別在48 h和72 h CO2產(chǎn)生量最大，之后產(chǎn)量逐漸下降。菌株XH3和XH15具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，且高于菌株XH8和XH10。

圖3 4株降酸酵母菌的發(fā)酵力曲線Fig.3 Fermentation capacity curves of 4 acid-reducing yeasts

2.3 降酸酵母菌的耐受性能

2.3.1 葡萄糖耐受性

由圖4可知，隨著葡萄糖含量的增加，4株酵母菌的活菌數(shù)均逐漸降低；當(dāng)葡萄糖含量≤200 g/L時(shí)，不同葡萄糖含量對(duì)4株菌的活菌數(shù)影響較小，無顯著差異（P＞0.05）；和葡萄糖含量為200g/L時(shí)活菌數(shù)相比，葡萄糖含量為250 g/L時(shí)對(duì)菌株XH10和XH15的活菌數(shù)有明顯的抑制作用（P＜0.05），葡萄糖含量為300 g/L時(shí)對(duì)菌株XH3和XH8的活菌數(shù)有明顯的抑制作用（P＜0.05）。結(jié)果表明，菌株XH3和XH8的葡萄糖耐受性優(yōu)于菌株XH10和XH15，菌株XH3和XH8葡萄糖耐受性最高為250 g/L，菌株XH10和XH15葡萄糖耐受性最高為200 g/L。通常情況下，葡萄酒發(fā)酵液中糖含量≤250 g/L[23]，因此，在葡萄糖耐受性方面，菌株XH3和XH8可滿足釀酒的需要。

圖4 不同葡萄糖含量對(duì)4株降酸酵母生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different glucose contents on the growth of 4 acid-reducing yeasts

2.3.2 乙醇耐受性

由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，4株酵母菌的活菌數(shù)均逐漸降低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)≤8%時(shí)，對(duì)4株菌的生長(zhǎng)影響較??；乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)對(duì)酵母菌XH8和XH10的活菌數(shù)有明顯抑制作用（P＜0.05），乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時(shí)對(duì)酵母菌XH15的活菌數(shù)有明顯抑制作用（P＜0.05），乙醇體積分?jǐn)?shù)為16%時(shí)對(duì)酵母菌XH3的活菌數(shù)有明顯抑制作用（P＜0.05）；菌株XH3的乙醇耐受性最好，最高可耐受14%乙醇，其次為菌株XH15，最高可耐受12%乙醇，菌株XH8和XH10的乙醇耐受性較差，最高可耐受10%vol。通常情況下，葡萄酒的酒精度約為12%vol[22]，因此，在乙醇耐受性方面，菌株XH3和XH15有較好的耐受性，可滿足釀酒的需要。

圖5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)4株降酸酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of different ethanol volume fraction on the growth of 4 acid-reducing yeasts

2.3.3 SO2耐受性測(cè)定

由圖6可知，隨著SO2含量的增加，4株菌的活菌數(shù)均逐漸降低；當(dāng)SO2含量為200 mg/L時(shí)，對(duì)酵母菌XH10的活菌數(shù)有顯著的抑制作用（P＜0.05）；當(dāng)SO2含量為250mg/L時(shí)，對(duì)酵母菌XH3、XH8和XH15的活菌數(shù)有顯著的抑制作用（P＜0.05）；當(dāng)SO2含量為300 mg/L時(shí)，4株菌幾乎不生長(zhǎng)。結(jié)果表明，酵母菌XH3、XH8和XH15的SO2耐受性強(qiáng)于酵母菌XH10，菌株XH3、XH8和XH15的SO2耐受性最高為200 mg/L，菌株XH10的SO2耐受性最高為150 mg/L。通常情況下，葡萄酒釀造中SO2含量＜200 mg/L[24]，因此，在SO2耐受性方面，菌株XH3、XH8和XH15可滿足葡萄酒釀造的需要。

圖6 不同SO2含量對(duì)4株降酸酵母菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of different SO2 contents on the growth of 4 acid-reducing yeasts

2.4 降酸酵母菌的糖苷酶活性

由圖7可知，XH3、XH8、XH10和XH15菌株細(xì)胞破碎液的β-葡萄糖苷酶活性最高，分別為10.8 μmol/（g·min）、13.2 μmol/（g·min）、12.1 μmol/（g·min）和7.9 μmol/（g·min），其次是完整細(xì)胞，分別為5.5μmol/（g·min）、3.2μmol/（g·min）、1.6 μmol/（g·min）和2.1 μmol/（g·min），培養(yǎng)液上清中酶活性最低；菌株XH8細(xì)胞破碎液的酶活最高，菌株XH3完整細(xì)胞的酶活顯著高于其他3株菌（P＜0.05）。結(jié)果說明，4株降酸酵母菌的β-葡萄糖苷酶主要為胞內(nèi)酶，胞外酶活較低，完整細(xì)胞也具有一定酶活；菌株XH8胞內(nèi)酶活最高，菌株XH3完整細(xì)胞酶活最高。β-葡萄糖苷酶可降解香氣前體物產(chǎn)生香氣物質(zhì)，在葡萄酒釀造中具有重要作用[25]。此結(jié)果與前人報(bào)道的酵母菌分泌的β-葡萄糖昔酶大多為胞內(nèi)酶或胞壁結(jié)合酶一致[26-27]。

圖7 4株降酸酵母菌β-葡萄糖苷酶活性Fig.7 β-glucosidase activities of 4 acid-reducing yeasts

2.5 降酸酵母菌的降酸性能

降酸酵母菌XH3、XH8、XH10和XH15在以夏黑葡萄為原料發(fā)酵液中降解L-蘋果酸的測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，菌株XH3和對(duì)照菌株DV01的發(fā)酵時(shí)間最短為195 h，其次是菌株XH15、XH8和XH10；菌株XH8對(duì)L-蘋果酸降解量最高，降解量為0.545 g/L，其次是菌株XH10，降解量為0.404 g/L，這兩株菌對(duì)L-蘋果酸的降解量均超過對(duì)照菌株DV01的降解量0.099 g/L，菌株XH3和菌株XH15對(duì)L-蘋果酸的降解量較低，分別為0.091 g/L和0.066 g/L，均低于對(duì)照菌株DV01的降解量。結(jié)果說明，菌株XH8的降酸能力最強(qiáng)，其次是菌株XH10，菌株XH3和菌株XH15的降酸能力較弱。但是由于菌株XH8耐受乙醇能力較差，所以最終選擇菌株XH3為葡萄酒潛在釀造菌株。

表3 4株降酸酵母菌降解L-蘋果酸的測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of degradation of L-malic acid of 4 acid-reducing yeasts

3 結(jié)論

該研究從分離于夏黑葡萄自然發(fā)酵液的20株酵母菌中篩選出了4株具有L-蘋果酸降解能力的酵母菌，其中菌株XH8降酸能力最強(qiáng)，其次為菌株XH10，菌株XH3和XH15降酸能力稍弱；菌株XH3具有較好的發(fā)酵特性，較好的葡萄糖、乙醇和SO2耐受性，且完整細(xì)胞具有較高的β-葡萄糖苷酶活；菌株XH8具有較好的葡萄糖和SO2耐受性、較強(qiáng)的L-蘋果酸降解能力，以及較高的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活。綜上，酵母菌XH3可作為葡萄酒釀造的潛在菌株。本研究對(duì)開發(fā)新酵母菌資源和提高葡萄酒品質(zhì)具有重要意義。