左一琳，陳文杰，孫慧杰，丁曉艷，詹亞斌，張昊，丁國春，李季，魏雨泉*，劉蕊

1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院

2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有機(jī)循環(huán)研究院（蘇州）

3.北京林業(yè)大學(xué)水土保持學(xué)院

4.生態(tài)環(huán)境部土壤與農(nóng)業(yè)農(nóng)村生態(tài)環(huán)境監(jiān)管技術(shù)中心

隨著人們對石油資源需求的增大，土壤的石油污染已成為世界性的環(huán)境問題之一[1]，而雜環(huán)芳烴是石油成分中最為典型的具有三致效應(yīng)（致畸、致癌、致突變）的有機(jī)污染物[2-3]，尤其是含硫雜環(huán)芳烴，既是原油中硫的主要存在形態(tài)，也較傳統(tǒng)石油污染土壤中常關(guān)注的多環(huán)芳烴具有更強(qiáng)的致癌性、生物富集性和穩(wěn)定性[4]，如何高效安全地治理石油污染場地中的含硫雜環(huán)芳烴一直是土壤修復(fù)中的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。

針對石油污染土壤的常規(guī)處理方法主要有化學(xué)法、物理法和生物法[5]，其中微生物修復(fù)法是利用土壤-微生物-污染物自身的理化性質(zhì)，基于微生物的新陳代謝，以石油污染物作為培養(yǎng)基，在微生物生長過程中消耗和分解掉污染物，是二次污染最小、最經(jīng)濟(jì)、最有效的修復(fù)方法[6]。王欣等[7]發(fā)現(xiàn)了可以脫除含硫有機(jī)化合物中硫的高效Thiobacillus thioparus菌株，最適條件下脫硫率高達(dá)94.3%。也有研究證實(shí)，通過富集培養(yǎng)石油污染場地土壤中的降解菌，可以從土著微生物中分離純化，篩選得到石油烴降解細(xì)菌瓊式不動桿菌，其對石油烴降解率達(dá)60.2%[8]。目前很多具有雜環(huán)芳烴降解能力的細(xì)菌和真菌相繼被篩選出來，但對于含硫雜環(huán)芳烴的降解微生物要求更高，以典型的含硫雜環(huán)芳烴污染物二苯并噻吩（dibenzothiophene，DBT）為例，需要專一性地?cái)嚅_DBT 分子中的C—S 鍵和C—C 鍵，因此，相關(guān)功能微生物篩選難度大，且多停留于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

一直以來，微生物菌種在污染土壤修復(fù)過程中應(yīng)用效果較實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過程弱、穩(wěn)定性差，是生產(chǎn)實(shí)踐中面臨的最大難題[9]。這是由于接種的微生物要與大量的土著微生物進(jìn)行競爭，因此較難發(fā)揮其在純培養(yǎng)條件下的污染物分解潛力，且分解效果和接種微生物與土壤中土著微生物的群落關(guān)系密切相關(guān)[10]。研究表明，接種土著菌和外源菌后，外源菌的生物量隨處理時(shí)間的延長而降低，而土著菌生物量則隨處理時(shí)間的延長而增加[11]；也有研究證明，外源菌群激活了土著菌群的降解功能，促進(jìn)了微生物之間的協(xié)同合作，進(jìn)而達(dá)到生物修復(fù)的效果[12-13]。但微生物接種是否可以強(qiáng)化土著微生物功能，結(jié)合其自身降解能力提升石油污染土壤凈化能力尚需進(jìn)一步研究。

前期研究表明，從石油污染土壤中篩選的DBT 降解菌Rhodococcussp.ZYL-1 在培養(yǎng)基中具有較好的DBT 去除率。為進(jìn)一步探討該菌株（紅球菌）在石油污染土壤中的應(yīng)用效果，分析功能菌（紅球菌）接種對土壤培養(yǎng)過程中DBT 的降解水平，結(jié)合16S rDNA 高通量測序及生物信息學(xué)分析，解析功能菌接種對土壤細(xì)菌群落演替和多樣性動態(tài)變化的影響，系統(tǒng)闡述生物強(qiáng)化對土壤DBT 降解功能種群的影響，以期為微生物修復(fù)石油污染土壤提供理論與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株分離于山西某石油污染土壤，所在區(qū)域?qū)贉貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，年平均氣溫為11 ℃，年降水量約為400 mm。石油污染土壤為砂質(zhì)壤土，DBT 濃度為2.87 mg/kg，有機(jī)碳濃度為23.87 g/kg，全氮濃度為1.30 g/kg，速效磷濃度為69.26 mg/kg，含水率為8.70%。菌株經(jīng)生理生化鑒定和16S rDNA 鑒定為紅球菌屬，革蘭氏反應(yīng)陽性，命名為Rhodococcussp.ZYL-1，已于2022 年5 月18 日保藏于中國普通微生物菌種保藏與管理中心（CGMCC），保藏編號為CGMCC 24903[7]。

功能菌劑制備：利用溶菌肉湯固體培養(yǎng)基活化菌種Rhodococcussp.ZYL-1，挑取單菌落接種于溶菌肉湯液體培養(yǎng)基擴(kuò)培，至對數(shù)生長期，活化好的菌液（菌濃度為1×108CFU/mL）可作為功能菌劑備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為2 組，石油污染土壤為自然降解組，編號NAT；石油污染土壤+功能菌為生物強(qiáng)化組，編號BIOEIF，菌株Rhodococcussp.ZYL-1 接種濃度為1×108CFU/mL。將土壤樣品去除砂粒、植物殘?bào)w等雜物，過18 目篩備用。試驗(yàn)于1 000 mL 錐形瓶中進(jìn)行，向每個(gè)錐形瓶中加入1 kg 前期所取的石油污染土壤，向土壤中添加濃度為100 mg/L 的二苯并噻吩-乙酸乙酯溶液，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)平行樣。取100 μL于-20 ℃保存的菌液Rhodococcussp.ZYL-1，接種于5 mL 滅菌LB 液體培養(yǎng)基，搖床30 ℃、150 r/min活化12 h，轉(zhuǎn)接1 mL 活化的菌種至100 mL 滅菌的液體LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h。離心收集菌體，用無菌蒸餾水稀釋至108CFU/mL。添加10%（v/w）的菌懸液至BIOEIF 組，攪拌混勻。試驗(yàn)在25 ℃的暗箱中進(jìn)行，保持土壤含水率為15%～20%。培養(yǎng)周期為40 d，每隔10 d 取樣50 g，存放于-20 ℃冰箱中，用于后續(xù)DBT 和DNA 提取，每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

1.2.2 二苯并噻吩測定方法

（1）土壤中DBT 的提取。將土樣移入250 mL錐形瓶中，用100 mL 超純水將土壤打散；加入20 mL 乙酸乙酯振蕩20 min，經(jīng)超聲萃取20 min 后，重復(fù)振蕩20 min，靜置分層；將上層清液移至離心管中離心，回收上層透明清液，過0.22 μm 有機(jī)濾膜。

（2）儀器分析條件。色譜條件為TG-5SILMS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。色譜柱溫度程序：50 ℃保持2 min，然后以15 ℃/min 程序升溫至250 ℃，保持2 min，總時(shí)長19.333 min。載氣為氦氣，純度≥99.999%；氦氣流速為1 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI 源）；電離能量為70 eV；離子源溫度為280 ℃；傳輸線溫度為280 ℃；選擇離子監(jiān)測（SIM）模式，保留時(shí)間為13.41 min，定量離子為152（m/z），定性離子為184、139（m/z）。

1.2.3 土壤DNA 抽提、PCR 擴(kuò)增及高通量測序

土壤DNA 的提取按照Fast DNA TM Spin kit for soil 試劑盒進(jìn)行，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質(zhì)量，使用NanoDrop2000 測定DNA 濃度和純度；使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA 基因V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR（ABI GeneAmp? 9700 型）擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸30 s）；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，在4 ℃進(jìn)行保存。PCR 反應(yīng)體系為5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5μmol/L）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，用H2O 補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本重復(fù)3 次。PCR 產(chǎn)物采用Illumina 公司MiSeq PE300 平臺進(jìn)行高通量測序，測序和數(shù)據(jù)分析工作均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用fastp 軟件[14]對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，F(xiàn)LASH 軟件[15]進(jìn)行拼接，應(yīng)用UPARSE 軟件[14]根據(jù)97%[16-17]的相似度對序列進(jìn)行OTU 聚類并且去除嵌合體。利用RDP classifier[18]對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫（version 138），設(shè)置比對閾值為70%。使用vegan 包[19]和picante包[20]計(jì)算樣品的α多樣性，包括香農(nóng)多樣性、Chao1 豐富度、辛普森均勻度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性。使用vegan包進(jìn)行基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)，用來評估所有樣品的β多樣性。使用pheatmap包繪制帶有聚類樹的熱圖，venn 包繪制韋恩圖。應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析（MENA）構(gòu)建OTU 水平的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)[21]，并用Gephi 0.9.2 軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與討論

2.1 功能菌接種對石油污染土壤DBT 降解的影響

對比NAT 和BIOEIF 2 組處理土壤中DBT 的降解情況，結(jié)果如圖1 所示。基于氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)40 d 后，接種Rhodococcussp.ZYL-1 的土壤DBT 降解率達(dá)到59.46%，顯著高于僅通過土壤土著微生物的自然降解效果（49.99%）（P<0.001）。通過進(jìn)一步分析培養(yǎng)過程中DBT 的降解率可以看出，石油污染土壤培養(yǎng)過程中，不論是否接種功能菌，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加DBT 降解率均呈現(xiàn)穩(wěn)定升高的趨勢，但培養(yǎng)30 d后，土壤微生物對于DBT 的降解減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期。DBT 的降解主要發(fā)生在前10 d，在培養(yǎng)第10 天，NAT 組和BIOEIF 組的DBT 降解率分別達(dá)34.57%和51.04%，BIOEIF 組相比NAT 組降解率提升了16.47%，說明接種Rhodococcussp.ZYL-1 可以顯著提高DBT 的快速降解能力，但功能菌對土壤DBT 快速降解的持續(xù)效果有待提升。整個(gè)土壤培養(yǎng)過程中，BIOEIF 組的DBT 降解率顯著高于NAT 組，說明向土壤中接種DBT 降解菌顯著促進(jìn)了土壤中DBT 的生物降解。這與郭志國等[22]在純培養(yǎng)的條件下，DBT 降解菌對于DBT 的降解率在72 h 就達(dá)到59.83%的結(jié)果相類似。

圖1 二苯并噻吩在土壤系統(tǒng)中的降解情況Fig.1 Degradation profile of dibenzothiophene in the soil system

2.2 污染土壤培養(yǎng)過程中細(xì)菌群落演替特征

根據(jù)97%的序列相似性，在所有樣本中檢測到1 318 個(gè)OTUs，其中1 238 個(gè)OTUs 在2 個(gè)處理組中共同出現(xiàn)（圖2）。這表明接種功能菌Rhodococcussp.ZYL-1 不會對污染土壤的土著微生物群落種類造成明顯影響。在門水平上分析結(jié)果表明（圖3），F(xiàn)irmicutes、Actinobacteria 和Proteobacteria 是污染土壤培養(yǎng)過程中的主要優(yōu)勢類群，這與祁燕云等[23-24]的研究結(jié)果相似。在所有樣品中，三者的相對豐度之和均在90%以上。在土壤培養(yǎng)初期Firmicutes豐度最高，隨著土壤培養(yǎng)到第40 天，Actinobacteria和Proteobacteria 的豐度均有不同程度的提升。層次聚類熱圖（圖4）顯示，2 個(gè)處理組中屬水平豐度前25 的細(xì)菌可聚類為4 組，其中Micromonospora、Bacillus、unclassified_f_Planococcaceae聚為1 組，為污染土壤培養(yǎng)過程中的優(yōu)勢菌屬，Micromonospora被認(rèn)為是常見的可降解污染土壤中石油烴的微生物[25]，Bacillus已被多次報(bào)道對DBT有很高的降解能力，可通過“4S”脫硫途徑代謝DBT[26]。在BIOEIF 組中，接種的功能菌Rhodococcussp.ZYL-1雖未出現(xiàn)在基于豐度前25 物種的熱圖中，但在種水平分析中仍可檢測到該物種的存在，間接證明接種功能菌在石油污染土壤中存在定殖，結(jié)合圖1 的降解結(jié)果，說明接種的Rhodococcussp.ZYL-1 不僅自身對DBT 起降解作用，同時(shí)協(xié)同促進(jìn)了其他DBT 降解菌的降解作用。

圖2 不同處理中OTUs 的數(shù)量差異Fig.2 Quantitative differences of OTUs in different treatments

圖3 門水平的相對豐度Fig.3 Relative abundance at the phylum level

圖4 屬水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance at the genus level

通過α 多樣性計(jì)算方法分析石油污染土壤培養(yǎng)期間的細(xì)菌群落香農(nóng)多樣性指數(shù)、Chao1 豐富度指數(shù)、辛普森均勻度指數(shù)以及系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)（圖5）。從圖5 可以看出，培養(yǎng)40 d 過程中，不同處理組細(xì)菌多樣性均呈現(xiàn)先降低后升高并趨于穩(wěn)定的規(guī)律，這可能是造成DBT 降解率前期高，而后期減緩的原因。BIOEIF 組的香農(nóng)多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育指數(shù)低于NAT 組，尤其在培養(yǎng)30 d 以后顯著低于NAT 組（P<0.05）。培養(yǎng)后期，BIOEIF 組的辛普森均勻度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)也低于NAT 組，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性?；贐ray-Curtis 異質(zhì)性矩陣的主坐標(biāo)分析（PCoA）被用來顯示所有樣品之間的差異（圖6）。根據(jù)PCoA 以及置換次數(shù)999 次的ANOSIM 分析表明，所有樣品在土壤培養(yǎng)過程中的細(xì)菌群落分為2 類（R=0.261 7，P<0.05）。以上結(jié)果表明，接種Rhodococcussp.ZYL-1 會顯著影響DBT污染土壤的α多樣性和β多樣性。

圖5 不同處理污染土壤培養(yǎng)過程中的細(xì)菌多樣性Fig.5 Bacterial diversity during the incubation of contaminated soil with different treatments

圖6 不同處理污染土壤培養(yǎng)過程中基于OTUs 水平的PCoA 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.6 PCoA on OTU level during the incubation of contaminated soil with different treatments

2.3 降解DBT 的關(guān)鍵微生物分析

在石油污染土壤培養(yǎng)過程中細(xì)菌群落組成和功能的變化必然會影響DBT 的降解。因此，利用網(wǎng)絡(luò)分析挖掘在土壤培養(yǎng)過程中與DBT 降解相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌，有助于進(jìn)一步理解接種Rhodococcussp.ZYL-1 對土壤微生物功能變化的影響。本研究通過細(xì)菌屬水平數(shù)據(jù)進(jìn)一步篩選了不同處理的DBT 降解關(guān)鍵微生物（P<0.05，R>0.9）（圖7）。在NAT 組以及BIOEIF 組中分別有24、29 個(gè)節(jié)點(diǎn)與DBT 降解顯著相關(guān)，即視為DBT 降解的關(guān)鍵物種。在NAT 組中，與DBT 降解相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)菌主要屬于Firmicutes 和Bacteroidota，而BIOEIF 組中的關(guān)鍵降解菌主要屬于Firmicutes 和Actinobacteriota，這與此前報(bào)道的Firmicutes、Bacteroidota 和Actinobacteriota等優(yōu)勢門對石油烴的降解有顯著響應(yīng)的結(jié)論相符[23-24,27]。從屬水平看，Shimazuella、Gracilibacillus以及g_unclassified_o_Chitinophagales在2 個(gè)處理中均作為關(guān)鍵潛在降解菌出現(xiàn)，是NAT 組和BIOEIF 組中與DBT 降解相關(guān)的共有菌屬，基于2.2 節(jié)對不同處理組細(xì)菌相對豐度分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Shimazuella同時(shí)是石油污染土壤培養(yǎng)過程中豐度前25 的主要優(yōu)勢屬。根據(jù)以上結(jié)果推斷，Shimazuella更可能是潛在的具有DBT 降解能力或者參與DBT 代謝的關(guān)鍵菌屬。另外，從圖4 還可以發(fā)現(xiàn)，在對BIOEIF 組和NAT 組的網(wǎng)絡(luò)分析中篩選出的關(guān)鍵物種大多數(shù)與DBT 降解率呈顯著正相關(guān)，說明這些關(guān)鍵菌可以促進(jìn)土壤中DBT 的降解，但Micromonospora與DBT 降解呈顯著負(fù)相關(guān)，說明Micromonospora可能會與其他降解菌存在競爭或抑制作用，不利于DBT 的降解。

為進(jìn)一步探究接種功能菌對土壤細(xì)菌群落物種間互作關(guān)系的影響，基于隨機(jī)矩陣?yán)碚撛贠TUs 水平上構(gòu)建了土壤細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（圖8），并計(jì)算了網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣鲄?shù)。從圖8 可以看出，BIOEIF 組的核心微生物網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)（673）低于NAT 組（779），邊的數(shù)目（1 639）也明顯低于NAT 組（1 721），與細(xì)菌群落多樣性結(jié)果相似，說明接種功能菌淘汰了沒有降解能力的土著微生物，從而提高降解效果?；诰W(wǎng)絡(luò)連接度和模塊化指數(shù)指標(biāo)（如avgK、avgCC 等）分析發(fā)現(xiàn)，接種Rhodococcussp.ZYL-1 顯著提升了核心微生物網(wǎng)絡(luò)聚類系數(shù)和圖密度，使核心物種間聯(lián)系更緊密。在網(wǎng)絡(luò)分析中，通常認(rèn)為正相關(guān)連接反映物種之間的合作關(guān)系，負(fù)相關(guān)連接代表物種之間的競爭關(guān)系，對比BIOEIF 組和NAT 組可以看出，BIOEIF 組中正相關(guān)關(guān)系比例（57%）明顯高于NAT 組（44%），說明接種Rhodococcussp.ZYL-1 提高了核心物種間的協(xié)同合作關(guān)系，這也可能是接種功能菌雖然降低土壤物種多樣性但卻提升了生物修復(fù)效果的原因。

圖8 不同處理中細(xì)菌 OTUs 分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.8 Network association of bacterial OTUs in different treatments

3 結(jié)論

（1）接種Rhodococcussp.ZYL-1 顯著提高了石油污染土壤的DBT 降解率，培養(yǎng)40 d 后降解率達(dá)到60%，其提升效果在土壤培養(yǎng)前10 d 最強(qiáng)。

（2）Micromonospora、Bacillus、unclassified_f_Planococcaceae為石油污染土壤培養(yǎng)過程中的優(yōu)勢菌屬，接種Rhodococcussp.ZYL-1 未對DBT 污染土壤的細(xì)菌群落組成造成顯著影響，但是卻降低了DBT 污染土壤的細(xì)菌群落的α多樣性，Rhodococcussp.ZYL-1 并未成為BIOEIF 組中的優(yōu)勢物種。

（3）接種Rhodococcussp.ZYL-1 提 升了土壤DBT 降解關(guān)鍵菌種類和數(shù)量，尤其是Shimazuella可能是參與DBT 的分解代謝的關(guān)鍵微生物，接種Rhodococcussp.ZYL-1 顯著提高了核心物種間的協(xié)同合作關(guān)系，這可能是功能菌強(qiáng)化土壤DBT 降解的主要原因。