唐澤南，楊伊然，張丹梅，吉玲存，朱晨，劉凌燕*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院,北京 100038;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟管理學(xué)院,北京 100083)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種普遍存在的婦科內(nèi)分泌紊亂[1-2],影響著5%～18%的婦女[3],此疾病好發(fā)于15～45歲之間?；加蠵COS的婦女更容易表現(xiàn)出抑郁、焦慮、負(fù)面身體形象、自尊心低下和心理性障礙,甚至?xí)黾右葝u素抵抗[1]和非酒精性脂肪肝的患病風(fēng)險[4]。PCOS表現(xiàn)出的內(nèi)分泌紊亂主要是由遺傳因素引起[5]。

另一方面,肺癌是一種常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率不斷增加[6-7],肺癌相關(guān)的病理機制與基因[8]和內(nèi)分泌系統(tǒng)[9]密切相關(guān)。在對肺癌病理類型進(jìn)一步劃分時,其中相較于鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌,女性更易患肺腺癌[10-11]。而值得注意的是,肺腺癌占據(jù)了所有肺癌診斷的50%,且呈上升趨勢[12-13]。而截至目前為止,PCOS與肺癌之間的關(guān)聯(lián)性鮮少有研究進(jìn)行觀測(僅有的一項研究[14]也只涉及了4例患有PCOS的患者與呼吸系統(tǒng)癌癥的風(fēng)險關(guān)系,并且未對腫瘤類型進(jìn)行劃分,從統(tǒng)計和臨床上皆難有重大說服力,無法闡明PCOS與肺癌之間的關(guān)聯(lián)),這可能與相差較大的兩個領(lǐng)域還未形成密切交叉研究有關(guān)。而與內(nèi)分泌和遺傳皆密切相關(guān)的兩種疾病之間是否可能存在聯(lián)系,是非常值得懷疑的。如要確定PCOS和肺癌之間的因果關(guān)系,需要通過被作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的隨機對照試驗,但開啟這些試驗需要大量的樣本,往往昂貴、費時,并且需要經(jīng)過層層倫理審查。

為了克服這些限制,我們采用了孟德爾隨機化(Mendelian randomization,MR)在遺傳水平上來研究PCOS與肺癌之間的關(guān)聯(lián)。MR是一種統(tǒng)計方法,利用與暴露強相關(guān)的基因變異作為工具變量(IV),建立起暴露與結(jié)局之間的因果關(guān)系。因此,MR分析不易受到潛在的環(huán)境或社會混雜因素和反向因果關(guān)系的影響。目前的證據(jù)表明,基因變異在PCOS中起著一定作用[15],凸顯了MR評估PCOS與肺癌之間因果關(guān)系的潛力。先前的MR研究表明,基因預(yù)測的PCOS與卵巢癌風(fēng)險降低[16]、乳腺癌風(fēng)險增加[17]存在關(guān)聯(lián)性,但與子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險無關(guān)聯(lián)[18]。通過MR研究還尋找到了一些PCOS相關(guān)代謝產(chǎn)物[19]。因此,我們希望利用最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)數(shù)據(jù),采用兩樣本MR方法,在遺傳水平上探究PCOS與肺癌之間的關(guān)聯(lián)性。

資料與方法

一、數(shù)據(jù)來源

從IEU GWAS數(shù)據(jù)庫(https://gwas.mrcieu. ac.uk/datasets/finn-b-E4_POCS/)中提取與PCOS相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)。利用GWAS總結(jié)結(jié)果,我們進(jìn)行了質(zhì)控,選擇符合條件的SNP。我們選擇了具有顯著的全基因組關(guān)聯(lián)(P<5×10-8),并將遺傳變量的連鎖不平衡參數(shù)設(shè)置r2閾值為0.001,遺傳窗口距離設(shè)置為10 000千堿基(kb),以避免SNP間的連鎖失衡。由于已發(fā)表的GWAS研究中只有一個具有全基因組顯著性的PCOS相關(guān)SNP可用,我們將更寬松的P值閾值設(shè)定為P<5×10-7,篩選出的SNP作為PCOS的工具變量。

從英國生物庫(UK Biobank)獲取肺癌的GWAS數(shù)據(jù)集,包括2 671例肺癌患者和372 016例歐洲血統(tǒng)的健康對照;從IEU GWAS數(shù)據(jù)庫中,選擇小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞肺癌和肺腺癌的GWAS數(shù)據(jù)集(表1)。為了防止種群分層偏倚,我們只選取包括歐洲血統(tǒng)個體的SNP和相應(yīng)的總結(jié)統(tǒng)計數(shù)據(jù),用于暴露和結(jié)局。

表1 肺癌遺傳數(shù)據(jù)的詳細(xì)信息

二、統(tǒng)計分析

MR分析使用“TwoSampleMR”軟件包版本0.5.6進(jìn)行。

為了確保對MR分析的可靠解釋,該研究方法遵循3個原理假設(shè):(1) 工具變量(IVs)與PCOS之間存在強相關(guān)性;(2) IVs對肺癌的影響僅通過它們對PCOS的影響實現(xiàn);(3) IVs與PCOS-肺癌關(guān)系中的任何混雜因素相互獨立。圖1對這些假設(shè)進(jìn)行了說明。

圖1 兩樣本MR分析示意圖

為了測試PCOS對肺癌風(fēng)險的潛在因果效應(yīng),我們使用兩樣本MR方法進(jìn)行了MR分析,具體使用了逆方差加權(quán)(inverse variance weighted,IVW)、MR Egger和加權(quán)中位數(shù)(weighted median,WM)方法。由于兩樣本MR分析的暴露和結(jié)果來自不同的樣本,可能存在種群異質(zhì)性,本研究中使用Cochran’s Q統(tǒng)計量進(jìn)行評估[24]。當(dāng)工具變量對結(jié)果產(chǎn)生影響時,即使暴露因素為0,也會出現(xiàn)水平的多態(tài)性,這表明存在混雜因素[25]。另外,本研究使用MR Egger截距檢驗來評估多態(tài)性[26]。

結(jié) 果

一、工具變量的確定

根據(jù)前文的篩選條件,我們從IEU GWAS數(shù)據(jù)庫中最終得到5個獨立的、不存在連鎖不平衡的SNP用于PCOS與肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞肺癌和肺腺癌)的MR分析。表2顯示了這5個與PCOS具有顯著相關(guān)性的SNP的SNP ID編號、效應(yīng)等位基因、其他等位基因、EAF值、β值、標(biāo)準(zhǔn)誤(S.E.)。

表2 最終確定的用于MR分析的SNP信息

二、兩樣本MR結(jié)果

圖2顯示了PCOS對肺癌的估計因果效應(yīng)。我們沒有觀察到遺傳預(yù)測的PCOS與歐洲血統(tǒng)肺癌風(fēng)險之間的顯著關(guān)聯(lián)[IVW:OR=1.000,95%CI(0.999,1.000),P=0.790;MR Egger:OR=0.999,95%CI(0.999,1.001),P=0.852;WM:OR=1.000,95%CI(0.999,1.001),P=0.927]。

然而,在組織分類的亞組分析中,我們發(fā)現(xiàn)在遺傳水平上PCOS與肺腺癌之間存在顯著的關(guān)聯(lián)性[IVW:OR=1.232,95%CI(1.049,1.447),P=0.011];MR Egger:OR=1.283,95%CI(0.983,1.674),P=0.164;WM:OR=1.275,95%CI(1.054,1.542),P=0.012]。PCOS與鱗狀細(xì)胞癌[IVW:OR=0.963,95%CI(0.695,1.334),P=0.821;MR Egger:OR=0.737,95%CI(0.492,1.104),P=0.235;WM:OR=0.894,95%CI(0.685,1.168),P=0.404]和小細(xì)胞肺癌[IVW:OR=0.858,95%CI(0.622,1.183),P=0.352;MR Egger:OR=0.915,95%CI(0.530,1.582),P=0.772;WM:OR=1.062,95%CI(0.752,1.500),P=0.733)之間沒有顯著的因果關(guān)系(圖2)。

三、敏感性分析

在PCOS與肺腺癌的敏感性分析中,發(fā)現(xiàn)樣本中沒有明顯的異質(zhì)性和水平的多效性。在Cochran’s Q檢驗中顯示沒有異質(zhì)性(Q=4.652,P=0.325)(表3);在MR Egger回歸中顯示沒有水平的多效性(intercept=-0.038,S.E.=0.093,P=0.710)(表4)。

表3 肺腺癌中PCOS遺傳變量的異質(zhì)性檢驗

表4 PCOS遺傳變量在肺腺癌GWAS數(shù)據(jù)集中的多效性檢驗

圖3是一個散點圖,顯示了PCOS對肺腺癌的因果效應(yīng)的個體估計值?？梢杂^察到,SNP對PCOS的影響越強,對肺腺癌的影響也越強,表明在遺傳水平上PCOS與肺腺癌之間存在正向的關(guān)聯(lián)性。

圖4是與肺腺癌風(fēng)險相關(guān)的5個PCOS SNP的森林圖。從森林圖中我們可以更直觀地觀察到每一個SNP經(jīng)過IVW計算后的β值,這些都說明我們的研究結(jié)果高度可信。

圖4 PCOS遺傳變量與肺腺癌風(fēng)險相關(guān)的森林圖

討 論

本研究使用MR預(yù)測了PCOS與肺癌之間的遺傳關(guān)聯(lián)。我們的研究結(jié)果表明,在歐洲人群中,PCOS與肺腺癌存在遺傳水平的關(guān)聯(lián)性。然而,我們沒有發(fā)現(xiàn)PCOS與鱗狀細(xì)胞癌或小細(xì)胞肺癌之間存在顯著關(guān)聯(lián)。

在本研究之前,對于PCOS與肺癌之間的因果關(guān)系,僅有少數(shù)流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)行了研究。一項大型基于人群的隊列研究報告了PCOS患者呼吸系統(tǒng)癌癥風(fēng)險降低的結(jié)果[OR=0.66,95%CI(0.25,1.75)[14]。然而,該研究僅包括了4名PCOS患者,并未區(qū)分不同的腫瘤類型。本研究從MR這個角度通過遺傳變異進(jìn)行關(guān)聯(lián)性探究后發(fā)現(xiàn),雖然PCOS與肺癌總體無關(guān)聯(lián)性,但是對肺癌進(jìn)行病理分型后發(fā)現(xiàn)PCOS與肺腺癌存在遺傳水平的關(guān)聯(lián)性。對肺癌進(jìn)行病理分型研究是貼近臨床實際的,這也正是本研究的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn),為未來的觀察性研究提供了一個可能的方向,但后續(xù)仍需大規(guī)模觀察性研究來進(jìn)一步探究PCOS與肺癌,尤其是與肺腺癌的關(guān)系。正因為此研究以MR方法首次發(fā)現(xiàn)PCOS與肺腺癌之間的關(guān)聯(lián)性,尚需要更多的觀測性研究予以進(jìn)一步驗證二者的因果關(guān)系,我們在此文中均采用準(zhǔn)確且保守的“遺傳關(guān)聯(lián)性”來描述PCOS與肺腺癌之間的關(guān)系。

本研究對臨床工作的指導(dǎo)也具有一定的意義。由于肺癌患者的預(yù)后與臨床分期密切相關(guān),及早識別并且發(fā)現(xiàn)肺癌對于提高患者生存質(zhì)量具有重要影響。我們通過MR方法,發(fā)現(xiàn)在遺傳水平上PCOS與肺腺癌存在相關(guān)性。這提示臨床醫(yī)生一方面應(yīng)及早對PCOS患者進(jìn)行肺腺癌的篩查,進(jìn)而提高PCOS患者繼患肺腺癌的生存率;另一方面更應(yīng)對PCOS患者進(jìn)行針對肺腺癌預(yù)防的健康宣教。因為我們的研究顯示遺傳水平上PCOS與肺腺癌存在相關(guān)性,這意味著PCOS患者可能相比于健康人更容易患有肺腺癌。采取早期預(yù)防措施,如戒煙、進(jìn)行適量的體育鍛煉、戒酒、遠(yuǎn)離空氣污染等[11],可以顯著降低肺腺癌的發(fā)病風(fēng)險,提升PCOS患者的生存質(zhì)量。

近期的研究表明,肺癌的病理類型與性別有關(guān),女性相較于鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞肺癌更易患肺腺癌[23]。然而,性激素對肺癌的影響在病例對照研究中結(jié)論并不一致,仍然是一個有爭議的話題。我們這里嘗試通過兩種疾病涉及的信號通路來解讀PCOS與肺癌之間的關(guān)系:PI3K/Akt/mTOR通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和代謝方面起著關(guān)鍵作用。mTOR通路的過度表達(dá)會損害卵丘細(xì)胞間的相互作用,導(dǎo)致胰島素抵抗,并直接影響卵泡生長,這是PCOS的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)[24]。關(guān)于肺癌的研究表明,多達(dá)90%的肺腺癌患者表現(xiàn)為mTOR的上調(diào)[25],而只有36%的小細(xì)胞肺癌患者在PI3K/Akt/mTOR通路中具有基因變異[26]。鱗狀細(xì)胞癌更常見PIK3CA的擴增,而mTOR的上調(diào)在肺腺癌中更為普遍[27-28]。因此,我們推測,肺腺癌患者中mTOR通路的上調(diào)很可能是PCOS與肺腺癌之間的正向遺傳相關(guān)性的原因。

我們的研究具有幾個優(yōu)點。首先,這是首次使用MR方法在遺傳水平上探究PCOS與肺癌之間的關(guān)系。隨機對照試驗被認(rèn)為是確定特定危險因素與結(jié)果之間因果關(guān)系的金標(biāo)準(zhǔn),但這些試驗往往昂貴、耗時,并且由于實際或倫理考慮有時不可行。相比之下,MR利用非實驗性數(shù)據(jù)中的遺傳變異來估計暴露和結(jié)局之間的因果關(guān)系,消除了混雜因素并排除了反向因果關(guān)系。其次,我們使用了不同的MR方法,包括IVW、MR Egger和WM方法,并進(jìn)行了敏感性分析以排除樣本中的異質(zhì)性和水平遺傳效應(yīng)。最后,我們使用散點圖和森林圖形象地展示了結(jié)果,有助于更好地解釋研究發(fā)現(xiàn)。

當(dāng)然,我們的MR研究仍存在一些局限,可能會影響PCOS與肺癌之間的關(guān)聯(lián)性推斷。首先,可供獲取的PCOS GWAS的樣本量有限,降低了MR中因果評估的統(tǒng)計效能。在我們使用已發(fā)表的GWAS研究中具有全基因組顯著性的SNP(P<5×10-8)構(gòu)建遺傳工具時,只有一個具有全基因組顯著性的PCOS相關(guān)SNP可用。因此,我們使用了更寬松的P值閾值(P<5×10-7)作為篩選與PCOS具有顯著相關(guān)性工具變量的標(biāo)準(zhǔn),這增加了MR可用的IVs數(shù)量,但可能引起較弱的IVs偏倚。其次,由于目前可獲取的PCOS GWAS數(shù)據(jù)并未包含PCOS亞型信息,所以我們無法遺傳預(yù)測不同PCOS亞型與肺癌風(fēng)險之間的關(guān)聯(lián)。因此,我們期望有更多可供獲取的PCOS GWAS 數(shù)據(jù),或者基于本文的發(fā)現(xiàn),有針對性地進(jìn)行大規(guī)模、精心設(shè)計的觀察性研究,來深入探究PCOS與肺癌之間的關(guān)聯(lián);同時,如果在PCOS GWAS數(shù)據(jù)建立中,納入PCOS亞型信息,不僅僅在評估PCOS與肺癌的遺傳關(guān)聯(lián)性上,甚至在衡量PCOS與其他內(nèi)分泌有關(guān)的腫瘤疾病上可能還會有更深入地發(fā)現(xiàn)。

綜上,我們的分析結(jié)果表明,在歐洲人群中,遺傳水平上PCOS與肺腺癌的風(fēng)險升高之間存在相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn)為未來的觀察性研究提供了一個可能的方向。