汪 雨, 高鑫禎, 邵士成, 王曉靜, 羅 艷, 馬長(zhǎng)樂

(1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院, 昆明 650224; 2.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園, 云南 勐臘 666303;3.國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心, 昆明 650224; 4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

鶴頂蘭屬(Phaius)植物為地生蘭,屬于蘭科吻蘭族,全球約有40種,分布于非洲熱帶地區(qū)、亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)至大洋洲[1-2]。鶴頂蘭屬植物植株高大,花大且艷麗多姿,很多種類具有優(yōu)良的園藝觀賞特征。該屬中應(yīng)用最為廣泛的物種是鶴頂蘭[Phaiustancarvilleae(L'Hér.) Blume],花朵靚麗,優(yōu)雅欣然,古人稱其為“鶴蘭”,具有極高的觀賞價(jià)值,已應(yīng)用在鮮切花、園林植物配置、園藝美化及園藝品種育種等領(lǐng)域[3]。鶴頂蘭的假鱗莖粗壯,內(nèi)用具有祛痰止咳、活血止血的作用,外用可治療跌打腫痛、外傷出血等[4]。由于生境破壞和人為過度采挖,加之其自然結(jié)實(shí)率低,自然更新能力較弱,致使其野生資源已瀕臨枯竭。探索鶴頂蘭保育的技術(shù)方法已成為加強(qiáng)鶴頂蘭資源保護(hù)和可持續(xù)利用中亟待解決的重要問題。

自然環(huán)境中,蘭科植物種子必須依賴共生真菌提供營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行萌發(fā)[5-8]。近年來,多種蘭科物種都篩選到了可促進(jìn)種子萌發(fā)的共生真菌,例如地生蘭類的龍頭蘭[Pecteilissusannae(L.) Raf.][9]、手參[Gymnadeniaconopsea(L.) R. Br.][10],附生蘭類的硬葉蘭(CymbidiummanniiRchb. f.)[11]、鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura &Migo)[12]等。徐錦堂等[13]從腐生蘭科植物天麻(GastrodiaelataBlume)的原球莖中分離得到一株促進(jìn)天麻種子萌發(fā)的共生真菌,已廣泛應(yīng)用于天麻的人工繁殖和生產(chǎn)栽培中。Shao等[14-15]建立了原地共生萌發(fā)的野外回歸技術(shù),采用共生真菌與種子混合進(jìn)行播種,成功實(shí)現(xiàn)了齒瓣石斛(DendrobiumdevonianumPaxton)的野外回歸。這些研究均表明,蘭科種子的真菌共生萌發(fā)是進(jìn)行蘭科資源保護(hù)和可持續(xù)利用最為有效的方法。

目前,鶴頂蘭的栽培繁殖方式主要采用分株和無菌播種。分株繁殖通常在休眠期結(jié)合換盆進(jìn)行,分株后的新株需帶有兩個(gè)以上的假鱗莖和芽,這種分株方式當(dāng)年即可開花[16]。但分株繁殖的繁殖系數(shù)低,不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。現(xiàn)階段在生產(chǎn)實(shí)踐中已實(shí)現(xiàn)了基于種子無菌萌發(fā)的組織培養(yǎng)技術(shù),可以進(jìn)行鶴頂蘭種苗的規(guī)?；a(chǎn)。如蘭芹英等[17]對(duì)鶴頂蘭快繁技術(shù)的研究中篩選得到萌發(fā)率可達(dá)100%的培養(yǎng)基。姚紹嫦等[18]主要對(duì)組培過程中原球莖的增殖進(jìn)行了研究,得到一種培養(yǎng)基配方,在培養(yǎng)30 d時(shí)增殖倍數(shù)可達(dá)6.67倍,培養(yǎng)60 d后超過30倍。但組織培養(yǎng)方式耗費(fèi)巨大的人力物力,不能完全解決生產(chǎn)和保護(hù)實(shí)踐的應(yīng)用,同時(shí)容易過度縱容幼苗獲得營(yíng)養(yǎng)和理想的生長(zhǎng)條件[19],使幼苗在進(jìn)行馴化時(shí),可能面臨氣候變化和病蟲害等在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中不存在的問題。

在中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園(以下簡(jiǎn)稱版納園)保育的鶴頂蘭的栽培養(yǎng)護(hù)過程中發(fā)現(xiàn),其種子可以在栽培基質(zhì)中自然萌發(fā),深圳仙湖植物園的研究人員也開發(fā)了利用腐熟處理的栽培基質(zhì)促進(jìn)鶴頂蘭種子萌發(fā)的技術(shù)[20],這些發(fā)現(xiàn)表明,促進(jìn)鶴頂蘭種子萌發(fā)的真菌可能廣泛存在,但目前仍不清楚是何種真菌可促進(jìn)鶴頂蘭的種子萌發(fā)。本研究采用蘭科種子原地共生萌發(fā)的方法,從鶴頂蘭栽培基質(zhì)中采集自然萌發(fā)的原球莖,從原球莖中分離菌株,篩選促進(jìn)鶴頂蘭種子萌發(fā)和原球莖發(fā)育的真菌,以期為鶴頂蘭的生物技術(shù)育種、種質(zhì)資源保存、快速繁殖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)和研究材料

鶴頂蘭(圖1A)為地生蘭,廣泛分布于我國(guó)臺(tái)灣、福建、香港、海南、廣西、云南和西藏東南部,生長(zhǎng)于亞熱帶和熱帶常綠闊葉林的林下潮濕處。鶴頂蘭在版納園已成功實(shí)現(xiàn)遷地保護(hù)。本研究的研究地點(diǎn)位于版納園的保育苗圃(21°54′N,101°46′E)。2021年4月,對(duì)栽培于保育苗圃的鶴頂蘭進(jìn)行人工異交授粉,于2021年9月采集果莢變軟但尚未完全開裂的成熟蒴果(圖1B)。

注:A為花序;B為蒴果;C為TTC染色的種子;D為原地萌發(fā)誘導(dǎo)形成的原球莖。圖1 鶴頂蘭Fig.1 Phaius tancarvilleae

1.2 種子收集保存及原地共生萌發(fā)

用脫脂棉沾取75%的乙醇清洗果莢表面,再用無菌水沖洗3次。用無菌刀將果實(shí)剖開,輕拍果皮,將種子抖落。短期保存:用無菌的濾紙包好種子,在22 ℃條件下,用無水氯化鈣干燥3 d后裝入密閉離心管中,在4 ℃的條件下儲(chǔ)存。長(zhǎng)期保存:將種子干燥3 d后存于滅菌的密閉離心管中,置于20 ℃條件下儲(chǔ)存。

采用TTC(氯化三苯基四氮唑)法進(jìn)行鶴頂蘭種子活力的檢測(cè),使用磷酸緩沖液作為溶劑配制濃度為1%的TTC作為染液。將種子置入1 mL離心管中,加入純水浸泡24 h后再加入預(yù)先配置的TCC染液,放置于37 ℃恒溫箱在黑暗條件下染色24 h后,在體式顯微鏡(Nikon SMZ800N)下隨機(jī)觀察種子的染色情況,統(tǒng)計(jì)視野中的種子總數(shù)和著色種胚的種子數(shù)。

2021年10月將成熟的鶴頂蘭種子直接撒播在成年鶴頂蘭植株(共計(jì)5盆)附近的土壤基質(zhì)中。每隔一個(gè)月對(duì)土樣進(jìn)行監(jiān)測(cè)觀察。

1.3 原球莖內(nèi)共生真菌的分離

將馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA,馬鈴薯200 g/L+葡萄糖20 g/L+瓊脂15 g/L)配制好后在121 ℃高壓滅菌20 min,分裝于無菌培養(yǎng)皿中。將在苗圃中收獲的原地萌發(fā)的鶴頂蘭原球莖在自來水下清洗,用軟毛筆去除原球莖表面的土壤及雜質(zhì)。在超凈工作臺(tái)上,將洗凈的原球莖浸入0.1%次氯酸鈉溶液中消毒10 min,用無菌水沖洗3～4次,用無菌刀將原球莖切成薄片,切口面貼于PDA培養(yǎng)基上,用封口膜將培養(yǎng)皿封好后放入霉菌培養(yǎng)箱內(nèi),(25±2)℃避光培養(yǎng)。每隔3 d觀察一次。

待原球莖切口附近長(zhǎng)出菌絲時(shí),在超凈工作臺(tái)用無菌接種針在長(zhǎng)出真菌菌落的原球莖切片邊緣處挑取菌絲,接種到新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng),純化后的菌株以PDA試管斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌株的分子鑒定及系統(tǒng)位置分析

將保存在PDA培養(yǎng)基中的真菌菌株,在無菌條件下接入盛有液體PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中,置于搖床(SPH-310A,上海百典儀器設(shè)備有限責(zé)任公司,中國(guó))(25±2)℃下震蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間視真菌的生長(zhǎng)速度而定,一般為3～6 d。抽濾約100 mg的菌絲用于真菌基因組DNA的提取,提取方法按照DNeasy plant mini kit(Qiagen69104)說明書上的方法步驟進(jìn)行。參照常用的真菌分子鑒定方法,使用正向引物ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3′)和反向引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′)對(duì)核糖體DNA上大約650 bp的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)[21]。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序。擴(kuò)增所得rDNA-ITS序列拼接后使用Geneious prime2022.0.2軟件進(jìn)行手工校對(duì)。測(cè)序序列使用GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì),當(dāng)rDNA-ITS序列相似性超過95%時(shí),屬于同一個(gè)屬,當(dāng)相似性超過97%時(shí),屬于同一種[22]。

為了確定從鶴頂蘭原球莖中分離得到的真菌的系統(tǒng)發(fā)育位置,本研究將分離得到的真菌的ITS序列與從NCBI中獲得的近緣種序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。以Armillaria sinapina(FJ495039)為外類群,通過PhyloSuite v1.2.2平臺(tái)查找最適模型后使用IQ-TREE構(gòu)建Maximum Likelihood(ML)系統(tǒng)發(fā)育樹[23],通過FigTree v1.4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的編輯。

1.5 真菌對(duì)種子萌發(fā)的有效性檢測(cè)

將保存的供試菌株(編號(hào)為HDL-2)在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化,在(25±2)℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10 d,待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。采用燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OMA,燕麥5 g/L+瓊脂10 g/L,調(diào)節(jié)pH值為5.6～5.8)作為種子和真菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基。將保存的鶴頂蘭種子經(jīng)1% NaClO溶液消毒12 min,于無菌水中漂洗3～5次,然后浸于0.1%的瓊脂溶液中制成無菌種子懸浮液,采用移液槍吸取1 mL(約含580粒種子)均勻播種在培養(yǎng)基表面。用移液槍槍頭將在PDA培養(yǎng)基上的菌絲打孔制成菌餅,取3個(gè)菌餅成三點(diǎn)狀放置于距培養(yǎng)皿邊緣約1 cm處。另取相同大小的未接菌的空白PDA培養(yǎng)基打孔制成餅狀放置于OMA培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照。另外,將鶴頂蘭種子放置在改良的1/2MS培養(yǎng)基(1/2MS+10%椰汁+蔗糖30 g/L+瓊脂5.5 g/L+活性炭1.0 g/L,調(diào)節(jié)pH值為5.6～5.8)上進(jìn)行播種作為無菌萌發(fā)的對(duì)照培養(yǎng)。播種方法與前述一致。每組播種實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)。將播種后的培養(yǎng)皿放置于組培間進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度為(25±2)℃光照強(qiáng)度為1 800～2 500 lx,光照周期為光照12 h/黑暗12 h。每周監(jiān)測(cè)種子的萌發(fā)情況,記錄和觀測(cè)種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育的情況。按照表1劃分的種子萌發(fā)階段的標(biāo)準(zhǔn),在體視顯微鏡下統(tǒng)計(jì)處于各萌發(fā)階段的種子、原球莖、幼苗數(shù)量,計(jì)算種子萌發(fā)率(G)及各階段的種子、原球莖或幼苗的比率(C)。即G=g/t;C=c/t,其中,g為培養(yǎng)皿中已萌發(fā)的種子數(shù),c為培養(yǎng)皿中各階段的種子、原球莖或幼苗的數(shù),t為播種的種子總數(shù)。利用SPSS23.0軟件,對(duì)不同處理的種子萌發(fā)率及各階段的萌發(fā)種子、原球莖或幼苗比率進(jìn)行顯著性差異分析。

表1 鶴頂蘭種子萌發(fā)的不同發(fā)育階段Table 1 Developmental stages of seed germination of Phaius tancarvilleae

1.6 原球莖被真菌侵染情況的觀察

為檢測(cè)鶴頂蘭種子與共培養(yǎng)的真菌的共生關(guān)系是否成功建立,培養(yǎng)至60 d時(shí),用臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察鶴頂蘭種子及原球莖被真菌侵染的情況。將不同發(fā)育階段的鶴頂蘭種子/原球莖用10% KOH在90 ℃下透明處理3 h,用0.3%過氧化氫洗滌3次,再用30%過氧化氫進(jìn)行漂白處理40～60 min(視材料大小決定漂白時(shí)間),最后在0.05%臺(tái)盼藍(lán)醋酸甘油溶液中染色10 min,經(jīng)醋酸甘油溶液脫色后在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子活力及種子原地共生萌發(fā)

鶴頂蘭種子經(jīng)TTC染色后觀察發(fā)現(xiàn),絕大部分種子種胚發(fā)育良好,絕大部分能被染為淺橙色,極個(gè)別種子未被染色,少數(shù)種子染色較深(圖1C)。以種子被染色計(jì)為具有活力。結(jié)果表明,本研究所用種子95.62%都具有活力。

將鶴頂蘭種子直接撒播在成年植株附近,至第6個(gè)月,土壤中開始有肉眼可見的原球莖產(chǎn)生,大小為(1～1.5)mm×(2～4)mm,黃白色,不規(guī)則的長(zhǎng)圓錐形(圖1D)。

2.2 原球莖真菌的分離與鑒定

采用組織塊分離法從鶴頂蘭原球莖中共計(jì)分得5株真菌菌株。形態(tài)學(xué)和ITS分子鑒定的結(jié)果(表2)顯示,5株真菌菌株分別為鐮刀菌屬(Fusarium)2種Fusariumsolani(HDL-1,圖2A)和Fusariumoxysporum(HDL-3,圖2B)、球殼菌屬1種(Plectosphaerellacucumerina,HDL-4,圖2C)、裸囊菌屬1種(Gymnoascusdankaliensis,HDL-5,圖2D)和膠膜菌屬1種[24](Tulasnellasp.,HDL-2,圖2E)。將分離獲得的真菌與鶴頂蘭種子進(jìn)行共培養(yǎng),僅HDL-2可以促進(jìn)鶴頂蘭種子萌發(fā),而其他真菌均未能促進(jìn)種子萌發(fā)。菌株HDL-2在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈淡黃色至透明狀(圖2E),菌絲呈圓柱狀,具隔膜和分枝,有厚垣孢子產(chǎn)生(圖2F),生長(zhǎng)速度約為2 mm/d。

注:A～E分別為菌株HDL-1、HDL-3、HDL-4、HDL-5、HDL-2菌落形態(tài),F為菌株HDL-2菌絲結(jié)構(gòu)。圖2 鶴頂蘭原球莖中分離得到的菌株Fig.2 Fungi strains isolated from protocorms of Phaius tancarvilleae

表2 鶴頂蘭原球莖中分離得到的真菌菌株的分子鑒定結(jié)果Table 2 Molecular identification of fungal strains isolated from protocorms of Phaius tancarvilleae

根據(jù)該菌株的ITS序列與GenBank上的比對(duì)結(jié)果,下載了相似性較高的蘭科菌根真菌的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖3)顯示,從鶴頂蘭原球莖中分離所得的真菌菌株HDL-2與Uncul tured Tulasnellaceae(JX545212)聚為一支,支持率為99%,與其他膠膜菌屬菌株聚成一支較大的分支,支持率為95%,表明該菌株屬于膠膜菌屬。

注:節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示支持率,以Armillaria sinapina為外類群。圖3 基于核糖體ITS序列的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Maximum-likelihood tree constructed based on rDNA-ITS sequences

2.3 鶴頂蘭種子共生萌發(fā)的發(fā)育過程

將HDL-2菌株與鶴頂蘭種子在OMA培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)試驗(yàn),觀察發(fā)現(xiàn),HDL-2菌株可以有效促進(jìn)鶴頂蘭種子萌發(fā)。不接菌的對(duì)照組種子未見萌發(fā)跡象。種子接菌共培養(yǎng)20 d之前無明顯變化,保持未萌發(fā)狀態(tài)(圖4A);共培養(yǎng)20～30 d時(shí),可以明顯觀察到種胚吸水膨脹,種皮仍然包裹在種胚周圍,達(dá)到萌發(fā)的第1階段(圖4B);30～40 d之后,種胚繼續(xù)膨脹和增大,種皮在一側(cè)破裂,頂端逐漸轉(zhuǎn)綠,形成原球莖,到達(dá)發(fā)育的第2階段(圖4C);40～60 d后,原球莖繼續(xù)長(zhǎng)大,明顯呈現(xiàn)極性分化,發(fā)育形成頂部寬圓基部細(xì)尖的錐形原球莖,同時(shí)在原球莖除頂部外的位置生出細(xì)長(zhǎng)絨毛狀的假根(圖4D);80～100 d后,原球莖頂部出現(xiàn)突起(圖4E),此時(shí)處于萌發(fā)的第3階段;100～120 d后,頂端的突起繼續(xù)伸長(zhǎng)發(fā)育,形成葉芽,逐步發(fā)育形成第一片幼葉(圖4F),隨著頂端繼續(xù)生長(zhǎng),形成了莖及多數(shù)葉(圖4G),此時(shí)均處于萌發(fā)的第4階段;150～180 d后,從莖基部形成幼根(圖4H),到達(dá)萌發(fā)的第5階段,形成幼苗(圖4I)。

注:A為萌發(fā)第0階段,未萌發(fā)的種子;B為萌發(fā)第1階段,種胚吸水膨脹;C為萌發(fā)第2階段,種胚變綠,一側(cè)突破種皮; D為萌發(fā)第3階段,錐形原球莖;E為萌發(fā)第3階段,假根(Rh)和突起(P)產(chǎn)生;F為萌發(fā)第4階段,形成葉芽; G為萌發(fā)第4階段,莖及多數(shù)葉形成;H為萌發(fā)第5階段,幼根形成;I為幼苗形成。圖4 鶴頂蘭種子共生萌發(fā)過程 Fig.4 Symbiotic seed germination process of Phaius tancarvilleae

2.4 真菌侵染情況的觀察

將與HDL-2共培養(yǎng)的不同發(fā)育階段的種子或原球莖采用臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)未萌發(fā)的種子真菌從種孔進(jìn)入,聚集在胚柄端,但未侵入種胚(圖5A),說明此時(shí)共生關(guān)系尚未建成,而萌發(fā)的不同發(fā)育階段的種子或原球莖均被臺(tái)盼藍(lán)染色。處于吸水膨脹期間的種子可見種胚內(nèi)基部細(xì)胞被染為藍(lán)色,說明鶴頂蘭種子在萌發(fā)的第1階段,真菌就開始侵入定殖(圖5B)。種胚突破種皮時(shí)(第2階段),原球莖細(xì)胞內(nèi)可見大量被染為藍(lán)色的菌絲團(tuán)(圖5C)。隨著原球莖體積不斷膨大、長(zhǎng)出根毛(第3階段),原球莖細(xì)胞中仍存在大量菌絲團(tuán)(圖5D)。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明,HDL-2菌株的菌絲在種子萌發(fā)階段可成功定植在種子及原球莖細(xì)胞內(nèi),表明共生關(guān)系已成功建立。

注:A為種子未萌發(fā),真菌聚集在胚柄端,尚未侵染胚;B為萌發(fā)第1階段,膨大的胚中已有真菌侵染; C為萌發(fā)第2階段,原球莖被菌絲團(tuán)侵染;D為萌發(fā)第3階段,錐形原球莖中下部被菌絲團(tuán)侵染。圖5 臺(tái)盼藍(lán)染色顯示鶴頂蘭種子不同萌發(fā)階段真菌侵染情況 Fig.5 Trypan Blue Staining showed fungal infection in different stages of seed germination of Phaius tancarvilleae

2.5 HDL-2促進(jìn)鶴頂蘭種子萌發(fā)的效率

本研究的3組種子不同處理間的種子萌發(fā)效率存在顯著差異(表3,圖6)。不接菌的陰性對(duì)照組沒有觀察到種胚明顯膨脹,所有種子均在第0階段(圖7C)。培養(yǎng)30 d時(shí),種子在接種HDL-2的OMA培養(yǎng)基上的萌發(fā)率為22.09%,19.51%處于第1階段,有2.59%進(jìn)入第2階段,種子在不含真菌的改良1/2MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率為17.18%,均處于第1階段,兩者之間差異不顯著(圖7A)。60 d時(shí),共生培養(yǎng)和無菌培養(yǎng)的萌發(fā)率差異顯著,接菌的OMA培養(yǎng)基的種子總萌發(fā)率為38.56%,并且有13.64%的種子發(fā)育到第3階段,少數(shù)種子進(jìn)入到第4階段,1/2MS培養(yǎng)基中種子的總萌發(fā)率為29.56%,種子的發(fā)育僅處于第1、第2階段。80 d時(shí),接菌的OMA培養(yǎng)基上種子萌發(fā)率達(dá)到(58.33±3.48)%,有25.96%的種子處于第3階段,改良的1/2MS培養(yǎng)基中種子的總萌發(fā)率為40.90%,到達(dá)第3階段的種子僅為1.83%,兩者之間差異極顯著。110 d時(shí),接菌培養(yǎng)的OMA培養(yǎng)基的種子總萌發(fā)率為86.69%,已有5.57%的原球莖發(fā)育成幼苗,到達(dá)第4階段(圖7A),此時(shí)改良的1/2 MS培養(yǎng)基上種子的總萌發(fā)率為52.04%,僅有(0.55±0.34)%的種子發(fā)育到第4階段,大部分種子停留在第2階段或第3階段(圖7B),共生萌發(fā)和無菌萌發(fā)存在極顯著差異。

注:A為與菌株HDL-2共培養(yǎng)的OMA培養(yǎng)基;B為1/2MS培養(yǎng)基;C為無真菌參與的OMA培養(yǎng)基。圖7 培養(yǎng)110 d時(shí),不同處理下的鶴頂蘭原球莖發(fā)育Fig.7 At culture of 110 days, protocorm development of Phaius tancarvilleae under different treatments

表3 不同處理下鶴頂蘭種子的萌發(fā)率、萌發(fā)各階段的比率Table 3 The seed germination rate and the ratio of germination stages of Phaius tancarvilleae under different treatments

3 討 論

在自然條件下,蘭科植物的種子必須與真菌產(chǎn)生共生關(guān)系,必須依賴共生真菌提供營(yíng)養(yǎng)才能萌發(fā)[5-8]。在沒有共生真菌協(xié)助的情況下,蘭科種子基本無法完成萌發(fā)過程,多數(shù)只能吸水膨脹至種皮破裂階段[25]。篩選可促進(jìn)蘭科種子萌發(fā)的有效共生真菌,在蘭花資源的保護(hù)和可持續(xù)利用上具有重要的意義。鶴頂蘭是廣泛應(yīng)用的園藝觀賞花卉,規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)并不成熟。Cheng等[26]從臺(tái)灣本土蘭科植物中分離出4種絲核菌屬(Rhizoctonia)真菌,分別接種于鶴頂蘭的組培幼苗,發(fā)現(xiàn)菌株R15可提高幼苗的成活率、增加植物高度和葉片長(zhǎng)度,菌株R19可促進(jìn)鶴頂蘭開花,菌株R02則可顯著增強(qiáng)光合作用的速率。這些研究均是基于鶴頂蘭的幼苗展開的,而關(guān)于鶴頂蘭種子的真菌共生萌發(fā)目前未見報(bào)道。本研究通過原地共生萌發(fā)技術(shù),首次從鶴頂蘭的原球莖中分離獲得的真菌HDL-2,可成功實(shí)現(xiàn)鶴頂蘭種子的共生萌發(fā),該真菌屬于膠膜菌科膠膜菌屬真菌,屬于典型的蘭科菌根真菌。目前已報(bào)道的對(duì)蘭科植物種子有促萌發(fā)作用的真菌主要集中在絲核類真菌,包括蠟殼菌屬(Sebacina)、膠膜菌屬和角擔(dān)菌屬(Ceratobasidium)[27-28]。膠膜菌屬真菌是最常見的蘭科植物菌根真菌[29-31],可以有效促進(jìn)蘭科植物種子萌發(fā)。如Youm等[32]從蝦脊蘭(CalanthediscolorLindl.)的根中分離出了來自膠膜菌屬的促萌發(fā)真菌;Zi等[33]從兜唇石斛[Dendrobiumaphyllum(Roxb.) C. E. Fishc.]原球莖中分離出有效促進(jìn)種子萌發(fā)的膠膜菌屬真菌(Tulasnellasp.)FDaI7;Shao等[34]從鼓槌石斛(DendrobiumchrysotoxumLindl.)原球莖中分離出的膠膜菌可以促進(jìn)鼓槌石斛種子萌發(fā)。除此之外,小菇屬(Mycena)、瘤菌根菌屬(Epulorhiza)、鬼傘屬(Coprinellus)等其他屬真菌也有報(bào)道。如徐錦堂和郭順星[13]從天麻的原球莖中分離出了促萌發(fā)真菌紫萁小菇(Mycenaosmundicola);孫曉穎等[35]從帶葉兜蘭的原球莖及小幼苗中分離出的共生真菌屬于瘤菌根菌屬;Gao等[36]從杜鵑蘭[Cremastraappendiculata(D. Don) Makino]根中分離出的共生真菌屬于鬼傘屬。

大量研究表明,從成年植株根中分離獲得的真菌種類多樣,但往往未必能夠促進(jìn)種子萌發(fā)或形成幼苗?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為最有效的手段是采用原地誘捕法獲得蘭科植物的共生萌發(fā)真菌[11,27]。Zi等[33]、孫曉穎等[35]、孟元元[37]均使用了該方法,在不同石斛屬蘭花的原生地埋下種子,當(dāng)種子萌發(fā)形成原球莖后,從原球莖中成功分離獲得促進(jìn)種子萌發(fā)的有效真菌。本研究也采用了原地共生萌發(fā)的技術(shù),但誘導(dǎo)鶴頂蘭種子萌發(fā)的環(huán)境基質(zhì)并非從野外環(huán)境獲得,而是使用了人工栽培的基質(zhì)。從鶴頂蘭的人工栽培基質(zhì)中獲得了原球莖,從中分離到了膠膜菌屬真菌能促進(jìn)鶴頂蘭種子萌發(fā),表明該真菌可能在自然環(huán)境中廣泛存在。而該菌株是否也存在于鶴頂蘭的野生環(huán)境中,自然環(huán)境中的鶴頂蘭種子萌發(fā)機(jī)制還需進(jìn)一步的研究探明。

共生萌發(fā)通常具有較高的萌發(fā)效率[38]。陳婭婭等[39]使用了21株菌根真菌對(duì)鵝毛玉鳳花[Habenariadentata(Sw.) Schltr.]種子進(jìn)行了共生萌發(fā)研究,發(fā)現(xiàn)其中有8株可以顯著提高種子的萌發(fā)效率。對(duì)幽靈蘭[Dendrophylaxlindenii(Lindl.) Benth. ex Rolfe]種子萌發(fā)的研究中,Dlin-394菌株(角擔(dān)菌屬)可以顯著提高種子萌發(fā)率,在真菌浸染9周后種子萌發(fā)率最高,為84%,而使用改良的1/4MS培養(yǎng)基進(jìn)行無菌萌發(fā)的種子萌發(fā)率僅為40%左右,且共生萌發(fā)的種子形成幼苗的速率也較無菌萌發(fā)的高[40]。Zhou和Gao[41]的研究發(fā)現(xiàn),在相同培養(yǎng)時(shí)間下,鳳蝶蘭[Papilionantheteres(Roxb.) Schltr.]和Epa-01(瘤菌根菌屬)共培養(yǎng)時(shí)的種子萌發(fā)率要顯著高于在AGS培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌培養(yǎng)的種子萌發(fā)率,且所處的萌發(fā)階段也更高,分別在15,30,45 d時(shí),共生培養(yǎng)的原球莖的鮮重均極顯著高于無菌培養(yǎng)。Gao等[36]研究發(fā)現(xiàn),杜鵑蘭在與DJF-10(鬼傘屬)菌株共生培養(yǎng)6周后的種子萌發(fā)率超過80%,相比之下,在無菌的MS培養(yǎng)基上種子萌發(fā)率僅9.68%,遠(yuǎn)低于共生培養(yǎng),且共生萌發(fā)條件下13周后就能形成幼苗,但在MS培養(yǎng)基上無菌萌發(fā)的原球莖需要5個(gè)多月才能發(fā)育成幼苗。與前人的研究相似,本研究中鶴頂蘭種子與HDL-2菌株(膠膜菌屬)共生萌發(fā)的效率要顯著高于無菌萌發(fā)。鶴頂蘭種子在無菌萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)110 d后萌發(fā)率為(52.04±3.19)%,大部分種子處于0,1,2階段;在接種了HDL-2菌株的OMA培養(yǎng)基上,110 d時(shí)萌發(fā)率可達(dá)(86.69±3.19)%,大部分種子處于第3階段。在不加激素和其他物質(zhì)的情況下,鶴頂蘭種子在MS、Kyato、KC三種基本培養(yǎng)基中的萌發(fā)率為20%～30%[42]。由此可見,HDL-2真菌對(duì)鶴頂蘭種子萌發(fā)的促進(jìn)作用明顯,且效率顯著高于無菌萌發(fā)培養(yǎng)基。本研究建立的共生萌發(fā)手段為鶴頂蘭作為園藝資源在生產(chǎn)實(shí)踐中的開發(fā)和利用提供了新的技術(shù)和方法。

蘭科植物種子的共生萌發(fā)機(jī)制極其復(fù)雜,相關(guān)的研究具有挑戰(zhàn)性。缺乏高效的促萌發(fā)真菌限制了對(duì)蘭科植物資源的保護(hù)和利用。本研究通過原地萌發(fā)技術(shù)獲得的一種膠膜菌屬真菌對(duì)鶴頂蘭的種子萌發(fā)和幼苗形成有促進(jìn)作用,可用于鶴頂蘭的人工繁育生產(chǎn)和野外回歸的保護(hù)實(shí)踐,并可為真菌與蘭科植物的互作關(guān)系研究提供科學(xué)資料。