李霏，丁浩然，楊樂(lè)巍*，劉淵文，王恒，張?jiān)溃顣?shū)鵬，陳成，田德金

1.北京建工環(huán)境修復(fù)股份有限公司

2.污染場(chǎng)地安全修復(fù)技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室

3.合肥東部新中心建設(shè)管理辦公室

我國(guó)是一個(gè)焦炭生產(chǎn)大國(guó)，焦炭生產(chǎn)量長(zhǎng)期位居世界前列。隨著我國(guó)對(duì)城市布局中“退二進(jìn)三”政策的實(shí)施，大量的焦化企業(yè)因產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整搬遷，退役焦化廠存在的不同程度的土壤污染，如不經(jīng)修復(fù)會(huì)污染環(huán)境，存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。多環(huán)芳烴類(lèi)（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）、氰化物、氟化物、總石油烴（TPH）、重金屬等有毒有害物質(zhì)是焦炭生產(chǎn)過(guò)程中的主要污染物，若非法處置或處理不當(dāng)會(huì)造成焦化場(chǎng)地污染。其中PAHs 具有毒性、遺傳毒性、致突變性和致癌性的特點(diǎn)，損傷人體呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)，并對(duì)肝臟、腎臟造成損害，是場(chǎng)地修復(fù)中需要重視的一種污染物[1]。

針對(duì)焦化污染場(chǎng)地的有機(jī)污染物，常用的修復(fù)方法包括熱脫附、化學(xué)氧化及生物修復(fù)等。熱脫附技術(shù)可以有效降低污染物濃度，但能耗大、碳足跡高，不利于“雙碳”目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)；化學(xué)氧化可以有效去除大部分低環(huán)PAHs，但對(duì)高環(huán)PAHs 去除效果有限，同時(shí)存在二次污染的風(fēng)險(xiǎn)和成本高的缺點(diǎn)；生物修復(fù)是通過(guò)植物、動(dòng)物、微生物的代謝活性將環(huán)境中的污染物減毒或完全無(wú)害化，具有低成本、無(wú)二次污染、低環(huán)境擾動(dòng)等優(yōu)勢(shì)。生物泥漿反應(yīng)器是一種易于調(diào)節(jié)反應(yīng)參數(shù)，均質(zhì)性好的處理方式。Tuhuloula等[2]在含固率為20%的泥漿中接種10%～15%的Bacillus cereus和Pseudomonas putida菌 液，7 周 時(shí)間內(nèi)，低環(huán)PAHs 降解率可達(dá)90%左右。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)高環(huán)PAHs 具有低水溶性、低生物有效性等特點(diǎn)，加之生物積累、生物放大等效應(yīng)，對(duì)微生物產(chǎn)生持續(xù)毒害，因而對(duì)生物修復(fù)有不利影響[3-4]。生物泥漿反應(yīng)器通過(guò)在泥漿中添加表面活性劑和微生物，將吸附在土壤的PAHs 溶解到水相中，提高污染物的傳質(zhì)效率和生物有效性，是一種具有開(kāi)發(fā)前景的修復(fù)技術(shù)[5]。Forján 等[6]采用20 L 的生物泥漿罐，添加Rhodocccus erythropolis和Pseudomonas stuzeri菌劑處理污染土壤，結(jié)果顯示初始濃度在332 mg/kg 左右的PAHs 經(jīng)過(guò)15 d 的處理，低環(huán)PAHs 降解率達(dá)到80%，高環(huán)PAHs 也可以降解70%。前人研究多是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下進(jìn)行的試驗(yàn)，但由于現(xiàn)場(chǎng)條件復(fù)雜，與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果差別較大。Pelaez 等[7]進(jìn)行了1 kg（約0.000 5 m3）、15 m3、900 m3一系列的生物堆放大試驗(yàn)，結(jié)果顯示處理周期為21、60、161 d 不等，說(shuō)明放大過(guò)程存在諸多變化和不確定因素。

美國(guó)的生物泥漿反應(yīng)器已發(fā)展多年，美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)局報(bào)道已有超過(guò)2%的超級(jí)基金項(xiàng)目使用生物泥漿反應(yīng)器處理PAHs 。多家供應(yīng)商（如Environmental Remediation,Inc.，Environmental Solution,Inc.,Groundwater Technology,Inc.等）已開(kāi)發(fā)了四代生物泥漿反應(yīng)器并將其應(yīng)用到工程中[8]。但國(guó)內(nèi)研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室小試規(guī)模，少數(shù)放大規(guī)模試驗(yàn)也僅針對(duì)萘、菲等低環(huán)PAHs，缺少高環(huán)PAHs 的場(chǎng)地修復(fù)中試案例研究。筆者采用Micro-Blaze?菌劑，在2 組1 m3的泥漿反應(yīng)罐中對(duì)合肥某焦化污染場(chǎng)地的土壤進(jìn)行中試修復(fù)，對(duì)溶解氧濃度、溫度、微生物豐度及多樣性等參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以期獲得泥漿反應(yīng)器在處理PAHs 過(guò)程中的參數(shù)變化，為工程化裝備設(shè)計(jì)和運(yùn)行提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域污染特征

研究區(qū)域?yàn)楹戏誓惩艘垆撹F廠，該污染場(chǎng)地有近60 年的生產(chǎn)歷史，未來(lái)規(guī)劃為一類(lèi)及二類(lèi)建設(shè)用地。污染場(chǎng)地包括帶鋼車(chē)間、煉鋼車(chē)間、連軋輔助車(chē)間、石灰廠、制氧車(chē)間、焦化廠、燒結(jié)廠、煉鐵廠、煉鋼廠、熱軋廠、冷軋廠和非生產(chǎn)區(qū)等，原鋼廠通過(guò)高爐煉鐵→煉鋼→軋鋼等加工步驟，出廠產(chǎn)品為成品鋼材，包括型材、板材、熱軋薄板等。修復(fù)地塊污染因子包括PAHs、重金屬、TPH 等，符合典型的焦化污染場(chǎng)地特征，場(chǎng)地土壤以雜填土、黏土為主。修復(fù)地塊土壤的pH 平均為8.78±1.19，呈弱堿性；含水率為17.9%±5.66%；土壤呈灰黃/黑色，質(zhì)地由松散到稍密，局部夾雜淤泥質(zhì)土壤。顆粒組成為：0.5～2 mm，占0.0%～8.9%；0.25～0.5 mm，占0.0%～14.5%；0.075～0.25 mm，占15.1%～33.2%；0.005～0.075 mm占43.6%～69.2%。土壤中有機(jī)質(zhì)含量為1%～3%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)微生物毒性大且難降解的PAHs 多為高環(huán)物質(zhì)，因此選取單一有機(jī)物污染的土壤，其中苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽、二苯并[a,h]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘等高環(huán)PAHs 濃度超過(guò)GB 36600—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量 建設(shè)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）》一類(lèi)建設(shè)用地標(biāo)準(zhǔn)（表1）。土壤粉碎后過(guò)40 目（0.425 mm）篩，篩下土壤以砂土和少量黏土為主，是該場(chǎng)地代表性的污染土壤。設(shè)計(jì)2 組泥漿反應(yīng)器，最大容量1 m3，最大曝氣量6 L/min，最大攪拌轉(zhuǎn)速60 r/min。反應(yīng)器配備有溶解氧、氧化還原電位、負(fù)壓、溫度監(jiān)測(cè)傳感器，可以在線監(jiān)測(cè)泥漿的反應(yīng)參數(shù)。在1#和2#反應(yīng)罐分別配制約650 L 含固率為28%和18%的泥漿進(jìn)行中試研究。菌劑采用美國(guó)Verde Environmental 公司的Micro-Blaze?菌劑，根據(jù)其使用說(shuō)明并出于成本考慮，每個(gè)反應(yīng)罐添加約10%（6 L）濃縮菌液。同時(shí)為了驗(yàn)證菌劑的降解能力及其菌群結(jié)構(gòu)，在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)滅菌石英砂配制500 mL 含固率30%的模擬泥漿，投加1%（5 mL）濃縮菌液分別處理0（空白對(duì)照）、50（T50）、100（T100）和200（T200）mg/kg 苯并[a]芘。按照以往研究[9]經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)際監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，泥漿反應(yīng)器運(yùn)行期間采用6 L/min 的曝氣量和50 r/min 的攪拌槳轉(zhuǎn)速，保持溶解氧濃度為6～9 mg/L，處理過(guò)程持續(xù)8 周。

表1 試驗(yàn)土壤污染情況Table 1 Contamination level of sampling soil mg/kg

1.3 采樣周期及檢測(cè)方法

為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和連續(xù)性，每周采集混合均勻的泥漿，將其沉淀后取一定量的固相和水相，固相樣品中干物質(zhì)及含水量采用HJ 613—2011《土壤干物質(zhì)和水分的測(cè)定 重量法》中的方法進(jìn)行檢測(cè)，土壤中PAHs 濃度采用HJ 834—2017《土壤和沉積物半揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》中的方法進(jìn)行檢測(cè)，水中PAHs 濃度采用HJ 478—2009 《水質(zhì)多環(huán)芳烴的測(cè)定 液液萃取和固相萃取高效液相色譜法》中的方法進(jìn)行檢測(cè)。土壤微生物多樣性絕對(duì)定量測(cè)序基于Illumina Novaseq 測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序（Paired-End）的方法，擴(kuò)增前在DNA 模板中加入一定比例內(nèi)參序列（spike-in 序列），構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增區(qū)域選擇的是16S rRNA v3～v4區(qū)。數(shù)據(jù)分析采用標(biāo)準(zhǔn)流程，包括Trimmomatic（v0.33）、cutadapt（1.9.1）、Usearch（v10）、QIIME2（v2020.6）的dada2 功能[10-11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌劑的菌群結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)室采用Micro-Blaze?菌劑處理滅菌石英砂混合梯度濃度的苯并[a]芘，發(fā)現(xiàn)在4 周時(shí)間內(nèi)，苯并[a]芘濃度從50～200 mg/kg 降解到0.55 mg/kg，說(shuō)明該菌劑具有良好的降解性能。16S rRNA 分析可知，菌劑主要以Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（相對(duì)豐度約70%）為主，Bacillus（約10%）和Acitmomyces（約1%）次之（圖1）。在有苯并[a]芘的環(huán)境壓力下，Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia屬的相對(duì)豐度增加超過(guò)90%，但反映生物多樣性的參數(shù)[12]（ACE、Chao1、Simpson、Shannon 指數(shù)）均呈下降趨勢(shì)（表2），生物多樣性降低。這可能由于Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia菌屬作為主要降解菌而大量繁殖，也可能由于苯并[a]芘的生物毒性效應(yīng)抑制了部分微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致生物多樣性降低。也有研究發(fā)現(xiàn)Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia菌中含有單加氧酶[13]，可以降解石油烴及一些環(huán)類(lèi)污染物，如二甲苯、苯酸鹽、氯基環(huán)己烷、氯苯等[14-15]。

圖1 菌劑群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Microbial community structure

表2 菌劑多樣性分析Table 2 Analysis of microbial diversity

2.2 泥漿反應(yīng)罐中污染物濃度監(jiān)測(cè)

中試過(guò)程監(jiān)測(cè)了苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘5 種初始濃度超標(biāo)的高環(huán)PAHs，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2 可以看出，前3 周污染物濃度快速下降至較低濃度，1#反應(yīng)罐中5 種污染物在第4 周均降低到5 mg/kg 以下，但在第4 周后略有反彈。這可能由于1#反應(yīng)罐中含固率為28%，高于2#反應(yīng)罐的18%，1#反應(yīng)罐的傳質(zhì)效率低于2#反應(yīng)罐；同時(shí)，在第3 周添加的表面活性劑增加了固液萃取時(shí)的分配比例，影響了污染物濃度。1#反應(yīng)罐在8 周后只有苯并[a]芘的濃度（3.03 mg/kg）高于一類(lèi)用地的修復(fù)目標(biāo)（0.55 mg/kg），其他污染物均達(dá)標(biāo)，2#反應(yīng)罐在第8 周所有污染物濃度均達(dá)到一類(lèi)用地的修復(fù)目標(biāo)。說(shuō)明該菌劑具有良好的降解效果，可以在8 周的時(shí)間內(nèi)將污染土壤修復(fù)到目標(biāo)值。其中苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽由于修復(fù)目標(biāo)較低（0.55 mg/kg），需要比較長(zhǎng)的時(shí)間（8 周），而苯并[b]熒蒽初始污染濃度較高且相對(duì)難降解，也需要8 周時(shí)間達(dá)到修復(fù)目標(biāo)（5.5 mg/kg）。苯并[a]蒽、茚并[1,2,3-cd]芘相對(duì)容易降解，在第4～5 周已達(dá)到修復(fù)目標(biāo)（5.5 mg/kg）。生物泥漿反應(yīng)器適合處理幾到幾百mg/kg的PAHs 污染，也有研究稱(chēng)可以處理上千至萬(wàn)mg/kg 的PAHs，這與低環(huán)PAHs的比例[16]、反應(yīng)條件及菌種的耐受程度等均有關(guān)[17]。

圖2 反應(yīng)罐中污染物濃度監(jiān)測(cè)Fig.2 Contaminants monitoring in bioreactor tanks

雖然石油烴（C10～C40）初始濃度（434 mg/kg）遠(yuǎn)低于一類(lèi)用地修復(fù)標(biāo)準(zhǔn)（826 mg/kg），但石油烴屬于微生物易利用的底物，可以作為微生物底物促進(jìn)其生長(zhǎng)。Smith 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，2 400 mg/kg 的石油烴可以在10 d 內(nèi)降解至400 mg/kg 以下。從圖3 可以看出，2 個(gè)反應(yīng)罐中的石油烴均明顯降解，1#反應(yīng)罐降解率達(dá)67%，2#反應(yīng)罐降解率達(dá)到45%。前人研究也表明，很大一部分原油中的低碳鏈?zhǔn)蜔N都可以被微生物降解，降解率為40%～93%[19]。這也說(shuō)明該菌劑在利用石油烴的同時(shí)仍然會(huì)降解其他PAHs，沒(méi)有或僅有很弱的競(jìng)爭(zhēng)抑制。

圖3 反應(yīng)罐中石油烴降解Fig.3 Degradation of petroleum hydrocarbons in bioreactor tanks

2.3 泥漿反應(yīng)罐中菌群結(jié)構(gòu)變化

根據(jù)泥漿罐中微生物的絕對(duì)豐度（圖4）可知，原始的土著微生物含量較低，受到提取DNA 效率限制，無(wú)法測(cè)定其微生物豐度。從加入微生物菌劑后可以觀察到有一定數(shù)量的微生物，并且在第2 周開(kāi)始有增加的趨勢(shì)，在第3～4 周快速生長(zhǎng)，每g 土壤中達(dá)到2×109～3×109拷貝數(shù)的微生物，然而在第5 周可能由于營(yíng)養(yǎng)匱乏開(kāi)始下降。當(dāng)在第5～6 周添加酵母浸膏等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之后，微生物豐度又開(kāi)始快速增長(zhǎng)，尤其在2#反應(yīng)罐中，第6 周微生物超過(guò)了6×109拷貝數(shù)/g。微生物總體數(shù)量的增加意味著降解菌可能快速生長(zhǎng)，在此過(guò)程中達(dá)到降解污染物的目的。結(jié)合圖2 可以看出，1#和2#反應(yīng)罐污染物濃度均在前4 周內(nèi)顯著下降，2#反應(yīng)罐所有污染物濃度均達(dá)到一類(lèi)建設(shè)用地修復(fù)標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 反應(yīng)罐中微生物多樣性監(jiān)測(cè)Fig.4 Microbial diversity monitoring in bioreactor tanks

菌群多樣性分析也發(fā)現(xiàn)，微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，與在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌環(huán)境下接種的情況有很大差別。反應(yīng)第3 周，Hydrogenophaga和Sphingomonadaceae2 個(gè)屬的菌增殖明顯；而第4 周，Pseudomonas屬豐度明顯上升，并且無(wú)法鑒定的其他菌屬也開(kāi)始顯著增加，這可能是微生物群落之間的協(xié)同降解作用。Hydrogenophaga屬的部分菌種在厭氧條件下可以產(chǎn)生表面活性劑從而起到增加PAHs 生物有效性的功能，具有促進(jìn)降解PAHs 的能力，如研究發(fā)現(xiàn)Hydrogenophagasp.PYR1 可以降解苯并[a]芘[20]。Pseudomonas屬是常見(jiàn)的PAHs 降解菌[6,21]，主要依賴(lài)于其產(chǎn)生物表活的能力[22-23]及群體效應(yīng)基因（如Pseudomonas aeruginosaN6P6 的lasI和rhlI）[24]的表達(dá)，而Sphingomonadaceae屬有含有多種可降解PAHs 基因的質(zhì)粒[24-25]，但對(duì)低環(huán)PAHs如萘和菲有更好的表現(xiàn)[26-29]。Comamonadaceae屬也是PAHs 降解菌重要的菌屬之一。因此中試研究可以發(fā)現(xiàn)，在開(kāi)放的試驗(yàn)條件下，土著微生物、反應(yīng)條件、復(fù)雜的成分影響了菌群結(jié)構(gòu)，與實(shí)驗(yàn)室滅菌環(huán)境的群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

2.4 泥漿反應(yīng)罐重要參數(shù)監(jiān)測(cè)

泥漿反應(yīng)罐中重要參數(shù)變化如圖5 所示。由于本試驗(yàn)采用的菌劑主要依靠好氧微生物中加氧酶的作用，因此溶解氧濃度是決定降解速率的關(guān)鍵參數(shù)。該設(shè)備通過(guò)底部曝氣通入過(guò)濾的無(wú)菌空氣和機(jī)械攪拌的方式對(duì)反應(yīng)罐中的泥漿進(jìn)行增氧，使泥漿溶解氧濃度維持在6～9 mg/L，同時(shí)保證固相不沉底且傳質(zhì)均勻。1#和2#反應(yīng)罐中的溶氧濃度在第3～4 周有下降趨勢(shì)，這可能與微生物在3～4 周快速生長(zhǎng)有關(guān)，微生物的快速生長(zhǎng)導(dǎo)致溶解氧濃度略微降低。反應(yīng)結(jié)束停止攪拌24 h 后，泥漿出現(xiàn)分層現(xiàn)象，這與試驗(yàn)土壤中的粉土比例高有關(guān)，黏土比例高則更容易保持泥漿狀態(tài)，但攪拌阻力增大。溫度也是微生物生長(zhǎng)的另一個(gè)重要指標(biāo)，該反應(yīng)器固定在配備有空調(diào)的集裝箱中，同時(shí)罐體有可加熱保溫層。由于中試運(yùn)行在夏季，因此在試驗(yàn)過(guò)程中只在溫度過(guò)高的時(shí)間段開(kāi)啟空調(diào)，保持反應(yīng)罐溫度在25～40 ℃。在第3～4 周，溫度接近最低溫度25 ℃，但微生物生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，依然快速增殖，說(shuō)明該菌劑中微生物溫度耐受范圍較高。這與已有研究結(jié)論相符，反應(yīng)器在30 ℃左右有利于細(xì)菌的增殖[30]。

圖5 反應(yīng)罐中的重要參數(shù)Fig.5 Key parameters of the reactor tanks

液相和固相的pH 均偏堿性，在8～9 的范圍內(nèi)波動(dòng)，說(shuō)明該條件下微生物的活性沒(méi)有受到影響。微生物在過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境中都會(huì)影響其降解活性，因此在泥漿處理過(guò)程中，需保持泥漿攪拌以避免局部厭氧或產(chǎn)生小分子酸積累，造成泥漿pH 降低，持續(xù)監(jiān)測(cè)和預(yù)警可以保障微生物在泥漿反應(yīng)器中的持久活性。Forján 等[6]的小試試驗(yàn)顯示，泥漿中溶解氧濃度保持5 mg/L 時(shí)，仍可以維持微生物的活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH 在7.0 左右適合微生物生長(zhǎng)。這2 個(gè)參數(shù)是微生物保持活性的重要參數(shù)，與微生物種類(lèi)相關(guān)，因此工程應(yīng)用前需要通過(guò)小試和中試試驗(yàn)確定該參數(shù)。

3 結(jié)論

（1）微生物菌劑中的群落結(jié)構(gòu)在開(kāi)放環(huán)境下與實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌環(huán)境下有顯著差異，外源強(qiáng)化菌與土著菌的競(jìng)爭(zhēng)能力、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力有必要通過(guò)中試試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

（2）本次中試所用商業(yè)化菌劑對(duì)PAHs 濃度在幾十mg/kg 具有良好的降解效果，生物泥漿反應(yīng)器適合修復(fù)中低濃度PAHs 污染土壤。

（3）微生物適宜的pH 接近中性或略偏堿性，適宜溫度為25～35 ℃，此時(shí)可以較好地降解目標(biāo)污染物。