袁曉麗,江 莉,黃莉莉,胡 斌

心血管疾病是一類發(fā)病率高、病亡率高、并發(fā)癥多的嚴(yán)重疾病,由氧自由基過度合成引起的氧化應(yīng)激,與心肌缺血再灌注損傷、心肌病、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1-2]?；ㄇ嗨?3-葡萄糖苷也稱為矢車菊素-3-葡萄糖苷,是花青素的主要活性成分,具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能[3-4]。據(jù)報(bào)道,花青素可通過抑制活性氧-c-Jun氨基末端激酶-B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)通路,減輕心肌缺血損傷[5]。但花青素-3-葡萄糖苷在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的心肌損傷中是否有保護(hù)作用還不清楚。鑒于此,本研究探討花青素-3-葡萄糖苷干預(yù)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制,為該化合物的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

H9c2心肌細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫),花青素-3-葡萄糖苷(純度>98%,武漢前衍化學(xué)科技有限公司),益氣活血顆粒(弘美制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字Z20030092),噻唑藍(lán)(MTT)粉末、RIPA裂解液、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)盒、二氫乙錠(DHE)活性氧(ROS)熒光探針購自上海碧云天生物科技有限公司,Hoechst 33342熒光染料(美國MCE),V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國BD),β-actin鼠單克隆抗體、解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)、Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)及切割后半胱天冬酶3(Cleaved Caspase-3)兔多克隆抗體購自美國Cell Signaling,Trizol試劑(美國Ambion Life Technology),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒購自美國Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 造模條件及給藥濃度的篩選

取H9c2細(xì)胞接種于96孔板,于37 ℃的5%CO2增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,分別加入0、100、200、300、400、500、600、700 μmol/L的H2O2處理4、8、12 h建立心肌細(xì)胞損傷模型,并設(shè)置對(duì)照組(加入不含H2O2的培養(yǎng)基),加入MTT溶液100 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清后加入150 μL二甲基亞砜溶液,37 ℃震蕩10 min,490 nm處檢測(cè)吸光度值,計(jì)算細(xì)胞存活率(試驗(yàn)孔吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%)。取H9c2細(xì)胞接種于96孔板,過夜培養(yǎng)后,分別加入0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L花青素-3-葡萄糖苷,常規(guī)培養(yǎng)24 h,經(jīng)MTT法觀察細(xì)胞存活情況。

1.2.2 細(xì)胞分組

1)將H9c2細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+益氣活血顆粒組(1.5 mg/mL)及H2O2+花青素-3-葡萄糖苷組,觀察花青素-3-葡萄糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響。2)將H9c2細(xì)胞分為NC組、短發(fā)夾RNA(shRNA)-1組、shRNA-2組、shRNA-3組,以UCP2為靶標(biāo)的shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3及陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)入細(xì)胞,shRNA-1正向引物序列:5′-GGGATCCTGGAACGTAGTAAT-3′,反向引物序列:5′-ATTACTACGTTCCAGGATCCC-3′;shRNA-3正向引物序列:5′-TGGCCTCTACGACTCTGTAAA-3′,反向引物序列:5′-TTTACAGAGTCGTAGAGGCCA-3′;shRNA-3正向引物序列:5′-TGTGGTCAAGACGAGATATAT-3′,反向引物序列:5′-ATATATCTCGTCTTGACCACA-3′。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UCP2 mRNA水平,篩選最優(yōu)shRNA序列。3)將H9c2細(xì)胞分為對(duì)照組、H2O2組、H2O2+NC組、H2O2+shRNA-3組、H2O2+花青素-3-葡萄糖苷組、H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷組、H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷組,觀察UCP2在花青素-3-葡萄糖苷影響H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的作用。

1.2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用Hoechst 33342染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。1)Hoechst 33342染色法:讓玻片浸于細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),取各組細(xì)胞爬片,滴加少量Hoechst 33342染料覆蓋細(xì)胞,室溫染色5 min,吸棄Hoechst 33342染料,并用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次,封片后熒光顯微鏡下觀察,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染或破碎狀致密濃染。2)流式細(xì)胞術(shù):收集各組細(xì)胞,離心后加入PBS洗滌細(xì)胞,分別添加膜聯(lián)蛋白V(AnnexinⅤ)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染料、結(jié)合緩沖液,混勻培養(yǎng)15 min,再上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UCP2 mRNA水平

收集各組細(xì)胞,用Trizol試劑提取細(xì)胞中RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒對(duì)UCP2進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,共38個(gè)循環(huán)。UCP2正向引物序列:5′-GCACTGT- CGAAGCCTACAAGAC-3′,反向引物序列:5′-TGGCAT- TTCGGGCAACAT-3′。GAPDH正向引物序列:5′-TCAAG-AAGGTGGTGAAGCAG-3′,反向引物序列:5′-CCCTGT-TGCTGTAGCCAAAT-3′。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞,用RIPA裂解液提取總蛋白,測(cè)定蛋白濃度后,制備變性蛋白樣品,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜后,取出聚偏二氟乙烯(PVDF)膜浸于5%脫脂牛奶中,室溫封閉2 h,分別加入一抗β-actin鼠單克隆抗體(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1∶1 000)、UCP2(1∶1 000)兔多克隆抗體,4 ℃冷藏過夜,再分別加入二抗牛抗鼠(1∶5 000)、牛抗兔(1∶1 000)IgG-HRP,37 ℃搖床孵育45 min,加入ECL發(fā)光試劑顯影。應(yīng)用Image J1.8.0軟件檢測(cè)蛋白條灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、UCP2相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 DHE染色檢測(cè)ROS含量

將DHE ROS熒光探針以5 μmol/L濃度加入細(xì)胞中,37 ℃避光下培養(yǎng)30 min,熒光顯微鏡下觀察DHE熒光情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 花青素-3-葡萄糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞毒性及細(xì)胞形態(tài)的影響

隨著H2O2濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞存活率逐漸下降,呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性,綜合考慮,選擇對(duì)細(xì)胞損傷程度適中的H2O2600 μmol/L處理4 h建立心肌細(xì)胞損傷模型(見圖1)。隨著花青素-3-葡萄糖苷濃度升高,細(xì)胞存活率逐漸下降,呈現(xiàn)濃度依賴性(見圖2)。與0 μmol/L比較,6.25～100.00 μmol/L濃度花青素-3-葡萄糖苷處理后細(xì)胞存活率無明顯變化(P>0.05),而200 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。分別以6.25～100.00 μmol/L濃度花青素-3-葡萄糖苷處理心肌損傷細(xì)胞,50.00 μmol/L濃度的花青素-3-葡萄糖苷顯示出對(duì)600 μmol/L的H2O2處理4 h引起的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)的最高抑制作用,故選取無細(xì)胞毒性的50 μmol/L濃度為后續(xù)花青素-3-葡萄糖苷實(shí)驗(yàn)濃度。詳見圖3。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組中的細(xì)胞似乎具有完整的包裝膜、正常的紡錘形和圓形細(xì)胞核,而相比之下,在H2O2模型中,細(xì)胞表現(xiàn)出不完整的細(xì)胞膜、腫脹和退化的空泡?；ㄇ嗨?3-葡萄糖苷處理使細(xì)胞形態(tài)保持良好,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞核圓整。詳見圖4。

圖1 造模條件篩選

圖2 花青素-3-葡萄糖苷給藥濃度篩選

圖3 花青素-3-葡萄糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞毒性的影響

圖4 花青素-3-葡萄糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 花青素-3-葡萄糖苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,H2O2組細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2及Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯升高(P<0.05);與H2O2組比較,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷組和H2O2+益氣活血顆粒組細(xì)胞凋亡率、Bax/Bcl-2及Cleaved Caspase-3表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖5～圖7。

圖5 Hoechst 33342染色檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡

圖7 各組H9c2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.3 花青素-3-葡萄糖苷對(duì)H2O2刺激后H9c2細(xì)胞線粒體UCP2表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較,H2O2組細(xì)胞中UCP2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與H2O2組比較,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷組和H2O2+益氣活血顆粒組UCP2 mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。詳見圖8、圖9。

圖8 各組H9c2細(xì)胞中UCP2蛋白表達(dá)比較

圖9 各組H9c2細(xì)胞中UCP2 mRNA表達(dá)比較

2.4 花青素-3-葡萄糖苷通過調(diào)節(jié)UCP2表達(dá)減輕心肌細(xì)胞凋亡

與NC組比較,shRNA-2組和shRNA-3組UCP2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01),以shRNA-3組降低最為顯著,以此為實(shí)驗(yàn)序列。與對(duì)照組比較,H2O2組和H2O2+NC組UCP2、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與H2O2組比較,H2O2+shRNA-3組UCP2、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05);與H2O2+shRNA-3組比較,H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷組和H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷組UCP2、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。詳見圖10～圖12。

圖10 各組UCP2蛋白表達(dá)比較

圖11 蛋白免疫印跡法檢測(cè)UCP2及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖12 各組UCP2及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.5 花青素-3-葡萄糖苷通過調(diào)節(jié)UCP2表達(dá)降低ROS含量

與對(duì)照組比較,H2O2組和H2O2+NC組ROS含量明顯升高(P<0.05);與H2O2組比較,H2O2+shRNA-3組ROS含量明顯升高(P<0.05);與H2O2+shRNA-3組比較,H2O2+花青素-3-葡萄糖苷組、H2O2+NC+花青素-3-葡萄糖苷組和H2O2+shRNA-3+花青素-3-葡萄糖苷組ROS含量明顯降低(P<0.05)。詳見圖13、圖14。

圖13 DHE染色檢測(cè)ROS含量

圖14 各組細(xì)胞中ROS含量比較

3 討 論

H9c2心肌細(xì)胞分離自大鼠,不僅其形態(tài)特征與原代心肌細(xì)胞相似,而且還保留了大鼠心肌細(xì)胞功能特征,是理想的心血管疾病模型載體[6]。H2O2是一種重要的ROS,可誘導(dǎo)細(xì)胞系或原代細(xì)胞的凋亡,在不同的研究中有不同的使用劑量[7-8]。本研究觀察不同濃度和不同作用時(shí)間的H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞存活的影響,結(jié)果顯示,隨著H2O2濃度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞的存活率越低,表明H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞的毒性具有時(shí)間、濃度依賴性,故選擇對(duì)細(xì)胞損傷程度適中的600 μmol/L的H2O2處理4 h建立心肌細(xì)胞損傷模型。對(duì)花青素-3-葡萄糖苷給藥濃度的篩選結(jié)果顯示,6.25～100.00 μmol/L濃度花青素-3-葡萄糖苷處理后細(xì)胞存活率無明顯變化,而200 μmol/L濃度花青素-3-葡萄糖苷處理后細(xì)胞存活率明顯降低,為避免藥物本身對(duì)細(xì)胞造成的損傷,同時(shí)保證藥效,故選取無細(xì)胞毒性的50.00 μmol/L濃度為后續(xù)花青素-3-葡萄糖苷實(shí)驗(yàn)濃度。本研究結(jié)果顯示,H9c2心肌細(xì)胞暴露于H2O2后,細(xì)胞凋亡率升高,給藥后細(xì)胞凋亡率明顯降低,提示花青素-3-葡萄糖苷可抑制細(xì)胞凋亡,對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。Wu等[9]研究顯示,花青素-3-葡萄糖苷對(duì)紫外線誘導(dǎo)的原代人真皮成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、氧化損傷和凋亡有明顯的抑制作用。

Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子,根據(jù)功能可分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白,正常細(xì)胞中Bax以單體形式分布于細(xì)胞質(zhì),當(dāng)細(xì)胞凋亡信號(hào)激活時(shí),會(huì)改變線粒體膜電位和通透性,誘導(dǎo)凋亡活性物質(zhì)細(xì)胞色素C的釋放[10]。Bcl-2作為典型的抗凋亡蛋白,主要分布于線粒體外膜,可結(jié)合Bax形成異源二聚體,阻止Bax的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用,同時(shí),Bcl-2過表達(dá)還可介導(dǎo)氧化應(yīng)激而保護(hù)細(xì)胞[11]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者,可直接降解結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,在線粒體途徑的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[12]。Wei等[13]通過腎小管細(xì)胞HK-2的體外實(shí)驗(yàn)顯示,花青素-3-葡萄糖苷可抑制ROS生成、細(xì)胞凋亡、Cleaved Caspase-3、Bax/Bcl-2,并增強(qiáng)線粒體釋放細(xì)胞色素C的表達(dá),保護(hù)汞誘導(dǎo)的糖尿病腎損傷。本研究中,經(jīng)H2O2作用后細(xì)胞中Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表達(dá)上升,花青素-3-葡萄糖苷處理后可逆轉(zhuǎn)上述凋亡蛋白的表達(dá),提示花青素-3-葡萄糖苷抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡,可能與下調(diào)Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

解偶聯(lián)蛋白家族是線粒體內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可減少三磷酸腺苷(ATP)和ROS的產(chǎn)生,其中UCP2是研究最為廣泛的成員[14]。細(xì)胞中ROS大多來自于線粒體電子傳遞鏈,其生成與質(zhì)子跨膜勢(shì)能密切相關(guān)[15]。UCP2可通過參與質(zhì)子滲漏、降低質(zhì)子勢(shì)能,促進(jìn)氧消耗,減少呼吸鏈電子傳遞,從而減少ROS的產(chǎn)生,保護(hù)機(jī)體的過氧化損傷[16]。本研究發(fā)現(xiàn),H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞中UCP2表達(dá)明顯降低,ROS含量明顯升高;花青素-3-葡萄糖苷可通過提高UCP2表達(dá),減少ROS,且這種作用可被靶向UCP2的shRNA所阻斷。故推測(cè)花青素-3-葡萄糖苷的保護(hù)作用可能部分依賴于UCP2來抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。

綜上所述,花青素-3-葡萄糖苷可能通過上調(diào)UCP2表達(dá),降低Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3表達(dá),清除ROS,從而發(fā)揮抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。