喬陽 梁曉 陳青 伍春玲 劉迎 劉小強(qiáng) 稅軍 姚曉文

關(guān)鍵詞：二斑葉螨；抗、感螨木薯品種；黃酮合成通路；基因表達(dá)

木薯（ManihotesculentaCrantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）作物，原產(chǎn)于亞馬遜南部盆地，目前廣泛種植于全球亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]，具有高產(chǎn)、高淀粉含量、耐貧耐旱等特點(diǎn)[2]，為世界上100多個國家近10億人口提供碳水化合物來源[3]。木薯還是重要的工業(yè)原料、能源作物、飼料作物和救荒作物，在淀粉糖合成、醫(yī)藥、化工、造紙和食品等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[4-5]。

二斑葉螨（TetranychusurticaeKoch）是世界危險性害螨，是危害木薯最嚴(yán)重的四大有害生物之一[6]，其嚴(yán)重為害會使木薯減產(chǎn)50%～70%，甚至絕收[7]。目前，化學(xué)殺螨劑依然是控制二斑葉螨最常用的方法，但該螨于木薯種植后6～8個月暴發(fā)成災(zāi)，而此時木薯地已封行，不僅導(dǎo)致藥劑的有效利用率降低，還將造成害螨抗藥水平上升，產(chǎn)品和產(chǎn)地環(huán)境安全風(fēng)險加劇等問題[8-9]。因此，尋求綠色、高效、環(huán)境友好的害蟲防治策略才能夠有效支撐木薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

抗蟲品種的選育與利用是實現(xiàn)害蟲綠色綜合防控的重要手段[10-11]，研究作物抗蟲機(jī)理能為抗蟲品種的選育提供重要的理論依據(jù)。研究表明，植物能產(chǎn)生多種次生代謝物來防御生物和非生物脅迫[12-13]，其中，黃酮類化合物在作物形成抗蟲性中發(fā)揮重要作用[14]，它可以抑制昆蟲的攝食、發(fā)育和產(chǎn)卵[15]，黃酮類化合物及其合成調(diào)控基因的抗蟲作用已見于玉米抗棉鈴蟲（HelicoverpaarmigeraHübner）、茶樹抗茶尺蠖（EctropisobliquaProut）、水稻抗褐飛虱（NilaparvatalugensStal）等相關(guān)研究[16-18]。然而迄今為止，尚未見黃酮合成通路基因在木薯抗二斑葉螨中的功能報道。因此，本研究擬分析比較二斑葉螨取食不同抗性水平木薯品種前后黃酮合成通路基因的表達(dá)量差異，以初步明確與木薯抗二斑葉螨相關(guān)的黃酮合成通路關(guān)鍵基因，為深入開展基于黃酮代謝通路的抗螨木薯新種質(zhì)的創(chuàng)制與分子設(shè)計育種提供重要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試二斑葉螨參考伍牧鋒等[19]的方法進(jìn)行二斑葉螨的室內(nèi)飼養(yǎng)。選擇發(fā)育歷期相同、大小一致的雌成螨進(jìn)行試驗。

1.1.2供試木薯遺傳穩(wěn)定的抗螨木薯品種C1115、緬甸（Myanmar）、SC9，感螨木薯品種SC205、面包（Bread）、BRA900[20]由中國熱農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質(zhì)資源圃提供。參考韓志玲等[21]的方法進(jìn)行木薯的室內(nèi)種植，待木薯生長約60d后，選擇長勢一致的健康木薯植株進(jìn)行害螨接種。

1.1.3候選黃酮合成通路基因根據(jù)KEGG網(wǎng)站（https：//www.kegg.jp/kegg/）中已發(fā)布的黃酮類代謝物合成通路，繪制木薯黃酮類代謝物合成通路示意圖（圖1），選取植物黃酮合成調(diào)控研究中最為廣泛的7個基因作為候選基因，分別為CHS（查爾酮合酶）、PGT1（根皮苷合酶）、C3'H（5-O-香豆?；?D-喹啉3'-單加氧酶）、FLS（黃酮醇合酶）、F3H（柚皮素3-雙加氧酶）、LAR（白花青素還原酶）、CYP93B_16（黃酮合酶II）。

1.2方法

1.2.1二斑葉螨接種與取樣分別選取室內(nèi)種植60d，長勢一致，健康的抗螨木薯品種C1115、緬甸（Myanmar）、SC9，感螨木薯品種SC205、面包（Bread）、BRA900進(jìn)行害螨接種。每株木薯分別選取中部的3張葉片，用實驗室自制的吸蟲器小心吸取發(fā)育一致的二斑葉螨雌成螨，接種于葉背面（50頭/片），并以羊毛脂涂抹在葉柄基部以防止二斑葉螨逃逸。采集未受螨害（0d）、螨害1、4d后的葉片用于RNA提取。不同木薯品種不同螨害時間處理均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2RNA提取及cDNA第一條鏈的合成參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，美國）說明書提取木薯葉片RNA，取去除gDNA后的RNA樣品1.0μg進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，合成方法參照RTEasyMixforqPCR試劑盒（TOLOBIO，中國）。

1.2.3實時熒光定量PCR分析根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)布的木薯黃酮類代謝物合成通路7個關(guān)鍵基因序列設(shè)計qPCR引物（表1）。cDNA樣品經(jīng)RNase-freeddH2O稀釋160倍后作為qPCR的模板，以木薯Meactin為內(nèi)參基因[7]。qPCR反應(yīng)體系的配制參照2×Q3SYBRqPCRMasterMix試劑盒（TOLOBIO，中國）。qPCR反應(yīng)條件為95℃30s；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)。使用LightCycler?96儀器（Roche，瑞士）默認(rèn)溶解曲線程序采集溶解曲線。根據(jù)LIVAK等[22]的2-ΔΔCt（ΔΔCt=ΔCt2-ΔCt1，ΔCt1為2個樣本內(nèi)參基因Ct值的差值，ΔCt2為2個樣本目的基因Ct值的差值）方法計算而得，每個處理均設(shè)置3個重復(fù)，目的基因在2個樣本間的相對表達(dá)量為3個重復(fù)的平均值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel和GradphadPrism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總整理，使用SPSSStatistics24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)間的多重比較，采用皮爾遜相關(guān)性分析（Personscorrelationanalysis）方法分析基因表達(dá)量和木薯品種螨害指數(shù)間的相關(guān)性，其中螨害指數(shù)用于表征木薯品種的抗螨水平，前期研究結(jié)果表明，抗螨木薯品種C1115、SC9和Myanmar的螨害指數(shù)分別為12.50、26.60和14.40，感螨木薯品種Bread、SC205和BRA900的螨害指數(shù)分別為95.40、93.60和95.70[20]。

2結(jié)果與分析

2.1二斑葉螨取食前后抗、感螨木薯品種葉組織中CHS基因表達(dá)差異分析

比較螨害前后同一木薯品種的CHS基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與螨害前相比，感螨木薯品種Bread、SC205和BAR900的CHS基因表達(dá)量呈先顯著降低再顯著升高的趨勢，而抗螨木薯品種C1115、SC9和Myanmar的CHS相對表達(dá)量呈先顯著升高再顯著降低的趨勢（圖2A）。

比較螨害前后抗、感螨品種間CHS的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，螨害4d后，抗螨木薯品種中CHS的表達(dá)量總體上高于感螨木薯品種，而螨害1d后，抗螨木薯品種中CHS的表達(dá)量均顯著高于感螨木薯品種（圖2B）。進(jìn)一步相關(guān)性分析表明（以螨害1d后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析），螨害后CHS基因的相對表達(dá)量與木薯品種抗螨性呈正相關(guān)（r=0.8684，P=0.012）。

2.2二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的PGT1基因表達(dá)差異分析

比較螨害前后同一木薯品種的PGT1基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與螨害前相比，感螨木薯品種Bread、SC205和BAR900的PGT1基因表達(dá)量呈先顯著降低再顯著升高的趨勢，而抗螨木薯品種C1115、SC9和Myanmar的PGT1相對表達(dá)量呈先升高再顯著降低的趨勢（圖3A）。

比較螨害前后抗、感螨品種間PGT1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，螨害前（0d），抗螨木薯品種中PGT1的表達(dá)量總體上高于感螨木薯品種，而螨害1d后，抗螨木薯品種中PGT1的表達(dá)量均顯著高于感螨木薯品種（圖3B），進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果表明（以螨害1d后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析），螨害后PGT1基因相對表達(dá)量與木薯品種抗螨性呈正相關(guān)（r=0.9891，P=0.0001）。

比較螨害前后抗、感螨品種間F3H的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，螨害前（0d），抗、感木薯品種間F3H基因表達(dá)量差異不顯著，但抗螨木薯品種C1115的F3H表達(dá)量顯著高于其他品種，螨害4d后，抗螨木薯品種中F3H的表達(dá)量總體上高于感螨木薯品種。而螨害1d后，抗螨木薯品種C1115、SC9和Myanmar的F3H表達(dá)量均顯著高于感螨木薯品種（圖4B）。進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果表明（以螨害1d后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析），螨害后F3H基因相對表達(dá)量與木薯品種抗螨性呈正相關(guān)（r=0.6438，P=0.084）。

2.3二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的F3H基因表達(dá)差異分析

比較螨害前后同一木薯品種的F3H基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與螨害前相比，感螨木薯品種Bread、SC205和BAR900的F3H基因表達(dá)量呈先顯著降低再升高的趨勢，而抗螨木薯品種SC9和Myanmar的F3H基因相對表達(dá)量呈先顯著升高再顯著降低的趨勢，C1115的F3H基因相對表達(dá)量則呈顯著降低的趨勢（圖4A）。

2.4二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的FLS基因表達(dá)差異分析

比較螨害前后同一木薯品種的FLS基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與螨害前相比，感螨木薯品種Bread、SC205和BAR900的FLS基因表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢，而抗螨木薯品種C1115、SC9和Myanmar的FLS相對表達(dá)量呈先顯著升高再降低的趨勢（圖5A）。

比較螨害前后抗、感螨品種間FLS的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，螨害4d后，抗螨木薯品種中FLS的表達(dá)量總體上高于感螨木薯品種，而螨害1d后，抗螨木薯品種的FLS表達(dá)量均顯著高于感螨木薯品種（圖5B）。進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果表明（以螨害1d后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析），螨害后FLS基因相對表達(dá)量與木薯品種抗螨性呈正相關(guān)（r=0.8073，P=0.026）。

2.5二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的LAR基因表達(dá)差異分析

比較螨害前后同一木薯品種的LAR基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與螨害前相比，感螨木薯品種Bread和SC205的LAR基因表達(dá)量呈先降低再升高的趨勢，BAR900的LAR基因相對表達(dá)量呈升高的趨勢?？跪臼砥贩NSC9和Myanmar的LAR基因相對表達(dá)量呈先顯著升高再降低的趨勢，而C1115的LAR基因相對表達(dá)量呈降低趨勢（圖6A）。

比較螨害前后抗、感螨品種間LAR的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，螨害1d后，抗螨木薯品種SC9和Myanmar的LAR基因相對表達(dá)量均顯著高于各感螨木薯品種，而C1115的LAR基因相對表達(dá)量與感螨木薯之間無顯著差異（圖6B）。進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果表明（以螨害1d后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析），螨害后LAR基因相對表達(dá)量與木薯品種抗螨性呈正相關(guān)（r=0.5722，P=0.118）。

2.6二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的C3'H基因表達(dá)差異分析

比較螨害前后同一木薯品種的C3'H基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與螨害前相比，感螨木薯品種Bread和BAR900的C3'H基因相對表達(dá)量呈先顯著降低再顯著升高的趨勢，SC205的C3H基因相對表達(dá)量呈升高趨勢，抗螨木薯品種SC9和Myanmar的C3'H基因相對表達(dá)量呈先顯著升高再顯著降低的趨勢，而C1115的C3'H基因相對表達(dá)量無顯著變化（圖7A）。

比較螨害前后抗、感螨品種間C3'H的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，螨害前（0d），抗螨木薯品種中C3'H的表達(dá)量總體高于感螨木薯品種，而螨害1d后，抗螨木薯品種中C3'H的表達(dá)量均高于感螨木薯品種（圖7B）。進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果表明（以螨害1d后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析），螨害后C3'H基因相對表達(dá)量與木薯品種抗螨性呈正相關(guān)（r=0.7704，P=0.037）。

2.7二斑葉螨取食前后抗、感木薯品種葉組織中的CYP93B_16基因表達(dá)差異分析

比較螨害前后同一木薯品種的CYP93B_16基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，與螨害前相比，感螨木薯品種Bread、SC205和BAR900的CYP93B_16基因表達(dá)量呈先顯著降低再顯著升高的趨勢，而抗螨木薯品種SC9和Myanmar的CYP93B_16相對表達(dá)量呈先升高再顯著降低的趨勢，C1115的CYP93B_16基因相對表達(dá)量呈顯著下降的趨勢（圖8A）。

比較螨害前后抗、感螨品種間CYP93B_16的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，螨害1d后，抗螨木薯品種SC9和Myanmar的CYP93B_16基因相對表達(dá)量均顯著高于各感螨木薯品種，而C1115的CYP93B_16基因相對表達(dá)量與感螨木薯之間無顯著差異（圖8B）。進(jìn)一步相關(guān)性分析結(jié)果表明（以螨害1d后數(shù)據(jù)進(jìn)行分析），螨害后CYP93B_16基因相對表達(dá)量與木薯品種抗螨性呈正相關(guān)（r=0.6250，P=0.092）。

3討論

黃酮類化合物廣泛存在于植物體內(nèi)，并且在抵御蟲害脅迫中發(fā)揮著重要作用[23]。體內(nèi)分析研究表明，植物中的黃酮類化合物，如兒茶素、山奈酚和蘆丁可以影響害蟲的取食偏好和產(chǎn)卵[24-26]。落葵中的芹菜素和牡荊素可以抑制斜紋夜蛾（SpodopteralituraFabricius）幼蟲的生長發(fā)育[27]。綠原酸、槲皮素和阿魏酸等提高了花生對棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera）和蚜蟲（AphiscraccivoraKoch）的抗性[28]。紫杉葉素和兒茶素在云杉防御樹皮甲蟲（Ipstypographus）中發(fā)揮重要作用[29]。槲皮素和蘆丁可以影響蚜蟲的口針刺吸植物的汁液[30]。通過對39個水稻品種對褐飛虱的抗性分析結(jié)果表明，黃酮類化合物含量的提高與水稻抗褐飛虱能力的增強(qiáng)有關(guān)[31]。體外分析結(jié)果表明，在人工飼料中摻入黃酮類化合物也會極大地影響昆蟲的生長和發(fā)育。如在較高濃度的槲皮素和綠原酸的飼喂處理下，美國白蛾（Hyphantriacunea）的死亡率分別達(dá)到了70.00%和67.50%[32]。將柚皮素和槲皮素添加到豌豆蚜（Acyrthosiphonpisum）的人工飼料中，顯著降低了蚜蟲的繁殖力，并顯著增加了其發(fā)育歷期和成蟲的死亡率[33]。

黃酮類化合物在植物體內(nèi)的積累及轉(zhuǎn)化受其合成基因的調(diào)控，因此，黃酮合成通路基因的表達(dá)與植物抗蟲性有關(guān)。黃酮合成通路基因F3H、C4H和F3'5'H在馬尾松被松茸毒蛾（DasychiraaxuthaCollenette）和松毛蟲（Dendrolimus）為害時快速表達(dá)，提高了馬尾松的抗蟲性[34]。擬南芥的花青素和黃酮醇的合成受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，在擬南芥中過表達(dá)MYB75導(dǎo)致花青素和黃酮醇水平增加，可以增強(qiáng)擬南芥對鱗翅目害蟲的抗性[15]。轉(zhuǎn)F3H基因水稻對褐飛虱（Nilaparvatalugens）和白背飛虱（SogatellafurciferaHorváth）的抗性顯著高于野生型水稻，遺傳分析發(fā)現(xiàn)F3H基因可以通過影響FLS和DFR的表達(dá)量，調(diào)控山奈酚、槲皮素和花青素的含量進(jìn)而影響水稻的抗蟲性[35]。前期研究發(fā)現(xiàn)，二斑葉螨為害后，抗螨木薯中黃酮合成基因MeLAR和MeANR的表達(dá)量，LAR和ANR酶活以及縮合單寧含量均顯著高于感螨木薯品種，進(jìn)一步在感螨野生型木薯中過表達(dá)MeLAR和MeANR基因，可以顯著提高木薯對二斑葉螨的抗性，從分子水平證明了這2個黃酮合成基因的抗螨功能[36]。然而，木薯中涉及黃酮合成的基因有多個，篩選并驗證具有調(diào)控黃酮類化合物含量的關(guān)鍵基因及其功能，能夠有效支撐抗螨木薯種質(zhì)分子精準(zhǔn)設(shè)計育種工作，而明確抗、感螨木薯品種中黃酮合成通路基因的表達(dá)差異，能夠為候選基因的篩選提供理論依據(jù)。

本研究初步揭示了較短的螨害時間內(nèi)，木薯黃酮類代謝物合成通路調(diào)控基因CHS、PGT1、F3H、FLS、LAR、C3'H和CYP93B_16在感螨木薯品種中，受螨害后黃酮合成基因的表達(dá)量總體呈先降低（1d）再升高（4d）至螨害前（0d）水平的趨勢，其螨害期間的基因表達(dá)水平較螨害前并未提高，而抗螨木薯品種中黃酮合成基因的表達(dá)量總體呈先顯著升高（1d）再降低（4d）的趨勢，但均顯著高于螨害前（0d）的水平，研究表明，抗螨木薯中基因誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的能力強(qiáng)于感螨木薯。進(jìn)一步比較螨害前后抗、感螨木薯品種黃酮合成通路基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，抗螨木薯品種顯著高于感螨木薯品種。害蟲為害后，抗蟲品種中黃酮合成通路基因的防御響應(yīng)速度和表達(dá)量均顯著高于感蟲作物品種的現(xiàn)象在大豆與二斑葉螨互作[37]，高粱與玉米蚜（RhopalosiphummaidisFitch）互作[38]和水稻與飛虱互作[35]的研究中均有報道，這與本研究結(jié)果具有一致性。黃酮合成通路C3'H基因可調(diào)控綠原酸的合成，而外施綠原酸可以提高害蟲的死亡率[32]，CHS、PGT1和CYP93B_16基因分別調(diào)控根皮素、根皮苷和木犀草素的合成，因此，推測抗螨木薯品種受螨害后，可能通過誘導(dǎo)上述黃酮合成基因的上調(diào)，從而增加具有抗蟲功能的黃酮類代謝物含量以增強(qiáng)其抗螨水平。后續(xù)研究可通過干預(yù)上述基因的表達(dá)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因木薯株系，以期直接驗證上述基因及其調(diào)控的黃酮類物質(zhì)在木薯抗蟲性中的功能。

本研究一方面初步闡明了木薯中黃酮合成通路基因可能具有抗螨性功能，另一方面表明上述基因可能具有作為鑒定評價木薯抗螨性水平的分子指標(biāo)的潛力。但必須指出的是，本研究僅從黃酮類代謝物合成通路基因轉(zhuǎn)錄水平初步闡述了木薯對二斑葉螨的抗性機(jī)制，而二斑葉螨為害前后，不同抗螨木薯品種的黃酮類代謝物合成通路關(guān)鍵酶和類黃酮物質(zhì)含量差異尚未進(jìn)行測定，其轉(zhuǎn)錄水平、酶學(xué)水平和代謝水平是否具有一致性，以及其抗螨分子功能仍需后續(xù)研究進(jìn)一步證實。