劉 洋, 楊仁杰, 劉海學(xué)

(天津農(nóng)學(xué)院, 天津 300392)

我國是糧食生產(chǎn)大國,種業(yè)是國家戰(zhàn)略性、基礎(chǔ)性的核心產(chǎn)業(yè),是促進(jìn)農(nóng)業(yè)長期穩(wěn)定發(fā)展、保障國家糧食安全的根本。玉米是我國重要的糧食和飼料作物之一,2012年已經(jīng)成為我國產(chǎn)量第一的糧食作物[1]。玉米產(chǎn)量提高主要依靠新品種的選育與推廣,而優(yōu)良自交系的選育是玉米利用雜種優(yōu)勢的前提,種質(zhì)資源是玉米育種工作者進(jìn)行玉米新品種選育的基礎(chǔ)[2]。20世紀(jì)80年代后期,隨著生活水平的提高,對農(nóng)作物品質(zhì)的要求越來越高,加強(qiáng)品質(zhì)育種成為當(dāng)前農(nóng)作物研究的主要內(nèi)容[3]。目前的玉米育種多采用系譜法來選擇優(yōu)良世代和雜交優(yōu)勢強(qiáng)的父母本,耗時(shí)長,且極易受到環(huán)境條件的影響。由于傳統(tǒng)育種方法選擇不定向,導(dǎo)致收集種子等的工程量浩大,浪費(fèi)人力物力資源[4]。因此,發(fā)展一種能夠大批量、實(shí)時(shí)、快速且能在早期鑒別出玉米自交系親緣關(guān)系用于玉米育種的分析方法非常必要。

光譜分析技術(shù)是一種高效、快速的現(xiàn)代分析技術(shù),它綜合運(yùn)用了計(jì)算機(jī)、光譜學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)等多個(gè)學(xué)科的最新研究成果,并以其非破壞性、無需樣品預(yù)處理、速度快、成本低等特點(diǎn)在農(nóng)業(yè)中被廣泛應(yīng)用[5-10]。美國Du Pont公司利用近紅外光譜技術(shù)進(jìn)行油用玉米品種的篩選,Dyer指出:“利用近紅外單粒分析,可以在育種周期中節(jié)省一個(gè)世代”[11]。2T2D(Two-trace two-dimensional)相關(guān)譜是在廣義二維相關(guān)譜基礎(chǔ)上發(fā)展起來的兩譜相關(guān)譜技術(shù),該技術(shù)將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理相結(jié)合,可有效提取復(fù)雜生物體系中微弱變化的特征信息,特別適合相似樣品的判別分析[12-18]。目前,未見基于2T2D相關(guān)譜技術(shù)來分析玉米自交系親緣關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。本研究借助近紅外、中紅外光譜儀,通過對不同玉米自交系的近/中紅外光譜、同譜2T2D近/中紅外相關(guān)譜和異譜2T2D近-中紅外相關(guān)譜進(jìn)行分析,以期為玉米自交系親緣關(guān)系的鑒別及分類提供一種新的視角。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用材料為本實(shí)驗(yàn)室保存的3個(gè)玉米自交系,分別命名為樣品1、樣品2、樣品3。取等量玉米樣品粉碎、過80目篩,裝袋,備測。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

美國PerkinElmer公司的Spectrum GX傅里葉變換近紅外光譜儀和中紅外光譜儀。近紅外采用積分球附件,掃描范圍4 000～9 000 cm-1,分辨率4 cm-1;中紅外采用衰減全反射(ATR)附件,掃描范圍650～3 000 cm-1,分辨率4 cm-1。采用高速萬能粉碎機(jī)(FW100)對樣品進(jìn)行粉碎。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

近紅外光譜掃描:首先將準(zhǔn)備好的待測樣品盛于直徑10 mm的指形樣品杯中,并壓實(shí),接著將樣品杯放入旋轉(zhuǎn)樣品臺進(jìn)行近紅外漫反射光譜測試。

中紅外光譜掃描:將準(zhǔn)備好的待測樣品盛于ATR晶體ZnSe表面,并通過壓板壓實(shí),使其緊貼在晶體表面,然后進(jìn)行中紅外衰減全反射光譜測試。

1.4 分析方法

所采集的3個(gè)玉米自交系的近紅外光譜和中紅外光譜,根據(jù)研究目標(biāo)選擇樣品光譜,形成近紅外光譜矩陣A和中紅外光譜矩陣B:

其中,Si(v)和Sj(v)分別是第i和j個(gè)樣品的近紅外或中紅外光譜,i=1,2,3;j=1,2,3;i≠j。

根據(jù)Noda[12]理論,第i和j個(gè)樣品在波數(shù)為v1和v2處異譜2T2D近-中紅外相關(guān)譜Ф(v1,v2)可通過公式計(jì)算獲得:

式中,k為相關(guān)分析的光譜數(shù),本研究中k=2,T表示轉(zhuǎn)置。

如果B=A,根據(jù)公式可得第i和j個(gè)樣品的同譜2T2D近紅外相關(guān)譜;若A=B,即可得第i和j個(gè)樣品的同譜2T2D中紅外相關(guān)譜。

2T2D相關(guān)譜技術(shù)可以提供兩個(gè)不同樣本(一個(gè)參考樣本,另一個(gè)為待分析樣本)來源吸收峰之間豐富的、有價(jià)值的相關(guān)信息,對待分析樣本與參考樣本之間的差異信息具有高的靈敏度[12-14]。本研究主要利用該技術(shù)來提取并分析兩個(gè)不同玉米自交系之間的差異光譜信息,實(shí)現(xiàn)其親緣關(guān)系的鑒別。

采用Origin2018軟件完成一維光譜圖繪制,課題組編寫的二維相關(guān)MATLAB代碼實(shí)現(xiàn)2T2D相關(guān)譜和自相關(guān)譜的計(jì)算及圖譜繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同玉米自交系的近紅外光譜

圖1 3種玉米自交系的近紅外漫反射光譜Fig.1 Near-infrared diffuse reflectance spectra of three maize inbred lines

2.2 不同玉米自交系的中紅外光譜

圖2為3種玉米自交系在650～3 000 cm-1范圍的中紅外衰減全反射光譜。由圖2可知,在848 cm-1、1 008 cm-1、1 144 cm-1、1 344 cm-1、1 644 cm-1、1 744 cm-1、2 852 cm-1和2 924 cm-1處均存在特征峰,特征峰對應(yīng)的主要化學(xué)成分是烴類化合物、酚類、醇類、醚類、芳香族類和脂肪酸等。與近紅外光譜相比,3種玉米自交系在中紅外波段吸光度存在較大差異。

圖2 3種玉米自交系的中紅外衰減全反射光譜Fig.2 Mid-infrared attenuated total reflectance spectra of three maize inbred lines

2.3 不同玉米自交系間2T2D近紅外相關(guān)譜

相對于常規(guī)的一維光譜,2T2D相關(guān)譜技術(shù)具有高的光譜分辨率,可提供研究體系隨外擾變化的光譜信息。本實(shí)驗(yàn)以不同玉米自交系為外擾,對其進(jìn)行2T2D相關(guān)譜計(jì)算,根據(jù)相關(guān)峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)兩個(gè)玉米自交系親緣關(guān)系的判別。兩個(gè)樣品越相似,其相關(guān)強(qiáng)度越小,如果兩個(gè)樣品完全相同,理論上其在任何波數(shù)處相關(guān)強(qiáng)度應(yīng)為0;反之,兩個(gè)樣品差異性越大,其相關(guān)強(qiáng)度越大。

圖3～圖5分別是3個(gè)樣品之間的2T2D近紅外相關(guān)譜和對應(yīng)的自相關(guān)譜。樣品1與樣品2相關(guān)強(qiáng)度的范圍為0～4.2×10-4,樣品1與樣品3相關(guān)強(qiáng)度范圍為-2.0×10-5～1.8×10-5,樣品2與樣品3相關(guān)強(qiáng)度范圍為0～5.5×10-4。根據(jù)相關(guān)強(qiáng)度可推斷,樣品1與樣品3較相似,親緣關(guān)系較近;樣品1與樣品2、樣品3與樣品2存在差異,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 樣品1與樣品2的2T2D近紅外相關(guān)譜(A)和自相關(guān)譜(B)Fig.3 2T2D near infrared (NIR) correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 2

圖4 樣品1與樣品3的2T2D近紅外相關(guān)譜(A)和自相關(guān)譜(B)Fig.4 2T2D NIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 3

圖5 樣品2與樣品3的2T2D近紅外相關(guān)譜(A)和自相關(guān)譜(B)Fig.5 2T2D NIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 2 and sample 3

2.4 不同玉米自交系間2T2D中紅外相關(guān)譜

圖6～圖8分別是3個(gè)樣品之間的2T2D中紅外相關(guān)譜和對應(yīng)的自相關(guān)譜?？捎^察到,樣品1與樣品2的相關(guān)強(qiáng)度比樣品1與樣品3的相關(guān)強(qiáng)度高1個(gè)數(shù)量級;樣品2與樣品3的相關(guān)強(qiáng)度比樣品2與樣品1的相關(guān)強(qiáng)度高1個(gè)數(shù)量級;樣品3與樣品2的相關(guān)強(qiáng)度比樣品3與樣品1的相關(guān)強(qiáng)度高2個(gè)數(shù)量級。從上述分析可推斷,樣品1和樣品3較相似,親緣關(guān)系較近;樣品2與樣品3存在較大差異,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖6 樣品1與樣品2的2T2D中紅外相關(guān)譜(A)和自相關(guān)譜(B)Fig.6 2T2D mid-infrared (MIR) correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 2

圖7 樣品1與樣品3的2T2D中紅外相關(guān)譜(A)和自相關(guān)譜(B)Fig.7 2T2D MIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 1 and sample 3

圖8 樣品2與樣品3的2T2D中紅外相關(guān)譜(A)和自相關(guān)譜(B)Fig.8 2T2D MIR correlation spectrum (A) and auto-correlation spectrum (B) of sample 2 and sample 3

2.5 不同玉米自交系間異譜2T2D近-中紅外相關(guān)譜

為進(jìn)一步說明方法的有效性,對3個(gè)玉米樣品進(jìn)行異譜2T2D近-中紅外相關(guān)分析(圖9～圖11),相關(guān)強(qiáng)度的關(guān)系為:樣品2與樣品3>樣品1與樣品2>樣品1與樣品3。證明樣品1與樣品3為相近的玉米自交系,親緣關(guān)系較近;樣品2和樣品3存在較大差異,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖9 樣品1與樣品2的異譜2T2D近-中紅外相關(guān)譜Fig.9 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 1 and sample 2

圖10 樣品1與樣品3的異譜2T2D近-中紅外相關(guān)譜Fig.10 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 1 and sample 3

圖11 樣品2與樣品3的異譜2T2D近-中紅外相關(guān)譜Fig.11 Hetero-spectral 2T2D NIR-MIR correlation spectrum of sample 2 and sample 3

3 結(jié)論與展望

本研究從近/中紅外光譜、同譜2T2D近/中紅外相關(guān)譜以及異譜2T2D近-中紅外相關(guān)譜入手,對玉米自交系親緣關(guān)系進(jìn)行初步分析。結(jié)果表明,近紅外光譜3個(gè)樣品光譜輪廓相似,僅在吸光度存在差異,而中紅外光譜與近紅外光譜相比,3個(gè)玉米自交系在中紅外波段吸光度存在較大差異。從樣品之間的同譜和異譜2T2D相關(guān)強(qiáng)度都可以推斷,玉米自交系樣品1與樣品3較相似,親緣關(guān)系較近;樣品2與樣品3存在較大差異,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。研究結(jié)果表明,基于2T2D相關(guān)譜技術(shù)來確定玉米自交系的親緣關(guān)系是可行的,該技術(shù)可能成為種子快速可靠的預(yù)篩選方法。

下一步繼續(xù)將2T2D相關(guān)譜技術(shù)與統(tǒng)計(jì)學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合,提取與種子參數(shù)相關(guān)的特征光譜信息,實(shí)現(xiàn)對其他玉米自交系的親緣關(guān)系進(jìn)一步鑒別,并補(bǔ)充和完善上述鑒別方法,以進(jìn)一步驗(yàn)證所建立方法的可行性和準(zhǔn)確性。同時(shí),該方法也可推廣應(yīng)用到其他作物上,如小麥、水稻、大豆等,為其他作物的育種提供參考方式。