聶 蕾, 何 玥, 郭 爽, 王 棟, 涂 亮,劉鵬飛, 王安貴, 祝云芳, 吳 迅,3, 陳澤輝, 郭向陽

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025; 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所, 貴陽 550006;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部喀斯特山區(qū)作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室, 貴陽 550006)

糧食安全已經(jīng)成為世界各國普遍關(guān)注的問題,玉米是主要糧食作物之一,提高玉米產(chǎn)量對保障糧食安全起著至關(guān)重要的作用[1]。穗部性狀作為玉米產(chǎn)量的重要構(gòu)成因子,包括穗長、穗粗、穗行數(shù)、穗重等,具有較產(chǎn)量性狀高的配合力和受環(huán)境影響程度小的優(yōu)勢,在深度解析玉米產(chǎn)量性狀變異的遺傳基礎(chǔ)方面發(fā)揮著重要作用[2]。探討穗部性狀變異的遺傳基礎(chǔ),對指導(dǎo)玉米育種、提高玉米產(chǎn)量具有十分重要的意義。例如,穗部性狀能夠預(yù)測玉米的產(chǎn)量,以便更好地利用種植期間的資源,最終達(dá)到高產(chǎn)的目的[3]。近年來,有關(guān)玉米穗部性狀QTL定位的研究取得了顯著進(jìn)展,王輝等[4]以鄭58和HD568為親本構(gòu)建的220份重組自交系群體為供試材料,在3個不同種植密度下共檢測到42個QTL,其中包括8個穗長、14個穗粗、14個穗行數(shù)和6個行粒數(shù),單個QTL可解釋4.20%～14.07%的表型變異。宋曉恒等[5]通過豫82和豫87-1雜交構(gòu)建的重組近交系(RIL),對玉米穗長、穗粗和籽粒深度進(jìn)行QTL定位分析,共檢測到7個QTL,分布在1號、2號、4號、5號、8號染色體上。Shi等[6]以雜交種Xianyu335開發(fā)的240個優(yōu)良品系所組成DH群體為構(gòu)圖群體,基于964個SNP構(gòu)建遺傳圖譜,在3種不同的生長條件下共鑒定出4個穗粗QTL,分別位于1號、3號、4號染色體上,可解釋表型變異率在4.7%～28.3%之間。白娜等[7]采用地方品種四路糯經(jīng)作為供體親本,穗行數(shù)可達(dá)18～22行的農(nóng)531作為輪回親本,通過完備區(qū)間作圖法(Inclusive composite interval mapping,ICIM)對穗行數(shù)QTL進(jìn)行定位解析,在第5染色體136.3～140.0 Mb之間,定位到穗行數(shù)主效位點qKRN5.04,解釋了21.76%表型變異。趙強(qiáng)等[8]以T32和齊319為親本構(gòu)建的雙親分離群體為材料,利用高密度SNP標(biāo)記對5個玉米穗部相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位,檢測到16個QTL,篩選出4個控制穗部的候選基因。Yan等[9]利用266份F2∶3家系為材料及150個SSR和26個RFLP分子標(biāo)記進(jìn)行QTL定位,共測得29個和單穗產(chǎn)量,百粒重、穗行數(shù)與行粒數(shù)相關(guān)QTL,單個位點可以解釋3.70%～16.80%的表型變異,其中11個位點在多環(huán)境中被檢測到。譚巍巍等[10]以黃早四為共同親本,分別以掖478和齊319雜交構(gòu)建兩套F2∶3群體為試驗材料,在3個不同環(huán)境下,兩個群體分別檢測到33個和46個穗部相關(guān)性狀QTL。這些研究為深入揭示玉米產(chǎn)量性狀變異的遺傳基礎(chǔ)提供了豐富的科學(xué)支撐,但比較發(fā)現(xiàn),不同研究者因為所用群體類型不同、大小差異以及標(biāo)記等的不同,其研究結(jié)果也不盡相同。因此,本研究以兩個熱帶玉米骨干自交系(T32和QR273)為親本構(gòu)建的F2、F2∶3家系為試驗材料,結(jié)合高通量的GBS測序技術(shù)和多環(huán)境下的穗部性狀評價結(jié)果,鑒定控制玉米穗部性狀相關(guān)遺傳區(qū)段,揭示其遺傳效應(yīng)并開發(fā)功能性標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)分析方法分析控制穗部性狀變異的候選基因,為初步解析玉米穗部性狀變異的遺傳基礎(chǔ)提供更豐富的理論支撐,也為后續(xù)的精細(xì)定位、候選基因圖位克隆和分子標(biāo)記輔助育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的試驗材料選擇熱帶種質(zhì)的玉米骨干玉米自交系QR273和T32,由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所提供。其中,QR273表現(xiàn)出配合力高、籽粒寬短,T32則表現(xiàn)為穗粗大,籽粒長厚,以這兩個自交系為親本構(gòu)建的150份F2、F2∶3家系為作圖群體,后代的穗部性狀表現(xiàn)出顯著差異。

1.2 試驗方法

1.2.1田間試驗及性狀考察

2021年在海南種植150份F2分離后代,5葉期單株取樣提取基因組DNA,用于基因型鑒定,同時自交獲得F2∶3家系。2022年在貴州省貴陽市貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地、甘肅省張掖市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗基地各栽植150個F2∶3家系及2個親本。試驗按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計,重復(fù)2次,行長4 m,行距0.64 m,每行18株,田間管理按照當(dāng)?shù)赜衩追N植和管理方法執(zhí)行。

玉米成熟期,每行連續(xù)采收所有果穗,自然風(fēng)干至恒重,進(jìn)行室內(nèi)考種,每個材料隨機(jī)選取5株進(jìn)行穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、禿尖長等穗部性狀的調(diào)查,參考石云素等[11]制定的《玉米種質(zhì)資源描述規(guī)范與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2.2表型數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 Microsoft Excel2010 軟件整理表型數(shù)據(jù),采用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析、方差分析、相關(guān)性分析及廣義遺傳力[12],遺傳力公式如下:

1.2.3基因型鑒定

DNA質(zhì)量檢測和GBS測序委托北京康普生生物有限公司完成,具體操作依據(jù)吳迅等[13]描述的方法執(zhí)行。即玉米F2植株5葉時期時,取各單株的幼嫩葉,采用改良CTAB法提取基因組DNA[14];利用簡化基因組測序技術(shù)(GBS)對每個單株的基因型進(jìn)行鑒定。

1.2.4QTL分析

利用IciMapping4.1軟件中的完備區(qū)間作圖法對5個穗部性狀進(jìn)行QTL檢測,隨機(jī)抽樣1 000例,QTL定位中閾值定為3。QTL命名格式為 q+性狀英文縮寫字母+染色體+序號。參考Stuber等[15]方法,對基因作用模式進(jìn)行了估計,|d/a|=|顯性效應(yīng)值/加性效應(yīng)值|、A(加性方式):|d/a|=0.00-0.20;PD(部分顯性):|d/a|=0.21-0.80;D(顯性方式):|d/a|=0.81-1.20;OD(超顯性方式):|d/a|>1.20。

1.2.5候選基因預(yù)測

基于兩個環(huán)境下玉米穗部相關(guān)性狀的QTL定位結(jié)果,結(jié)合玉米B73參考基因組中的物理位置(Ref Gen_v4(https://www.maizeGDB.org/),綜合分析不同QTL的遺傳背景和效應(yīng),鑒定控制目標(biāo)性狀的基因位點所在染色體區(qū)段,與公共數(shù)據(jù)庫和已發(fā)表的文獻(xiàn)QTL定位信息進(jìn)行比較,尋找“一致性”QTL,并對該區(qū)段內(nèi)的基因進(jìn)行分析,預(yù)測候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗部性狀表型分析

在兩個環(huán)境條件下,根據(jù)雙親(T32和QR273)與150個F2∶3家系5個穗部性狀表型的平均值,可以看出雙親在不同環(huán)境中的穗部性狀表現(xiàn)存在顯著差異。親本QR273在兩種環(huán)境中的穗長、行粒數(shù)的表現(xiàn)顯著大于親本T32,在貴陽單一環(huán)境下5個性狀表現(xiàn)均高于T32;而對張掖環(huán)境中的穗粗、穗行數(shù)和禿尖長而言,親本T32的表現(xiàn)優(yōu)于QR273。F2∶3家系的穗長、穗行數(shù)和行粒數(shù)的均值介于雙親之間,為中親優(yōu)勢;穗粗在兩個環(huán)境中的表現(xiàn)都較高,其均值大于雙親為超親優(yōu)勢。5個穗部性狀偏度和峰度的絕對值均小于1,符合正態(tài)分布,可實現(xiàn)QTL定位分析。從遺傳力的研究結(jié)果中可看出,該群體遺傳力在不同環(huán)境中存在差異,如貴陽環(huán)境下5個穗部相關(guān)性狀的遺傳力高于張掖環(huán)境下,在貴陽穗粗遺傳力是61.87%,而在張掖遺傳力為11.11%(表1)。

表1 親本和 F2∶3群體的穗部性狀表現(xiàn)Table 1 Performance of ear traits in parents and F2∶3 population

2.2 穗部性狀相關(guān)性分析

表2為穗部各個性狀之間相關(guān)分析。結(jié)果表明,在不同環(huán)境條件中,穗長和穗粗、行粒數(shù)、禿尖長都表現(xiàn)出顯著的正相關(guān),穗長和穗行數(shù)在兩個環(huán)境中均表現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)。穗粗除禿尖長外,與其他穗部性狀在兩個環(huán)境中呈顯著正相關(guān)。行粒數(shù)與貴陽環(huán)境中禿尖長之間存在極顯著的負(fù)相關(guān),與張掖呈負(fù)相關(guān)。

表2 穗部之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between ears

2.3 高密度物理圖譜構(gòu)建

按照缺失率小于0.05,具有確定物理圖距為標(biāo)準(zhǔn)對獲得的10萬個SNPs進(jìn)行過濾,最后獲得68 994個高質(zhì)量SNPs,均勻地分布在10條染色體上(圖1)。各染色體上的標(biāo)記數(shù)量大小依次表現(xiàn)為Ch4、Ch2、Ch1、Ch3、Ch5、Ch8、Ch9、Ch7、Ch6、Ch10,其數(shù)量分別為8 901個、8 824個、8 725個、7 623個、7 174個、6 407個、5 782個、5 592個、5 432個、4 534個。

注:每一行代表一個SNP標(biāo)記,不同的顏色顯示不同的標(biāo)記密度。淺色表示標(biāo)記的密度較低,深色表示標(biāo)記的密度較高。圖1 物理圖譜Fig.1 Physical map

2.4 穗部性狀QTL分析

由表3可知,兩個環(huán)境下共檢測到46個穗部相關(guān)性狀QTL,分布在10條染色體上,單個QTL可解釋表型變異范圍為1.89%～17.18%,其中,解釋表型變異大于10%的有6個,分別為qEL1-3、qED6-1、qED6-2、qERN3-1、qERN7和qEBT8-1。檢測到與穗長相關(guān)的QTL共有10個,分布在1號、2號、3號、4號、6號染色體上,單個QTL可解釋的表型變異3.35%～11.80%。在張掖環(huán)境下,位于1號染色體上的qEL1-3解釋的表型變異最大,其貢獻(xiàn)率為11.80%;穗粗在兩環(huán)境下共檢測到4個QTL,分布于1號、5號、6號染色體上,單個QTL可解釋的表型變異范圍為5.92%～11.03%;檢測到與穗行數(shù)有關(guān)的QTL共19個,分布在除了第1號和第9號染色體外的其他8條染色體上,單個QTL可解釋的表型變異范圍為1.89%～17.18%;檢測到與行粒數(shù)相關(guān)QTL共12個,分布在1號、2號、3號、5號、7號、9號、10號染色體上,單個可解釋表型變異范圍為3.50%～8.71%;檢測到與禿尖長相關(guān)QTL共5個,主要分布1號、2號和8號染色體上,單個QTL可解釋的表型變異范圍為2.16%～10.36%,qEBT8-1解釋的表型變異最大,為10.36%。就基因作用方式而言,5個穗部相關(guān)性狀的QTL表現(xiàn)不盡一致。其中4個QTL基因作用方式表現(xiàn)為加性效應(yīng);10個呈部分顯性;4個呈顯性;28個為超顯性。本研究多數(shù)與穗部性狀有關(guān)的QTL為部分顯性及超顯性,與Xiang等[16]、蘭進(jìn)好等[17]的研究結(jié)果一致。在46個QTL中,增效等位基因來源于QR273的有17個,來自T32的有29個。

表3 5個穗部相關(guān)性狀QTL定位結(jié)果Table 3 QTL mapping results of 5 ear-related traits

2.5 一致性QTL

Tuberosa等[18]研究表明,對同一性狀QTL進(jìn)行不同環(huán)境中的檢測,若其標(biāo)記區(qū)間一致、增效等位基因起源一致則視為同一QTL。本研究通過對兩環(huán)境條件下的初步定位結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),qEL1-1和qEL1-2都在1號染色體13.07～13.09 Mb區(qū)間內(nèi)被檢測到,增效等位基因來源于QR273;qERN5-1和qERN5-2都在5號染色體194.67～195.42 Mb區(qū)間內(nèi)被檢測到,增效等位基因來源于QR273,這兩個在不同環(huán)境下均被檢測到的“一致性QTL”受環(huán)境影響較小,能夠穩(wěn)定表達(dá)對于玉米產(chǎn)量的形成具有重要意義(表4)。

表4 一致性QTLTable 4 Consistency QTL

表5 基因位置及功能注釋Table 5 The gene location and functional annotation

2.6 候選基因分析

結(jié)合兩環(huán)境下的定位結(jié)果與已公開QTL數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn),本研究檢測到46個QTL中有8個QTL與前人定位結(jié)果重疊,以篩選出的8個一致性QTL為目標(biāo),基于Gramene 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(http://www.gramene.org)對目標(biāo)候選基因進(jìn)行分析,結(jié)合前人的研究報道,初步預(yù)測得到Zm00001d041072、Zm00001d053048、Zm00001d011355、Zm00001d041073、Zm00001d030086、Zm00001d030088等6個與穗部相關(guān)的候選基因。其中,Zm00001d041072是從控制穗長QTL區(qū)間發(fā)現(xiàn),它編碼的ABC轉(zhuǎn)運蛋白在植物生長發(fā)育中發(fā)揮作用,因為植物生長發(fā)育需要多種信號分子來響應(yīng)和溝通,這些信號分子跨膜轉(zhuǎn)運時需要ABC轉(zhuǎn)運蛋白[19];Zm00001d053048位于穗行數(shù)QTL區(qū)間內(nèi),其編碼的富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體激酶為植物最大跨膜類受體激酶亞族,對植物發(fā)育及抗病反應(yīng)具有廣泛的調(diào)控作用[20]。這些受體蛋白激酶是脅迫表達(dá)相關(guān)基因中的一部分,參與植物體對逆境的應(yīng)答及防御相關(guān)過程;Zm00001d011355編碼的含鋅指CCCH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),CCCH型鋅指蛋白對植物生長發(fā)育及生物與非生物脅迫響應(yīng)具有重要的調(diào)控作用。RNA能被該蛋白識別并結(jié)合[21];Zm00001d041073編碼的E3泛素蛋白連接酶RGLG1,2012年Cheng等[22]發(fā)現(xiàn)RGLG1、RGLG2對擬南芥對干旱脅迫的反應(yīng)具有負(fù)調(diào)控作用,二者通過泛素化修飾ERF53,促進(jìn)了它被26S蛋白酶體的降解,削弱植物對干旱的抗性等[22]。RGLG1,RGLG2也涉及生長素信號途徑、生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙,生長發(fā)育缺陷,對生長素轉(zhuǎn)運蛋白如PIN的含量有影響,對生長素的分配也有一定的影響[23]。Zm00001d030086是從控制行粒數(shù)的QTL區(qū)間內(nèi)找到的,它所編碼的四肽重復(fù)序列樣超家族蛋白(TPR)是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄共抑制因子,參與多種植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。擬南芥 TPR 除了參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)外,還參與調(diào)控植物的花期等生命過程[24];Zm00001d030088編碼的晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白,該蛋白是一類較常見的當(dāng)植物遭受干旱脅迫時產(chǎn)生的具有保護(hù)功能的蛋白[25]。有研究結(jié)果表明,LEA蛋白基因的表達(dá)能夠提高植物的耐旱性和抗寒性[26]。

3 討 論

玉米穗部性狀受到復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控,容易受到環(huán)境的影響。通過與前人研究結(jié)果分析比較,共發(fā)現(xiàn)8個控制玉米穗部相關(guān)性狀的一致性QTL。Zhou等[27]利用四交群體在1號染色體184.92～209.86 Mb(B73Ref-Gen_v4)區(qū)間內(nèi)定位到1個穗長QTL,本研究在1號染色體189.39～189.78 Mb和188.85～189.35 Mb區(qū)間內(nèi)定位到2個控制穗長的QTL,分別為qEL2和qEL1-3;譚巍巍等[10]在3號染色體94.27～141.39 Mb和10號染色體60.38～90.58 Mb區(qū)間內(nèi)分別定位到控制穗行數(shù)的qKRE2-3-2和qKRE1-10-1,本研究在相鄰位置95.13～95.31 Mb和83.88～85.11 Mb區(qū)間內(nèi)分別定位到控制穗行數(shù)的qERN3-1和qERN10;張君[28]在8號染色體137.81～148.01 Mb區(qū)間內(nèi)定位到控制穗行數(shù)的qERN8b,本研究在相鄰位置147.93～148.08 Mb區(qū)間內(nèi)定位到控制穗行數(shù)的qERN8;王輝等[4]在4號染色體215.09～205.41 Mb區(qū)間內(nèi)定位到一個控制穗行數(shù)的QTL為qERN4,本研究在4號染色體207.41～210.61 Mb區(qū)間內(nèi)定位到兩個控制穗行數(shù)的QTL,分別為qERN4-1和qERN4-2;王輝等[4]在2號染色體105.71～103.87 Mb區(qū)間內(nèi)定位到一個控制行粒數(shù)的QTL為qKNR4,本研究在2號染色體104.35～104.85 Mb區(qū)間內(nèi)定位到控制行粒數(shù)的QTL為qKNR2-3。除此之外,本研究在1號染色體上檢測到的QTL較多,與劉琳[29]的研究結(jié)果一致,在5號、6號、7號、9號染色體上定位到一些新的穗部性狀QTL。

隨著分子生物學(xué)的日益發(fā)展,愈來愈多的研究者發(fā)現(xiàn)植物激素合成以及一些重要轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶對玉米生長發(fā)育發(fā)揮重要作用[30]。趙強(qiáng)等[8]基于高密度SNP標(biāo)記對玉米穗部相關(guān)性狀的候選基因分析,在穗長、穗行數(shù)和禿尖長區(qū)間內(nèi)預(yù)測出4個候選基因,與穗行數(shù)qERN1位點關(guān)聯(lián)的候選基因Zm00001d027721,其編碼的高親和力鎳轉(zhuǎn)運家族蛋白具有運輸功能,本研究與行粒數(shù)qKNR2-3位點關(guān)聯(lián)的候選基因Zm00001d030086也具有參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。Zhou等[27]通過QTL定位與全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)確定了3個控制穗長QTL的候選基因,其編碼的蛋白與植物生長素運輸、細(xì)胞增殖和發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究從控制穗長、穗行數(shù)和行粒數(shù)的QTL區(qū)間內(nèi)預(yù)測了6個可能影響穗部性狀的基因,其編碼的蛋白具有合成激素,運輸和信號傳導(dǎo)的功能,發(fā)揮的具體作用在擬南芥等植物中得到了驗證。

4 結(jié) 論

本研究以熱帶種質(zhì)自交系為親本構(gòu)建雙親分離群體作為試驗材料,通過QTL定位與候選基因分析,共定位到46個穗部性狀QTL。與已發(fā)表文獻(xiàn)及公開QTL數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)8個與前人研究結(jié)果重合,分別控制穗長、穗行數(shù)和行粒數(shù)的變異,其中1個穗長QTL和1個穗行數(shù)QTL在多環(huán)境下均被檢測到,且區(qū)間完全重疊。研究結(jié)果在前人定位結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步減小QTL置信區(qū)間,為進(jìn)一步的精細(xì)定位提供候選靶標(biāo)。本研究共預(yù)測得到6個候選基因,分別是:Zm00001d041072、Zm00001d053048、Zm00001d011355、Zm00001d041073、Zm00001d030086、Zm00001d030088,其編碼的蛋白具有合成激素等生物學(xué)功能,可作為后續(xù)基因圖位克隆和分子輔助育種的候選靶標(biāo)。