顏 麗, 孔維杰, 楊雪蓮, 吳永飛, 王 霞, 田山君

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025)

長葉竹柏(Nageiafleuryi)為羅漢松科、竹柏屬,主要分布在中國、越南、柬埔寨等東南亞國家,在《中國植物紅皮書》中被列為瀕危植物。長葉竹柏果仁可用作食用油、工業(yè)用油原料[1]以及木材原料,也是治療風(fēng)濕病[2]和發(fā)燒[3]的中草藥,是具有較高經(jīng)濟價值的珍稀樹種。近年來,隨著植物藥用成分分離技術(shù)水平的提高,國內(nèi)外學(xué)者對竹柏科植物進行了大量的研究,結(jié)果顯示,該科植物含有二萜、二萜內(nèi)酯、甾體、倍半萜、苯丙素、木脂素、三萜及雙黃酮等成分[4-5]。目前,對竹柏科植物所含的二萜內(nèi)酯以及雙黃酮等成分進行了大量的生物活性研究,表明竹柏科植物具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化及抗炎活性功能[6]。

葉綠體主要是綠色植物進行光合作用的重要場所,在其他代謝途徑中也起關(guān)鍵作用[7],具有半自主遺傳性。葉綠體大多具有保守的環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu),但不同物種間會存在一定差異,主要表現(xiàn)為IR區(qū)域長度和方向的不同[8]。葉綠體研究技術(shù)發(fā)展迅速,現(xiàn)已應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育[9]和種群分析[10]等方向的研究,對杧果(Mangiferaindica)[11]、香花枇杷(Eriobotryafragrans)[12]、柳葉芹(Czernaevialaevigataturcz.)[13]、燈盞花(Erigeronbreviscapus)[14]、蒜頭果(Malaniaoleifera)[15]、鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)[16]、大花君子蘭(Cliviaminiata)[17]、沙棗(Elaeagnusangustifolia)[18]和喜馬紅景天(Rhodiolahimalensis)[19]等的研究為植物的基因組學(xué)、種群分類及系統(tǒng)發(fā)育分析等提供了一定的理論依據(jù)。迄今為止,對長葉竹柏的相關(guān)研究主要是其化學(xué)成分、栽培引種及病蟲害等方面,關(guān)于長葉竹柏的完整葉綠體基因組研究尚未見報道。本研究利用高通量測序?qū)﹂L葉竹柏葉綠體進行基因測序、組裝和注釋,分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,旨在為鑒定該物種、豐富其葉綠體遺傳信息、進一步探索其個體水平的遺傳差異及遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長葉竹柏葉片來自貴州省植物園(26°37′20″N,106°43′29″E),將新鮮、無病蟲害樣本經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冷藏保存。

1.2 試驗方法

1.2.1長葉竹柏DNA提取及測序

采用CTAB法[20],從150 mg新鮮葉片樣本中提取全基因組DNA,送至惠通生物有限公司檢測,DNA檢測合格后將其打斷生成300～500 bp的小片段,在序列末端修復(fù)、3′端加A、加測序接頭,再經(jīng)過純化、瓊脂糖凝膠電泳,PCR擴增等一系列操作構(gòu)建好整個長葉竹柏的測序文庫,經(jīng)質(zhì)檢合格的文庫,使用Illumina高通量測序平臺Nova Seq6000進行測序。

1.2.2長葉竹柏葉綠體全基因組的組裝、注釋

測序數(shù)據(jù)采用SPAdes軟件進行基因組拼接[21],使用已公布的近緣葉綠體數(shù)據(jù)與蛋白編碼基因序列作為參考,利用Blastn與Exonerate軟件將結(jié)果與參考基因組進行比對,確定序列組裝。使用PRICE和MITObim軟件[22]對目標序列進行延伸、合并及拼接,盡量減少Scaffold數(shù)目。迭代拼接的結(jié)果使用Bowtie2軟件[23],將原始測序Reads進行回帖,挑出匹配成對的,利用軟件SPAdes進行重拼接,直至完成環(huán)狀基因組。然后利用PGA(Plastid Genome Annotator)軟件[24]進行基因組注釋,設(shè)置默認參數(shù),完成注釋。采用Chloroplot軟件[21]繪制長葉竹柏葉綠體基因組圖譜。

1.2.3長葉竹柏葉綠體密碼子偏好性和簡單重復(fù)序列分析

運用Codon W1.4.2軟件[25]統(tǒng)計分析長葉竹柏葉綠體基因組密碼子的偏好性RSCU(Relative Synonymous Codon Usage);利用MISA(MIcroSAtellite identification tool)提供的Perl程序[26]分析簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat,SSR)位點,程序在Windows命令窗口運行。其中,設(shè)置單核苷酸最低重復(fù)次數(shù)為10,二核苷酸為5,三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的均為4。

1.2.4長葉竹柏葉綠體基因組系統(tǒng)進化分析方法

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載與24個與長葉竹柏近緣物種的葉綠體全基因組序列,構(gòu)建最大似然(ML)樹。利用MAFFT7.037[27]和FFT-NS-2策略將24個不同物種完整葉綠體基因組中的共有蛋白編碼基因與長葉竹柏的基因進行比對。運行Model-finder var1.6來選擇最佳模型,并選擇TVM++F+I+G4模型[28]。使用RAxML var8.2.9構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自舉檢測值設(shè)置1 000[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 長葉竹柏葉綠體基因組基本特征

本研究獲得的長葉竹柏葉綠體基因組序列數(shù)據(jù)在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank中的登錄號為OL435123[30]。該葉綠體基因組呈雙螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1),大小為133 870 bp,因缺乏反向重復(fù)序列(IR)結(jié)構(gòu),所以它不屬于典型的四分體結(jié)構(gòu)。

圖1 長葉竹柏葉綠體基因組環(huán)形圖譜 Fig.1 Circularized map of the chloroplast genome of Nageia fleuryi

長葉竹柏葉綠體基因組編碼119個基因(表1),包括蛋白編碼基因(80個)、tRNA基因(35個)和rRNA基因(4個),其中,有11個基因(ndhF、ndhA、ndhB、rpl2、rpoC1、tRNA-Lys、tRNA-Gly、tRNA-Leu、tRNA-Val、tRNA-Ile、tRNA-Ala)含有1個內(nèi)含子,2個基因(clpP和ycf3)含有2個內(nèi)含子,rps12具有反式剪接。因基因功能各不相同,長葉竹柏葉綠體基因組可分為光合作用基因(43個)、自我復(fù)制基因(64個)、其他編碼蛋白基因(8個)和未知功能基因(4個),占比分別為36%,54%,7%和3%。

表1 長葉竹柏葉綠體基因組注釋信息Table 1 Gene annotation information of the chloroplast genome of Nageia fleuryi

2.2 長葉竹柏葉綠體偏好密碼子分析

真核生物基因組存在64個密碼子,通常編碼20種不同氨基酸和3個終止密碼子,其中,編碼同一氨基酸的不同密碼子被使用的頻率也不一樣,被頻繁使用的密碼子是“偏好密碼子”,而其他密碼子則是“非偏好密碼子”,這種現(xiàn)象被稱為“密碼子偏好性”。一般認為,密碼子偏好性的成因是不同密碼子對應(yīng)的tRNA在細胞里的豐度不一樣,tRNA豐度越高,對應(yīng)的密碼子的使用頻率也會越高。偏好密碼子分析結(jié)果(表2)表明,長葉竹柏葉綠體基因組共檢測出44 623個密碼子,編碼亮氨酸(Leu)的密碼子數(shù)量最多,為4 703個,占總密碼子數(shù)的10.54%;色氨酸(Trp)的密碼子數(shù)量最少,為629個,占總密碼子數(shù)的1.41%。長葉竹柏葉綠體測序結(jié)果顯示,密碼子具有明顯的偏好性,RSCU等于1的氨基酸有2個,分別為甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp),RSCU大于1的密碼子種類有28個,其中只有2個密碼子的堿基以G結(jié)尾,其余所有密碼子均以A/U結(jié)尾。

表2 長葉竹柏各氨基酸相對同義密碼子使用度Table 2 The RSCU for amino acid of Nageia fleuryi

2.3 長葉竹柏葉綠體簡單重復(fù)序列(SSR)分析

表3顯示,長葉竹柏葉綠體基因組共49個SSR(包含單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸)。其中,單核苷酸重復(fù)序列最多,共26個,主要有A(10個)、C(1個)、G(3個)和T(12個),共占53.06%;二核苷酸重復(fù)序列共22個,主要是AT(14個)、CA(1個)、TA(6個)和TC(1個)4種重復(fù)類型,占44.90%;三核苷酸最少,只有1個,為AAT,占2.04%。

圖2 25個物種葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic tree based on chloroplast genomic of 25 species

表3 長葉竹柏葉綠體簡單重復(fù)序列(SSR)信息Table 3 The SSR information for chloroplast of Nageia fleuryi

2.4 長葉竹柏系統(tǒng)進化樹分析

葉綠體基因組聚類分析對研究植物發(fā)育進化有重要意義。本研究選用日本粗榧(Cephalotaxusharringtonia)為外類群及24個羅漢松科物種,構(gòu)建最大似然(ML)樹。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示,不同科的植物分布不同的進化分支,長葉竹柏與同為羅漢松科的23個物種構(gòu)成一個單系類群。長葉竹柏與竹柏聚為一支,自展值為100,同為羅漢松科竹柏屬,說明長葉竹柏與竹柏親緣關(guān)系最為密切。此外,與其他屬相比,非洲羅漢松屬(Afrocarpus)和轉(zhuǎn)葉羅漢松屬(Retrophyllum)與竹柏屬(Nageia)親緣關(guān)系密切。

3 討 論

Ohyama等[32]和Shinozak等[33]首次測出地錢(MarchantiapolymorphaL.)和煙草(NicotianatabacumL.)葉綠體全基因組序列,為后續(xù)無數(shù)學(xué)者提供了新線索,解決了許多植物分類[34]、葉綠體基因數(shù)據(jù)庫完善[35]及物種鑒別[36]等方面的關(guān)鍵問題。如張慧等[37]研究獲得了完整的益母草屬葉綠體基因組,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明其與水蘇屬(Stachys)物種的親緣關(guān)系較近;Zhou等[38]通過對大黃屬(Rheum)的研究,開發(fā)了超級DNA條形碼。可見,研究植物葉綠體基因組信息對生物進化分析、分類及開發(fā)利用具有重要的意義。

物種進化過程中,往往會出現(xiàn)一些基因組重排和葉綠體基因組基因丟失的少量事件。本研究發(fā)現(xiàn),長葉竹柏葉綠體基因組在基因種類和結(jié)構(gòu)上與大多數(shù)裸子植物(如羅漢松屬[39]、松科[40]、柏科[41]等)的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)類似,都缺失IR區(qū);Chen等[42]研究水杉葉綠體全基因組發(fā)現(xiàn),由于水杉葉綠體基因組的一個大IR拷貝丟失,并且推測其IRA已丟失,但IRB已保留在水杉葉綠體基因組中。魯華等[43]對華山松葉綠體基因組分析結(jié)果表明,南系華山松葉綠體基因組也缺乏反向重復(fù)區(qū)。此外,還有其他少數(shù)被子植物(如牻牛兒苗屬植物[44],蒺藜苜蓿、鷹嘴豆、三葉草等豆科植物[45])也因丟失了一個反向重復(fù)(IR)區(qū)而不具有四分體結(jié)構(gòu),無法區(qū)分其大單拷貝區(qū)和小單拷貝區(qū)。一般情況下認為,反向重復(fù)序列大可起到穩(wěn)定葉綠體基因組的作用[46],使之能應(yīng)對大型的結(jié)構(gòu)重排。因此,大反向重復(fù)序列損失的植物葉綠體基因組會發(fā)生一系列的多變問題,從而導(dǎo)致基因缺失或基因組重排的現(xiàn)象。另外,長葉竹柏及其他缺少IR區(qū)物種中的IRA和IRB是否同時缺失或缺失其中之一以及其中的結(jié)構(gòu)變化引起的生物特異性等有待進一步研究探討。

植物葉綠體DNA分子一般長120～170 kb[8],本研究中長葉竹柏葉綠體基因組大小為133 870 bp,屬于一般長度范圍內(nèi)。葉綠體基因組通常含有100～120個編碼基因,且大多蛋白編碼基因占比較大,能達80%以上,tRNA、rRNA占比較少。長葉竹柏葉綠體共編碼119個基因,其中蛋白編碼基因有80個,約占總數(shù)的67%,相較于其他物種,長葉竹柏葉綠體的蛋白編碼基因較少。本研究根據(jù)基因的功能將注釋基因分為四大類,分別是光合作用、自我復(fù)制、其他編碼蛋白及未知功能,這與黃桃[47]、薄殼山核桃[48]、扁果草[49]等葉綠體基因組功能分類結(jié)果相似,可再次證實葉綠體大部分基因主要起到光合作用及基因復(fù)制等功能。因此,可通過進一步探究葉綠體基因組表達調(diào)控機理,分析葉綠體光合作用及生物合成的相關(guān)具體機制。

密碼子偏好性反映基因乃至物種的起源和進化方式,且對基因功能及其編碼蛋白的表達有一定影響。通過密碼子偏好性分析研究發(fā)現(xiàn),長葉竹柏葉綠體基因組共檢測出44 623個密碼子,RSCU等于1的氨基酸有2個(甲硫氨酸和色氨酸),RSCU大于1的密碼子共有28個,其中只有兩個密碼子的堿基以G結(jié)尾,其余所有密碼子均以A/U結(jié)尾,說明長葉竹柏葉綠體基因具有明顯的AU偏好性。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相似,張雨等[19]研究紅景天葉綠體基因組密碼子偏好性也發(fā)現(xiàn)其具有明顯的AU偏向性。此外,在劍麻[50]、翠雀[51]、橄欖[52]、秋茄[53]等葉綠體基因組研究中發(fā)現(xiàn),其密碼子偏好是A或T。說明不同物種的密碼子偏好性存在差異,而這通常是自然選擇和突變等因素影響所致。還有研究表明,不同物種密碼子偏好性所受的主導(dǎo)因素也各不相同,如刺榆[54]受自然選擇的影響;涼粉草[55]則同時受自然選擇和突變壓力的共同影響;紫菜[56]除自然選擇和突變壓力外,可能還受堿基組成等因素的影響。本研究沒有具體探討長葉竹柏葉綠體密碼子偏好性的影響因素,下一步可對其密碼子使用規(guī)律及其影響因素進行深入研究。

簡單重復(fù)序列(SSR)是指由1～6個核苷酸組成的基本單元,經(jīng)多次串聯(lián)形成重復(fù)的一段DNA序列[57],有幾十至幾百條堿基序列,它們分布在葉綠體基因組的不同部位,影響著細胞的多項生命活動,而位于非編碼區(qū)的SSR比位于編碼區(qū)的變化更大[58]。與核基因組相比,葉綠體基因組較小,SSR數(shù)量相對較少,可用于物種鑒定、遺傳多樣性分析和分子輔助育種等[59]?；陂L葉竹柏葉綠體基因組SSR分析,發(fā)現(xiàn)其大多數(shù)單核苷酸由A/T組成,大多數(shù)二核苷酸由AT/TA組成,而其余SSR的A/T含量較高,該研究結(jié)果與SSRs通常由短聚腺嘌呤(poly A)或聚胸腺嘧啶(poly T)重復(fù)序列組成的論點一致[60]。葉綠體基因組SSR中較高的A/T含量也有助于堿基組成的偏差,從而使A/T在長葉竹柏葉綠體基因組中富集。

Zhang等[61]研究指出,葉綠體基因組長度是普通條形碼序列的幾百倍,有足夠的變異位點,完整的葉綠體基因組可作為超級DNA條形碼,應(yīng)用于物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系判定[62]。為了研究羅漢松科中長葉竹柏的系統(tǒng)發(fā)育位置,本研究選擇了24個物種,這些物種包括了竹柏科、羅漢松科和紅豆杉科,以紅豆杉科的日本粗榧列為外類群,將這些物種與長葉竹柏葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,長葉竹柏與竹柏的同源性最高,親緣關(guān)系最近,該結(jié)果確定了長葉竹柏的系統(tǒng)位置及其發(fā)育關(guān)系。此外,還可對長葉竹柏葉綠體基因組進行其他分析和應(yīng)用,如SNP位點、數(shù)字PCR等分析技術(shù),從而進一步精準鑒別竹柏科植物。

4 結(jié) 論

葉綠體基因組注釋表明,長葉竹柏葉綠體基因組全長為133 870 bp,缺乏反向重復(fù)區(qū),總GC含量為37%,共119個基因,包括80個蛋白編碼基因、35個tRNA基因和4個rRNA基因,其絕大多數(shù)的基因與光合作用及基因轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)。密碼子偏好性分析表明,亮氨酸(Leu)使用頻率最高(10.54%),色氨酸(Trp)使用頻率最低(1.41%),密碼子偏向使用A和U兩種堿基。共檢測到49個SSR位點,以單堿基(53.06%)重復(fù)為主。此外,系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,長葉竹柏與竹柏親緣關(guān)系最密切。該研究為進一步研究羅漢松科分子標記開發(fā)、種間鑒定以及該物種的演化過程提供科學(xué)依據(jù)。